( 平成 22 年 12 月 17 日ヒト ES 委員会説明資料 ) 幹細胞から臓器を作成する動物性集合胚作成の必要性について中内啓光東京大学医科学研究所幹細胞治療研究センター JST 戦略的創造研究推進事業 ERATO 型研究研究プロジェクト名 : 中内幹細胞制御プロジェクト 1

幹細胞研究の現状腎不全各種心臓疾患など臓器不全症に対する根本的な治療には臓器移植が必要しかし移植臓器は圧倒的に不足しているにもかかわらず試験管内で臓器を作出することは難しく現在の再生医療が目指しているのは幹細胞から誘導した細胞を用いた細胞治療である最近我々はラット ips 細胞を用いてマウス個体内でラットの膵臓を作ることに成功したこの原理がヒトとブタ等の大動物でもあてはまればブタの個体内でヒトの臓器を作成することが可能になり移植ドナーの供給源として医療に大きく貢献できるさらに最近免疫不全マウスに移植した ips 細胞由来の奇形腫からヒト造血幹細胞を誘導することに成功遺伝性血液疾患の根治療法につながる重要な成果臨床応用の可能性を検討するにあたっては家畜などより大きな動物で検証する必要があるマウスとラット以外の動物種 ( ヒトを含む ) の ES 細胞や ips 細胞はキメラ形成能を持たない ( 少し分化した ) 多能性幹細胞であることが明らかとなってきた

現在の再生医療が目指しているのは細胞治療多数の患者が臓器不全症等で移植を待っている分化細胞を用いた細胞療法 ( 糖尿病パーキンソン病脊髄損傷網膜色素変性症など ) in vitro で分化誘導受精卵体細胞の初期化受精多能性幹細胞 (ES 細胞 ips 細胞 ) 3

現在の再生医療が目指しているのは細胞治療多数の患者が臓器不全症等で移植を待っている分化細胞を用いた細胞療法 ( 糖尿病パーキンソン病脊髄損傷網膜色素変性症など ) in vitro で分化誘導受精卵体細胞の初期化受精多能性幹細胞 (ES 細胞 ips 細胞 ) 4

キメラ動物とは交配では精子と卵子が受精することによりそれぞれが持つ遺伝子が交ざりあうこれに対しキメラ動物とは ( ゲノムが異なる ) 細胞が混じりあった状態の個体を意味するキメラは部分キメラと全体キメラに区別できる部分キメラ : 輸血や骨髄移植臓器移植を受けた人二卵性双生児のペアの 8% が血液キメラであるし母親の血液中に子供の血液が長年にわたって存在する場合があることが知られているまた研究分野でもマウスラット羊ウシ等の動物にヒト血液幹細胞ヒト ES 細胞ヒト ips 細胞ヒトがん細胞ヒト神経幹細胞などを移植することは日常的に行われていてヒト神経細胞を持つマウスなども作成されているこれらは全て部分キメラである全体 ( 全身性 ) キメラ : 発生の極めて早期にゲノムが異なる胚細胞が混じると体全体に両方の細胞が入り混じった個体が生まれてくる異種間の胚を混ぜてキメラ個体作出まで至った例として羊とヤギのキメラ (Geep) が 1984 年に生まれているがラットマウス間で個体作出の成功例はない混合した時期に両方の細胞が多能性を持っていれば全体キメラが生まれる可能性があると考えられる 5

胚性幹 (ES) 細胞によるキメラマウスの作製受精後 3~4 日目の受精卵 (= = 胚盤胞 ) ES 細胞 ES 細胞を 10~15 個胚盤胞へ注入仮親の子宮に胚盤胞を移植キメラマウスの誕生胚盤胞注入注入された ES 細胞 ( 緑 ) 6

胚盤胞補完法を利用した臓器作出の原理膵臓を欠損する遺伝子改変マウス = Pdx1 KO マウス Pdx1KO マウス個体内でドナー ips 細胞由来臓器が再生されるのではないか? 胎児胚盤胞胚盤胞へ注入受精マウス多能性幹細胞 (ES 細胞 ips 細胞 ) 7

Pdx1 KO マウス内にほぼ全ての細胞が ips 由来の膵臓ができていた Pdx1 KO マウス + マウス ips 細胞 Pdx1 ヘテロマウス + マウス ips 細胞明視野 HE 膵島膵臓 EGFP EGFP DAPI 200μm 50μm 200μm 50μm 8

この原理を利用してヒトの臓器を再生するには? 異種動物を用いた胚盤胞補完を成功させることが必要臓器欠損動物患者由来の ips 細胞臓器欠損動物を作成する膵臓欠損ブタ由来胚盤胞へのヒト ips 細胞の移植ブタ個体内で作成した患者の臓器を移植ブタ個体内でのドナー ips 細胞由来臓器の再生異種の壁を越えた胚盤胞補完の成立

異種動物の体内で臓器を作ることは可能か? ips 細胞を用いてマウス - ラット間で動作原理を確認するマウスラット 10

材料と方法 : マウスラット異種間キメラ作製ラット胚盤胞 + マウス ips 細胞ラット同士の交配 (Wistar x Wistar ) EGFP-Tg マウス (B6 ) マウス ips 細胞胚盤胞注入偽妊娠ラット (Wistar) へ移植マウス胚盤胞 + ラット ips 細胞マウス同士の交配 (B6 x BDF1 ) 胚盤胞注入偽妊娠マウス (ICR) へ移植ラット (Wistar ) ラット ips 細胞 11

マウス -ラット異種間キメラは出生後成体まで発育可能であった明視野新生児期 EGFP 成体ラット胚盤胞 + マウス ips 細胞マウス胚盤胞 + ラット ips 細胞 12

キメラの作製効率とキメリズム A. 異種間キメラの作製効率 B. 胎児繊維芽細胞のキメリズム解析移植胚 ( 総移植数 = 100%) (%) 24 26 70 30 移植胚数 (%) 100 75 50 25 0 ホスト胚ラットマウスマウスラット非胎児非キメラキメラキメリズム (EGFP 陽性率 ) 100 75 50 25 0 ラットマウスマウスラットドナー細胞マウス ips 細胞ラット ips 細胞マウス ips 細胞ラット ips 細胞

異種間胚盤胞補完法によりマウス内にラットの臓器を作出できるか示す Pdx1 KO マウスラット ips 細胞受精卵膵臓欠損マウス内にラット ips 細胞由来の膵臓を作出 14

ラットの膵臓を持った Pdx1 KO マウスは成体まで発育できた A. ラットの膵臓を持った Pdx1 KO マウス (8 週目 ) B. マウス内に作出されたラット膵臓の形態明視野 EGFP Pdx1 KO マウス + ラット ips 細胞 Pdx1 ヘテロマウス + ラット ips 細胞 15

Pdx1 KO マウスに作出されたラットの膵臓は組織学的および機能的に正常な膵臓であった A. 膵臓の形態と EGFP 陽性細胞の分布 B. 糖負荷後の血糖値推移 HE (mg/dl) 600 STZ- 糖尿病モデル EGFP DAPI 200μm 400 200 0 Pdx1 KO マウス + ラット ips 細胞 Pdx1 ヘテロマウス + ラット ips 細胞 0 30 60 90 120 ( 分 ) 200μm 16

テラトーマ形成を利用した造血幹細胞の誘導法テラトーマ三胚葉系へ分化した組織を含む良性腫瘍造血系サイトカインやストローマ細胞を投与することでテラトーマ内に造血幹細胞を誘導できるのでは? 造血系サイトカインストローマ細胞 HSCs 浸透圧ポンプでサイトカインを持続投与誘導された造血幹細胞は骨髄にホーミングするのでは?

今後の課題 1) 大動物でも多能性幹細胞を使って臓器を作ることができるのか? ブタ等の大動物を使った動作原理の確認 2) この原理を応用してヒトの臓器を他の動物の個体内で作出するには動物性集合胚の作成が必須である動物性集合胚のヒトまたは動物の胎内への移植は現在のガイドラインでは不可 ( 英国では可能中国は規制無し ) ガイドラインの見直し胚盤胞ではなく胎仔に多能性幹細胞や前駆細胞を移植する 3) マウスやラットの ips 細胞と異なりヒトの ips 細胞はキメラ形成能が無いキメラ形成能を持つ本当の ips 細胞を樹立する必要があるそのためにはキメラ形成能を調べる手段が必要動物性集合胚の研究が必須となる ( 日本のガイドラインでは in vitro で原始線状ができるまで可能 ) 4) ヒトと家畜のキメラを作出する際にヒト細胞が脳や生殖細胞を持つ動物ができる可能性がある ( 現実には既にヒトの神経細胞を持つマウスは多数作られていて特に問題にはなっていない ) 胚盤胞ではなく胎仔に多能性幹細胞や前駆細胞を移植する神経系や生殖系に分化しないように加工した多能性幹細胞を用いる