1 バイオプロピレン生産を目指した プロパノール発酵技術の開発 大阪府立大学大学院生命環境科学研究科 応用生命科学専攻 教授片岡道彦
背景 化石資源依存型社会から資源循環型社会へ 糖バイオマス バイオプロセス エタノールブタノール バイオ燃料 CO 2 燃焼エネルギー使用 エタノール等のバイオ燃料 燃焼により すぐに CO 2 が排出される 2
背景 化石資源依存型社会から資源循環型社会へ 糖バイオマス バイオプロセス 乳酸 ケミカルプロセス ポリ乳酸 バイオポリマー CO 2 燃焼エネルギー使用 リサイクルリユース CO 2 固定 ポリ乳酸等のバイオポリマー 長期間の CO 2 固定が可能となる 3
バイオプロパノール発酵生産の目的 化石資源依存型社会から資源循環型社会へ 約 2 kg-co 2 /kg バイオプロピレン 糖バイオマス バイオプロセス プロパノール ケミカルプロセス プロピレンポリプロピレン 化石資源 年間生産量 50Mt-PP 約 5 kg-co 2 /kg ナフサ分解法 CO 2 燃焼エネルギー使用 リサイクルリユース CO 2 固定 すでにポリマーとして普及しているポリプロピレンの生産 バイオマスからのプロパノール生産プロセスの開発 4
既存の組換え E. coli を用いたプロパノール生産系 Glucose 2 x 2 x Pyruvate Acetyl-CoA CO 2 ABE 発酵菌のイソプロパノール生合成系を E. coli に移植 GAP Glycolysis DHAP Acetoacetyl-CoA Acetate Acetyl-CoA 2 x Pyruvate Acetoacetate Propanol CO 2 CO 2 Max 1.0 mol/mol glucose Acetone Isopropanol Hanai, T. et al., Appl. Environ. Microbiol., 73:7814-8 (2007) Jojima, T. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 77:1219-24 (2008) Shen, CR. et al., Metab. Eng., 10:312-20 (2008) Atsumi, S. et al., Appl. Environ. Microbiol., 74:7802-8 (2008) 5
6 従来技術とその問題点 ABE 発酵菌のイソプロパノール生合成経路を移植した組換え大腸菌を用いる方法があるが 生合成経路中にCO 2 放出反応があり 大腸菌の生育等に必要なエネルギー等を差し引くと グルコースからの対糖収率が最大でも0.6 0.7 モル / モル程度にとどまると考えられる
新規 1- プロパノール発酵生産経路の概略 Glucose Glucose Glycolysis Glycolysis GAP DHAP GAP DHAP Pi MG To TCA cycle Reducing power ATP Max 2.0 mol/mol glucose HA LA 1 Glucose + 0.375 O 2 1.25 +1 H 2 O + 2.25 CO 2 + 1.75 ATP Max 1.25 mol/mol glucose 1,2PD CoB 12 H 2 O PA CO 2 放出のない新たなプロパノール生合成系を設計 7
8 新技術の特徴 従来技術との比較 すでに報告のあるイソプロパノール発酵技術とは異なり CO 2 放出を伴わないプロパノール生合成経路を設計 対糖収率において 従来技術より1.5 2 倍の向上が期待できる バイオマス由来のポリプロピレンのCO 2 排出量は 化石資源由来のものの半分以下
新規 1- プロパノール発酵生産経路の概略 Glucose Glycolysis Glucose Glycolysis GAP DHAP GAP DHAP Pi MG To TCA cycle Reducing power ATP HA LA 1 Glucose + 0.375 O 2 1.25 +1 H 2 O + 2.25 CO 2 + 1.75 ATP Max 1.25 mol/mol glucose 1,2PD CoB 12 H 2 O PA CO 2 放出のない新たなプロパノール生合成系を設計 9
グルコースから 1,2-PD を生産する菌株の育種 Glucose Sporobolomyces salmonicolor 由来 Aldehyde reductase II (arii) Escherichia coli 由来 Glycerol dehydrogenase (glda) (S)-LA (S)-1,2-PD DHAP MG HA Escherichia coli 由来 Methylglyoxal synthase (mgsa) (R)-LA (R)-1,2-PD 10
Concentration (mm) グルコースから 1,2-PD を生産する菌株の育種 250 P tac 200 Lactate arii 150 pkkarmege (5039 bp) P tac mgsa P tac 100 Acetate glda 50 EtOH Formate Succinate 1,2-PD 100 mm Glucose, 48 hr Consumed glucose is 100 mm 0 Vector Aeration Produced 1,2-PD (mm) pkk 223-3 Aerobic pkk ArMeGe pkk 223-3 pkk ArMeGe Microaerobic N.D. 1.3 N.D. 20.6 11
グルコースから 1,2-PD を生産する菌株の育種 ( まとめ ) Glucose Sporobolomyces salmonicolor 由来 Aldehyde reductase II (arii) DHAP MG HA 1,2-PD Escherichia coli 由来 Methylglyoxal synthase (mgsa) Escherichia coli 由来 Glycerol dehydrogenase (glda) Glucose から 1,2-Propanediol を発酵生産する菌の育種を目的として 想定経路を構築し 各反応を触媒する酵素遺伝子のスクリーニングによる選抜を行った これら酵素遺伝子を導入した組み換え E. coli を Glucose 含有培地で微好気的に培養することにより 100 mm (= 18.0 g/l) の Glucose より 20.6 mm (= 1.57 g/l) の 1,2- Propanediol を培養液中に蓄積した 12
新規 1- プロパノール発酵生産経路の概略 Glucose Glycolysis Glucose Glycolysis GAP DHAP GAP DHAP Pi MG To TCA cycle Reducing power ATP HA LA 1 Glucose + 0.375 O 2 1.25 +1 H 2 O + 2.25 CO 2 + 1.75 ATP Max 1.25 mol/mol glucose 1,2PD CoB 12 H 2 O PA CO 2 放出のない新たなプロパノール生合成系を設計 13
1,2-PD を 1- プロパノールへ変換する菌の探索 Glycerol 3-Hydroxypropionaldehyde 1,3-Propanediol Glycerol dehydratase 1,3-Propanediol oxidoreductase 1,2-PD Propionaldehyde 14
!-Propanol, 1,2-PD (mm) Glucose, Glycerol (mg/ml) Concentration (mm) Conversion of 1,2-PD to 1-propanol using Shimwellia blattae ATCC33430 60 60 25 50 40 30 1,2-PD 48 1,2PD 20 20 36 15 10 0 Glc Gly Glc+Gly Culture conditions 24 Glucose Glycerol 10 M9 minimum medium containing 5 g/l Yeast extract 10 g/l CaCO 3 50 mm 1,2-PD 12 5 Sugar : 100 mm (= 18 g/l) Glucose and/or 200 mm ( 18 g/l) Glycerol 37ºC, 48 hr 0 0 0 20 40 60 80 100 Time (h) 15
1,2-PD を 1- プロパノールに変換する菌株の育種 dhak dhan dham dhal dhad dhar dhah dhat dhai dhab dhac dhaf dhag dhae Gene product Gene produ dhak Dihydroxyacetone dhag Glycerol kinase deh dhan Phosphoenolpyruvate-pro dhat 1,3-Propane dham Dihydroxyacetone dhai Adenosyl kinase tra dhal Hypothetical dhab Glycerol protein deh dhad Glycerol dehydrogenase dhac Glycerol dhar Glycerol metabolism dhae Glycerol ope deh dhah Adenosyl transferase dhaf Glycerol deh sm 1,2-PD PA DhaT CoB 12 Inactivation AdoCbl DhaBCE (apoenzyme) DhaBCE (inactive) PPP i DhaFG ATP ATP DhaHI DhaBCE (holoenzyme) ADP Ado-H Cbl(I) Cobalamin reductase(s) X-Cbl NAD(P) + Toraya, T., Cell. Mol. Life Sci., 57:106-27 (2000) 16
Concentration (mm) Concentration (mm) 1,2-PD を 1- プロパノールに変換する菌株の育種 60 50 1,2-PD 40 30 20 1,2-PD 10 PA 0 dhabce dhafg dhahi dhat OD 660 1.3 1.2 0.7 100 mm 50 mm 5 μg/ml 96 hr 1.0 Glucose 1,2-PD CoB 12 0.3 1.2 prsf_eb DhaBCEF pcdf_eb DhaITGH 100 mm Glucose, 70 mm 1,2-PD, 5 μg/ml CoB 12, 72 hr 17
, 1,2-PD (mm) Glucose (mm) 組換え E. coli を用いた 1- プロパノールの発酵生産 20 200 Plasmids CoB 12 Concentration (mm) Consumed glucose 1,2-PD 16 Glucose 160 pkkarmege 126.1 19.4 N.D. pkkarmege pcdf_ebdhaitgh prsf_ebdhabcef 120.6 17.2 N.D. 115.1 1.9 16.9 12 8 120 80 200 mm Glucose, 5 μg/ml CoB 12, 96 hr 4 1,2-PD 40 培養時間 144 h 消費グルコース 132.6 mm ( 23.9 g/l) 1-プロパノール生成 19.9 mm ( 1.2 g/l) 対グルコース変換率 0.15 mol/mol (0.05 g/g) 0 0 50 100 150 Time (h) 0 18
19 想定される用途 バイオマスからのプロピレン ポリプロピレン 生産 バイオマス由来の燃料添加剤の発酵生産 バイオマス由来の多目的溶媒の発酵生産
20 実用化に向けた課題 グルコースから1-プロパノールの生産を確認 しかし 1-プロパノールの収量 対糖収率が不十分 現在 1-プロパノール生合成経路の強化や副産物への変換経路の削除を検討中 1-プロパノールの発酵生産条件の最適化についても検討中
21 企業への期待 バイオマスからのプロピレン生産を目指したプロパノール発酵技術の共同開発 発酵生産技術の開発経験を持つ企業との共同研究を希望 本技術によるバイオマス由来のプロパノールのプロピレン製造以外への用途開発
22 本技術に関する知的財産権 発明の名称 :1- プロパノールの製造方法 出願番号 : 特願 2007-298136 出願人 発明者 : 協和発酵ケミカル他 : 片岡道彦 浦野信行 清水昌
23 産学連携の経歴 1991 年 -1999 年第一ファインケミカル社と共同研究 D- パントラクトンの酵素法による生産 (1999 年 ) 1995 年 -2000 年カネカ社と共同研究 キラルアルコールの酵素法的生産 (2000 年 ) 2007 年 -2011 年文科省 -JST ターゲットタンパクプログラムに採択 2012 年 - JST-ALCA プロジェクトに採択
24 お問い合わせ先 大阪府立大学産学官研究連携戦略室コーディネータ野村幸弘 TEL 072-254- 8263 FAX 072-254- 7475 e-mail nomura@iao.osakafu-u.ac.jp