岡山大学新技術説明会 6 動的受精卵培養システム の臨床応用展開 松浦宏治 1 原鐵晃 2 成瀬恵治 3 ( 岡山大学 異分野融合先端研究コア 1 県立広島病院 生殖医療科 2 岡山大学 医歯薬学総合研究科 3 )
不妊治療 体外受精 精子選別 子宮内に移植 着床 Ebner 2007 受精卵培養 挙児
体外受精 男性 女性 精子 精液 採卵 未受精卵 精子洗浄 選別 通常体外受精 顕微授精 培養液 未受精卵 精子 精子 未受精卵 キャピラリー
現状の受精卵培養 マイクロドロップ法 ミネラルオイル 前核形成期 胚盤胞 培養液 CO 2 インキュベータ内で 5 日間受精卵培養 体になる部分栄養になる部分 細胞数の多い大きな胚盤胞を一つだけ子宮に移植 ( 単一胚移植 )
現状の不妊治療手技の問題点 問題点 : 生体内のメカニカル環境が全く反映されていない系での精子選別および受精卵培養 ミネラルオイル 培養液 静置培養 動的培養 成熟度の高い胚盤胞を移植 着床率上昇 生理的なメカニカル環境を反映させた培養システム
開発した不妊治療用システム Tilting Embryo Culture System (TECS) 成瀬恵治 石田敬雄 松浦宏治 舟橋弘晃 原鐵晃 卵細胞揺動培養器およびその方法 特開 2009-027973 岡山大学 2009 年 2 月 12 日
Tilting Embryo Culture System (TECS) 受精卵を移動させながら培養 マイクロドロップ等の臨床現場での体外培養系が適用可能 障壁なく受け入れられる利点
マウス受精卵と培地の移動速度 Tilt Hold 受精卵移動 スタート 6 秒後 スタート 40 秒後 移動速度 ~25 µm/sec 移動速度 ~6 µm/sec 培地移動有無
TECS で負荷されるメカニカルストレス 底面近傍の流体中を回転する球体は 滑っている そのため 底面からの摩擦力は非常に小さい Goldman et al. 1967 シェアーストレス (Shear stress) 摩擦力 (Friction) 圧縮力 (Compression) TECS によるマウス受精卵へのシェアーストレス (SS) Tilt Hold 7.5x10-3 Dyne/cm 2 1.5x10-5 Dyne/cm 2 シェアーストレスは胚移動速度に比例
マウス胚培養成績 Blastocyst development (%) 70 60 50 40 30 20 10 0 二細胞期からの胚盤胞到達率 46 * 59 1 CTRL TECS Average of the cell number 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 *P < 0.05 胚盤胞細胞数 66 CTRL CTRL * 1 77 TECS TECS Matsuura et al. 2010 RBM Online マウスで胚盤胞細胞数が増加
成績向上理由 (1) 老廃物拡散の影響 (2) メカニカルストレスの効果? 0 0.0075 1.2 アポトーシス Dyne/cm 2 過剰な SS TECS 適度なSS シグナル伝達? 細胞数増加! MAPK kinase 8/9 活性化 apoptosis 促進
ヒト受精卵による試験から臨床試験へ 動物胚 ヒト受精卵 臨床試験? Blastocyst development (%) 60 50 40 30 20 10 0 2010 Matsuura et al. 三 ~ 八細胞期からの胚盤胞到達率 44 53 1 CTRL TECS Average of the cell number *P < 0.05 50 40 30 20 10 0 34 43 CTRL ヒト受精卵で胚盤胞細胞数が増加 胚盤胞細胞数 CTRL * 1 TECS TECS
ヒト受精卵を用いた臨床研究 体外受精からの胚盤胞到達率 50 20 最高品質胚盤胞の割合 % 40 30 20 10 0 31 CTRL * 44 TECS *P < 0.05 単一胚移植した 8 例のうち TECS 培養区の 7 例では着床し 4 人の男の子と 3 人の女の子が生まれた 15 10 5 0 4 CTRL * 14 TECS 2012 Hara et al.
今後検討すべき点 他にも 化学的妊娠率が有意に上昇したとの報告 ( 英ウィメンズクリニック @ 三宮 ) 臨床試験に関する問題点として 複数の機関で同じ条件でデータを蓄積することが大事 TECSは現在は メニコン ライフサイエンス事業部が発売 ( 本特許の活用 ) 北米 ブラジル EU など海外のクリニックでの使用が開始
人工卵管モデルとなるマイクロ流体システム マクロ マイクロ ナノ 1cm 100μm 0.1μm (=100 nm) 卵管 筋肉蠕動 卵管内流路 繊毛構造 繊毛表面物質 人工系 メカニカル駆動系 マイクロ流路 マイクロパターニング 表面被覆 Actuator system
空圧アクチュエータ人工卵管構成 Incubator Motor 37 CO 2 5% Controller PDMS microfluidic device with membrane (0.1 mm) Inlet reservoir Medium channel Inlet Medium channel unit Air channel Outlet Outlet reservoir Reservoir unit Bar=1 cm 駆動系 ( インキュベータの外 ) シリンジ移動速度で流路内培地の流速変化可能
シリンジと PDMS 薄膜移動模式図 空気圧 増加 減少
シリンジ速度と受精卵移動速度との関係 SLOW syringe velocity (0.5 mm/s) Rotation Fluid flow Contact FAST syringe velocity (2.5 mm/s) Translation Shear stress Fluid flow No contact シリンジを押す速度によって 負荷できる MS の種類と大きさが変化
受精卵培養結果 二細胞期からの胚盤胞到達率 胚盤胞細胞数 シリンジ移動速度 10 mm/s Static Dynamic Average of the cell number 62 74 76 83 Dynamic culture で成績上昇 Static Dynamic *P < 0.05
他の培養システムとの比較 Microfunnel Funnel reservoir Medium motion Research group Braille actuator Culture system Effect of DCS to Static culture Facilitation of diffusion Calculated SS (dyne/mm 2 ) Heo et al. 2010 Mouse embryonic development and culture environments using DCSs Other forces except SS Matsuura TECS YES YES 0.7 NO Matsuura MVC NO NO 1.2-50 Vibration Matsuura PAECS YES YES 9 NO Heo Microfunnel YES YES 0.7 NO
臨床面の意義 動物胚 ヒト余剰卵 臨床試験 受精卵および卵管因子双方による難治患者の場合 DCS 従来の方法 着床 受精卵発育の成績が向上 胚移植の機会 着床する可能性上昇 TECS により難治患者の治療成功率上昇
要約 卵管内で負荷される生理的なメカニカル環境 TECS: 受精卵発育促進 難治患者の治療成功率上昇
参考非特許文献 論文 Koji Matsuura, Nobuyoshi Hayashi, Yuka Kuroda, Chisato Takiue, Rei Hirata, Mami Takenami, Yoko Aoi, Nanako Yoshioka, Toshihiro Habara, Tetsunori Mukaida, Keiji Naruse, Improved Development of Mouse and Human Embryos by Tilting Embryo Culture System, Reproductive Biomedicine Online, 20(2010), 358-364 Takayuki Koike, Koji Matsuura, Keiji Naruse, Hiroaki Funahashi, In-vitro Culture with a Tilting Device in Chemically Defined Media during Meiotic Maturation and Early Development Improves the Quality of Blastocysts Derived from In-vitro Matured and Fertilized Porcine Oocytes, Journal of Reproduction and Development, 56(2010), 552-557 Tetsuaki Hara, Koji Matsuura, Takashi Kodama, Keiko Sato, Yuko Kikkawa, Tomomi Muneto, Junko Tanaka, Keiji Naruse, A tilting embryo culture system increases the number of highgrade human blastocysts with high-implantation competence, Reproductive Biomedicine Online, (2012), in press 総説 松浦宏治 成瀬恵治 Dynamic Culture System による受精卵発育促進とその機構解明 JOURNAL OF MAMMALIAN OVA RESEARCH 28(2011), 174-179 著書 Koji Matsuura, and Keiji Naruse, Use of Silicone Elastomer-Based Microfluidic Devices and Systems in Reproductive Technologies, Elastomers, (2012), Intech, 243-262
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