資料2-1

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ぜんまいりぐら
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1 霊長類の多能性幹細胞を用いた動物性集合胚作製の可能性について資料 2-1 CIEA SINCE 1952 ( 財 ) 実験動物中央研究所慶應義塾大学先導研究センター佐々木えりか 1

2 なぜ霊長類の実験動物が必要なのか? 薬物代謝の相違サリドマイドによる催奇形性小型霊長類マーモセット病原体への感受性の相違 A 型肝炎 /EB/ 麻疹ウイルスなど (Poswillo et al., Nature 1972) (Gilbert, Dev Biol.) 発現遺伝子の相違霊長類一次視覚野特異的遺伝子 (occ1) カニクイザルマーモセットマウス Yamamori T., Progress in Neurobiology,

3 実験動物としてのマーモセットの開発発生工学的研究配偶子受精卵採取法体外受精顕微受精配偶子胚保存外来遺伝子導入 ES 細胞株樹立ヒト疾患モデル遺伝子改変モデルハンチントン筋ジス ALS 研究ツールの開発遺伝子発現ライブラリー CD シリーズモノクロ抗体ゲノム解析など再生医療研究 ES 細胞の分化誘導物理的モデル脊髄損傷脳血管障害心筋梗塞薬物投与モデルパーキンソン先端医療再生医療遺伝子治療医薬品開発 3 3

4 膵島移植に必要な細胞数マウス 1 マーモセット 10~20 カニクイザル 200~1,000 ヒト 2,000~10,000 移植に必要な膵島数の割合 ( マウス =1) マウスでは実験的に移植が成功しても中大動物では国立国際医療研究センター研究所再現性がない場合が多い 4 霜田雅之先生より拝借

5 ( 百万年前 ) 旧世界ザルヒト上科狭鼻類 ( 下目 ) ヒト科オランウータン科 : 真猿類 ( 亜目 ) テナガザル科 : チンパンジーゴリラオランウータンテナガザル霊長目新世界ザル広鼻類 ( 下目 ) オナガザル科 : マーモセット科 : オマキザル科 : カニクイザルコモンマーモセットピグミーマーモセットアカゲザルアカテタマリンニホンザルクチヒゲタマリン原猿類 ( 亜目 ) ワオキツネザルスローロリスクモザルヨザルリスザル 5

コモンマーモセット基本情報英名学名分類原産 common marmoset Callithrix jacchus 霊長目真猿亜目広鼻下目オマキザル科マーモセット亜科ブラジル北東部体重 250-500 g ( 成熟個体 ) 体長 14-22 cm ( 頭胴長 ) 身体特徴染色体数 2n = 46 耳の脇の白い房毛, 長い尾後肢第 1

6 コモンマーモセット基本情報英名学名分類原産 common marmoset Callithrix jacchus 霊長目真猿亜目広鼻下目オマキザル科マーモセット亜科ブラジル北東部体重 g ( 成熟個体 ) 体長 cm ( 頭胴長 ) 身体特徴染色体数 2n = 46 耳の脇の白い房毛, 長い尾後肢第 1 指のみ平爪, 他は鉤爪下顎の切歯が細長い寿命年 (20 年以上も ) 性成熟齢妊娠期間 1.5 歳日 1 回産子数 1-3 匹 (4 匹以上も ) 集団構成ファミリー ( 繁殖ペアと子 ) 父親兄姉も子育てに参加生態特徴昼行性, 樹上生活性多彩な音声コミュニケーション縄張りを示すための臭い付け行動好奇心旺盛 6

7 実験動物の繁殖学的特性マウスマーモセットマカクザル性成熟 8 週 1 年 3~4 年産仔数 / 回 6~8 匹 2~3 匹 1 頭妊娠期間 20 日 145~148 日 175~180 日分娩間隔 20~28 日 154~157 日約 550 日一部は季節繁殖年間産仔数 36~48 匹 4~6 匹 <1 匹生涯分娩回数 5~6 産 20~30 産 10~12 産生涯産仔数 ( 概算 ) 36~48 匹 40~80 匹 10~12 匹 7

8 Embryo Marmoset Phillips IR. The embryology of the common marmoset. Adv Anat Embryol Cell Biol. 1976;52(5):3-47. ) Fetus 8

コモンマーモセットの実験動物としての利点トランスジェニック動物の作製が可能霊長類で唯一ライン化可能な遺伝子改変動物が作製できるヒトに近縁であり生物学的類似性が高い代謝生理学的解剖学的特徴がヒトと非常に似ているヒトのサイトカインホルモンが交差する繁殖効率が良い性成熟まで約 1 年半と他の霊長類に比べ短い性別年齢

9 コモンマーモセットの実験動物としての利点トランスジェニック動物の作製が可能霊長類で唯一ライン化可能な遺伝子改変動物が作製できるヒトに近縁であり生物学的類似性が高い代謝生理学的解剖学的特徴がヒトと非常に似ているヒトのサイトカインホルモンが交差する繁殖効率が良い性成熟まで約 1 年半と他の霊長類に比べ短い性別年齢体重を揃えて繰り返し実験が可能小型で室内飼育や実験上の取り扱いが容易比較的簡単なトレーニングで飼育動物実験が可能 Bウイルスエボラ出血熱など人獣共通感染症がない創薬研究において少量のコンパウンドで試験が可能神経科学研究モデルとして注目社会行動研究特徴的音声コミュニケーション自発運動量が多く行動観察が比較的容易マカクにおける高次脳機能と関連した行動学的手法を適用できる (Sasaki et al., Nature 2009) 9

10 どのような研究にマーモセットは用いられているか研究領域感染症モデル急性肝炎マラリアプリオン ( 狂牛病 ) 病デング SARS 脳神経科学多発性硬化症パーキンソン病アルツハイマー自閉症薬理学向精神薬剤開発薬物安全性試験創薬一般行動学心理学生殖行動ストレス乳幼仔の成長発達育児行動繁殖額繁殖内分泌発生工学生殖腺の発生発育再生医学その他 ES 細胞の分化誘導脊髄損心筋梗塞脳梗塞白血病糖尿病肝障害ガン加齢肥満 10

11 霊長類の遺伝子改変動物作出の現状レンチ前核注入胚盤胞注入核移植ウイルスベクタートランスジェニック標的遺伝子ノックアウトクローン目的遺伝子改変の種類適した方法効率の良い遺伝子導入トランスジェニックレンチウイルスベクター大きい遺伝子の導入トランスジェニック前核注入目的の遺伝子の機能および発現の解析標的遺伝子ノックインノックアウト胚盤胞注入体細胞核移植ゲノム編集遺伝的背景の均一化クローン体細胞受精卵核移植 11

12 霊長類のクローン技術 12

13 Biol Reprod 受精卵核移植胚の in vitro 発生率 (37%) 胚移植後の発生率 (2.6%) 移植胚の出生率 (6.9%) Meng et al. Biology of Reproduction 57, (1997) 13

14 Nature 体細胞核移植胚は胚盤胞へ発生可能 (16%) Byrne et al. Nature 450, (2007) より改変 14

15 ヒト体細胞核移植 ES 細胞樹立 Nature Cell % が胚盤胞へ発生 15

16 非ヒト霊長類における新たな胚作成技術 ~ ミトコンドリア置換 ~ Nature Tachibana et al. Nature 461, (2009)

17 トランスジェニック霊長類作製技術 17

18 トランスジェニック霊長類作製技術の開発 1 Science, PNAS, 2001 遺伝子は導入されていたが産仔における遺伝子の発現は認められなかった 3 Nature, 2008 導入遺伝子は胎盤でのみ発現が認められた 4 Nature, 2009 導入遺伝子の発現が認められた個体は死んでしまった導入遺伝子の発現が体細胞で認められ次世代にも伝達した 18

19 5 PNAS, 2001 霊長類の遺伝子改変動物作製の問題点マカク類において初めて導入遺伝子の発現が生体の体細胞で認められた導入遺伝子の次世代への伝達は不明技術的問題点現時点ではいずれもウイルスベクターによる遺伝子導入 8kb 以上の導入遺伝子を導入できない標的遺伝子ノックアウト動物を作製できない霊長類の場合性成熟までに時間がかかるため個体数を増やす事が難しい霊長類の場合寿命が長いため発症までに時間がかかる (PD, アルツハイマーなど ) 19

20 霊長類におけるキメラ作製技術 20

21 霊長類の ES 細胞 ips 細胞の樹立 ES 細胞 1981 Mouse (Evans and Kaufman, Nature) 1995 Rhesus (Thomson et al., PNAS) 1996 Marmoset (Thomson et al., Biol Reprod) 1998 Human (Thomson et al., Science) 2001 Cynomologus monkey (Suemori et al., Dev Dyn) 2010 African green monkey (Shimozawa et al., Reproduction) ips 細胞 2006 Mouse (Takahashi et al.,cells) 2007 Human (Takahashi et al.,cells) 2008 Rhesus (Liu et al.,cell Stem Cells) 2010 Marmoset (Wu et al., Stem Cell Res) 2011 Pigtail Macaque 2012 Cynomologus monkey (Okahara-Narita et al., Primates) 2013 Baboon (Navara et al., Cell. Reprog,) Bonobo (Marchetto et al., Nature) Chimpanzee (Marchetto et al., Nature) 21

22 マーモセット ES/iPS 細胞樹立と in vitro 分化誘導 GFAP tubulin O4 Tyrosine Hydroxylase biii tubulin Hoechst 神経系細胞マーモセット ES 細胞造血系細胞マーモセット ips 細胞 (Sasaki et al., Stem Cells, 2005) (Kurita et al., Stem Cells, 2006) (Chen et al., BBRC, 2008 ) (Tomioka et al., Genes to cells, 2010) 心筋細胞 22

6kb loxp loxpv IRES2-EGFP2ANeo EcoRI BamHI (clone No.29) 1 4 5 9 10 12 16 17 20 25 26 30 WT,7.

23 Marmoset ACTB locus 7.7 kb WT BamHI Exon 1Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 BamHI KI BamHI Probe 6.6 kb ( 相同領域 5 arm 2.4kb, 3 arm 5.1kb) Clone No WT,7.7kb KI,6.6kb loxp loxpv IRES2-EGFP2ANeo EcoRI BamHI (clone No.29) WT,7.7kb KI,6.6kb EGFP expression of the ACTB+/KI ES cell EcoRI/BamHI Shiozawa et al., Stem Cells Dev

24 胚盤胞マウス 5.5 日胚マウス 7.5 日胚 LIF, BMP4 Activin A, bfgf Activin A, bfgf 24 (Teaser et al. Nature 488: 2007 より引用 )

25 Cell Stem Cell Nature PNAS PNAS いずれも動物種でキメラ作製能は確認されていない 25

26 アカゲザルによるキメラ動物作出 26 Tachibana et al. Cell 148, (2012)

27 ゲノム編集技術を用いたノックアウトマーモセットの作製標的に ZFN が結合 FokI が DNA を切断 DNA 修復開始 NHEJ によるエラー発生非相同末端再結合 (Non-Homologous End-Joining: NHEJ) 変異遺伝子の完成 27

28 Cell 142, 2010 American Journal of Pathology 180, 2012 JST News より抜粋腎臓は作られたが adult まで成長しない Sall family は脳肢芽心臓にも発現しており脳機能の異常はキメラではレスキューされない 28

29 Cell 142,

ラット以外の動物ではキメラが作出可能な ES/iPS は樹立されていない胚盤胞胚盤胞補完法胚盤胞

30 胚盤胞補完法による臓器作出動物 ips 細胞を用いた基礎検討が必要 ips 細胞よりヒトに近い非ヒト霊長類の ES/iPS 細胞が基礎検討に有用問題点 ips 細胞マウスラット以外の動物ではキメラが作出可能な ES/iPS は樹立されていない胚盤胞胚盤胞補完法胚盤胞非ヒト霊長類ではキメラ作出法が確立していないヒト - 動物融合胚の倫理的是非臓器欠損モデルヒト-ブタキメラヒトiPS 由来臓器作出 30

31 PNAS 110,

32 32

33 非ヒト霊長類疾患モデルへのヒト多能性幹細胞由来の分化細胞の移植脊髄損傷パーキンソン病 33

34 パーキンソンモデルサルの脳に ips 由来の NSC を allo graft および auto graft で移植 Allo graft では炎症反応が強いものの移植細胞は正着する免疫抑制剤はあまり必要ないかも 34

35 大脳小脳脊髄延髄橋中脳間脳パーキンソン病モデルは中脳脊髄損傷は脊髄に ips 細胞 ES 細胞から分化誘導した神経幹細胞を移植する 35

36 まとめトランスジェニックノックアウト技術による霊長類の疾患モデル作製法は確立しつつある一方で多能性幹細胞を用いたキメラ動物作製技術体細胞核移植技術については霊長類では個体は得られていないゲノム編集技術はノックアウト霊長類を作製するためには有用な方法であるがより確実な標的遺伝子ノックアウト霊長類作製のためにはキメラ形成能を持つナイーブ型多能性幹細胞の樹立が重要な課題となる性成熟まで時間がかかる非ヒト霊長類では今後体細胞核移植技術による個体作製多能性幹細胞からの配偶子形成技術が重要となっていく ( ヒトへの応用には十分な議論が必要 ) 霊長類を用いた動物性集合胚作製では霊長類の多能性幹細胞をドナーとした異種間キメラの作出の可能性作製された臓器の移植実験などから倫理面および感染症などに対する安全性の検討が必要パーキンソン病脊髄損傷など運動機能障害に対する神経幹細胞移植の前臨床研究として霊長類モデルは有用性が高い 36

( 平成 22 年 12 月 17 日ヒト ES 委員会説明資料 ) 幹細胞から臓器を作成する動物性集合胚作成の必要性について中内啓光東京大学医科学研究所幹細胞治療研究センター JST 戦略的創造研究推進事業 ERATO 型研究研究プロジェクト名 : 中内幹細胞制御プロジェクト 1

( 平成 22 年 12 月 17 日ヒト ES 委員会説明資料 ) 幹細胞から臓器を作成する動物性集合胚作成の必要性について中内啓光東京大学医科学研究所幹細胞治療研究センター JST 戦略的創造研究推進事業 ERATO 型研究研究プロジェクト名 : 中内幹細胞制御プロジェクト 1 幹細胞研究の現状腎不全各種心臓疾患など臓器不全症に対する根本的な治療には臓器移植が必要しかし移植臓器は圧倒的に不足している