計画研究 2005 2009 年度 定量的一塩基多型解析技術の開発と医療への応用 田平 知子 1) 久木田 洋児 2) 堀内 孝彦 3) 1) 九州大学生体防御医学研究所 林 健志 1) 2) 大阪府立成人病センター研究所 研究の目的と進め方 3) 九州大学病院 研究期間の成果 ポストシークエンシング時代のゲノム科学研究では 多因子性 遺伝性疾患の関連解析による原因遺伝子探索が最重要課題であ 1. DNAプールの定量的SSCP解析によるアレル頻度計測のための ソフトウエア開発 る この探索には ゲノムワイドなハプロタイプ構造情報に基づ DNA プールの定量的 SSCP 解析を広く関連解析研究に応用す いた膨大な数の SNP について 極めて多数の被検試料を用いた るために dbqsnp の機能を取り入れて Windows 上で独立に 頻度解析が要求される このためには 従来の各個的 散発的な 作動する SNP 同定 アレル頻度定量解析ソフトウェア QSNP 研究とは異なり システマティックな実験設定とデータ管理が要 lite を開発した これは SSCP 解析による SNP タイピング及 求される 本研究の目的は １ 既に我々が確立した自動化さ びアレル頻度決定と シークエンシングによる SNP 配列の同定 れた一塩基多型 (SNP) アレル頻度高効率高精度決定法である 確認を統合して行うものである また 96 ウェルプレート単位 pooled DNA の PLACE-SSCP 解析法 を発展させ 多数の多 で多数サンプルの解析を行うことを可能とするための実験手順の 因子性遺伝性疾患の原因遺伝子を大規模に探索することを現実的 設定 キャピラリーアレイシークエンサーからのデータ管理等を なものとする方法論を確立するとともに ２ 関連解析に必要 行う機能を有している このソフトウェアは SSCP 解析におけ な日本人ゲノムの多様性 地域差を解明し ３ ハプロタイプ る波形解析にはこれまでの研究で独自開発した QUISCA モ 多様性に関する情報基盤を確立する また ４ これらの方法 ジュール (Higasa et al. 2002) を用いるが さらに各アレルのピー 論及び情報基盤を利用して 自己免疫疾患をはじめとする多因子 クが重なっている場合に幾何学的に分離してアレル頻度を算出す 性遺伝性疾患の候補遺伝子の大規模な関連解析を行い 疾患の要 る 機 能 も 有 す る シ ー ク エ ン シ ン グ 解 析 は Windows 内 に 因となる遺伝的背景を解明する これによって 多因子性遺伝性 CoLinux の仮想ディスクを組み込み その上でベースコール 整 疾患の適切な診断 新治療法の開発 及び予防に寄与することを 列 目標とする phredphrapconsed.html) 及び配列変化検出のための PolyPhred の た め の PhredPhrap (http://www.phrap.org/ (http://droog.gs.washington.edu/polyphred/) を実行することによ る また挿入 欠失変異を高い確度で判定する独自開発の機能も 研究開始時の研究計画 これまで我々は PCR 産物をポストラベルし 蛍光キャピラリー 組み込んでいる ア レ イ 自 動 シ ー ク エ ン サ ー を 用 い て SSCP 解 析 す る 手 法 このソフトウェアを利用して多数の SNP についてプール DNA PLACE-SSCP 法 を確立し さらに DNA プールを対象にし の PLACE-SSCP 解析によりアレル頻度を推定し そのプール た PLACE-SSCP 解析による SNP アレル頻度算出法を開発して を構成する各検体のタイピングから得られたアレル頻度と比較す きた また この方法を利用して遺伝子転写開始点領域の SNP ることにより推定の精度を検討し 両者が極めて高い相関を示す 約 10,000 個を網羅的に解析し dbqsnp データベースとして公開 ことを確認した Tahira et al., 2006 またこのシステムを用い してきた この成果は pooled DNA の PLACE-SSCP 解析 ( 定 てプール DNA の定量的 SSCP 解析により SNP アレル頻度を決 量的 SSCP 解析 ) による SNP アレル頻度決定法が極めて信頼 定するプロトコールを総説として発表した (Tahira et al. 2009) 度が高く ほとんどの SNP についてこの方法が適用可能である ことを証明するものである 従って患者群 対照群での SNP ア 2. 定量的SNP解析技術を利用した病因遺伝子解析 レル頻度を比較する関連解析にこの方法は有用であると考えられ 1) DNAプールの定量的SSCP解析を利用した候補遺伝子解析 る これまでの研究で 高度にシステム化された実験 データ管 自己免疫疾患である全身性エリテマトーデスの発症機構は未だ 理システム dbqsnp を開発した これは UNIX サーバー上で 不明で 環境要因とともに遺伝的要因の関与が考えられる この 稼動するリレーショナルデータベースを用いた大規模なシステム 遺伝的要因を解明するために関連解析を行った 先行研究として である これを関連解析の手法として一般に普及させるのは不適 dbqsnp システムを用いて免疫系のシグナル伝達やアポトー 当であるので 広く疾患の関連解析にこのシステムを適用して シスに関連する 53 候補遺伝子の全エクソンおよびプロモーター 多数の多因子疾患の原因遺伝子探索を効率よく行うために 領域の SNP を患者検体から探索し 患者群および対照群の DNA Windows 上で稼動する上記システムの軽量版の開発を行う 一 プールのアレル頻度を定量し関連解析を行った これにより補体 方 日本人での SNP アレル頻度の多様性を検討し 関連解析に C3 をコードする遺伝子内に疾患との関連の強い SNP を検出し おける対照群選択のための情報基盤を整える またゲノムワイド た この関連を個別サンプルのシークエンスによるタイピングに 関連解析の効率化に必要な情報基盤として 日本人ハプロタイプ よっても確認し この SNP のリスクアレルの数と血中 C3 濃度 構造に関する情報を整備する さらに先行研究として 典型的な の間の相関を検出し この SNP を含むハプロタイプが C3 の発 多因子性自己免疫疾患である全身性エリテマトーデス SLE 等 現あるいは安定性にかかわっている可能性を示した (Miyagawa et の関連解析を多数の候補遺伝子領域にある SNP を用いて行い al. 2008) 疾患原因遺伝子を追究する 次に欧米での先行研究で SLE との関連が示唆された遺伝子に ついて同様にプール DNA を用いた関連解析を行い 転写因子 78
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< 国内外での成果の位置づけ> < 達成できなかったこと, 予想外の困難, その理由 > < 今後の課題, 展望 > 81
< 研究期間の全成果公表リスト> 82
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