課題番号 :27 指 1303 研究課題名 : 慢性 B 型肝炎の病態変動を検出するためのT 細胞染色試薬の開発 主任研究者名 : 宮寺浩子 キーワード :B 型肝炎ウイルス (HBV) 慢性 B 型肝炎 ヒト白血球抗原 (human leukocyte antigens; (HLA)), MHC テトラマー 研究成果 : B 型肝炎慢性化 ウイルス排除 ワクチン応答は ヒト白血球抗原 (human leukocyte antigens; HLA) クラス II と強く関連することから HLA クラス II の特定のアリルが HBs 抗原産生の誘導を介して B 型肝炎ウイルス (HBV) に対する免疫応答に大きく寄与すると考えられる この一連の免疫応答に関わる HLA クラス II 拘束性エピトープ およびこれを認識する T 細胞を同定することが出来れば HBV に対する免疫応答の詳細を明らかにする糸口となるだけでなく B 型肝炎慢性化や再活性化等のリスクを予測する上でも有用である そこで本研究では HLA クラス II の一つであり B 型肝炎慢性化との関連が報告されている HLA-DP に着目し HLA-DP 拘束性 HBV エピトープを同定し 慢性 B 型肝炎の病態に伴う T 細胞免疫系の変動を明らかにすることを目的として研究を行った まずHLA-DP 拘束性 HBVペプチドを同定するため HLA-DPが結合しうるペプチド領域を同定することとし 組換えHLAタンパク質と合成 -ペプチドとの相互作用を解析するためのアッセイ系を確立した( 投稿準備中 ) 以下に示す 日本人集団に高頻度に維持されるHLA-DPハプロタイプ6 種類のDPアリル産物を組換えタンパク質として発現した 慢性肝炎抵抗性ハプロタイプ:HLA-DP0401 (DPA1*01:03-DPB1*04:01), HLA-DP0402 (DPA1*01:03-DPB1*04:02), HLA-DP0201 (DPA1*01:03-DPB1*02:01) 感受性ハプロタイプ:HLA-DP0501 (DPA1*02-DPB1*05:01), HLA-DP0901 (DPA1*02:01-DPB1*09:01) 中立性ハプロタイプ: HLA-DP0301 (DPA1*02:02-DPB1*03:01) これらのDPA1-DPB1ハプロタイプのアリル産物を組換えタンパク質として発現し 各 HLA-DPアリル産物に結合するHBV 抗原ペプチド領域を表面抗原 (HBs) (59ペプチド), コア抗原 (HBc)(40ペプチド) をカバーする合成ペプチドライブラリーから探索した その結果 特定のHLA-DPアリル産物に結合するHBs, HBc 領域を複数箇所同定した ( 投稿準備中 ) さらに 短鎖ペプチドを用いた結合解析を行い これらのウイルス抗原ペプチド配列とHLA-DPとの間の相互作用に大きく寄与するアミノ酸残基を推定した しかし 疎水性ペプチドの場合は非特異的シグナルを生じるため測定が困難であり 中でも数種類のペプチドについては 合成困難のため測定を行うことが出来なかった HBs 抗原は疎水性領域が多いため 半数以上のペプチドについてHLAとの結合アッセイを行うことが出来なかった このため次に 異なる評価系 (HLA 発現アッセイ ) で HLA-DP 結合領域の探索を行った この方法では HLAをペプチドとの融合タンパク質として培養細胞に発現し 内部コントロール (GFP) を用いて細胞表面 HLA 発現量を定量化する (Miyadera, et al. 2015 J. Clin. Invest.; 宮寺 他 2016 日本臨床免疫学会会誌 ) HLAはペプチドと強く結合するほどタンパク質複合体が安定化し 細胞表面に高発現する性質がある そのため 細胞表面のHLA 発現量を測定することによりペプチドとの相互作用の相対的な強さを推測 評価することが出来る この方法を用いることにより 疎水性領域を含むHBs, HBc 全領域についてHLAとの結合性を測定することが可能であった H28 年度はHLA 発現アッセイを用いて 3 種類のHLA-DPアリルについてHBs, HBc 抗原を対象としたHLA 結合領域探索を行い 特定のHLA-DPにアリル特異的 かつ強い相互作用を介して提示されうるHBs, HBc 抗原領域を複数箇所 見出した 当初の研究計画ではHLAテトラマーを作成することにより HLA-DP 拘束性 HBs, HBc 抗原ペプチドを認識するT 細胞を同定する予定であったが HLAテトラマー作製が困難であったため 他の方法によって抗原特異的 T 細胞同定を進めることとした 具体的には HLA-DPとの結合が示唆されたHBs, HBc 抗原領域についてHLA-DPとの融合タンパク質を作成し HLA- 抗原複合体として培養細胞表面に安定発現させる これを抗原提示細胞として用い ワクチン応答陽性健常人末梢血中の反応性 T 細胞をスクリーニングする 平成 28 年度は このための抗原提示細胞作成を開始した
Subject No. :27 指 1303 Title :Development of T-cell staining reagent for study of immune responses in chronic hepatitis B Researchers :Hiroko Miyadera Key word :hepatitis B virus (HBV), chronic hepatitis B infection (CHB), human leukocyte antigens (HLA), HLA tetramer Abstract :Susceptibility to chronic hepatitis B (CHB) and responses against HBV vaccination are associated strongly with polymorphisms in human leukocyte antigen (HLA) class II region, indicating that HLA class II are one of the major factors that mediate adapted immune responses against HBV. To identify detailed mechanisms of HLA class II-mediated immune responses, we aim to identify HBs and HBc antigen peptides that are presented to HLA class II and are involved in T-cell mediated immunity and antibody production against HBV. As the first step, we established in vitro assay to identify HLA class II-restricted HBV peptides. First, we prepared recombinant proteins encoded by the six HLA-DP haplotypes that are maintained at high frequencies in the Japanese population. These recombinant proteins were then used for HLA-peptide binding assay using labeled synthetic peptides. The peptide libraries that cover the entire region of HBs and HBc antigens were designed and used for screening. The in vitro assay worked well for approximately half of peptides in the libraries but did not work for hydrophobic regions. Therefore, we next established alternative methods that can also be applicable for hydrophobic regions. Up to the present, we identified several regions of HBs and HBc antigens that can be presented to particular HLA-DP allele products. Using the identified HBs and HBc regions, we plan to search for HLA-DP-restricted T-cell epitopes. Researchers には 分担研究者を記載する
国際開発研究費報告書 (H28 年度 ) 課題番号 27 指 1303 ( 主任研究者 : 宮寺浩子 ) 研究課題名 慢性 B 型肝炎の病態変動を検出するためのT 細胞染色試薬の開発 背景 1:B 型肝炎慢性化抵抗性 感受性と関連する HLA-DPB1 アリルが同定された 目的 : HLA-DP 拘束性 HBV 抗原ペプチド (T 細胞エピトープ ) を認識する抗原特異的 T 細胞を同定することにより B 型肝炎に対する免疫応答機序を解明する 抗原特異的 T 細胞を染色するための試薬 (HLA テトラマー ) を開発し B 型肝炎の様々な病態での T 細胞の動態を明らかにする H28 年度進捗 : Modified from Nishida, Sawai et al. 2014 PLoS One 背景 2: HLA クラス II が どのような機序で B 型肝炎慢性化の抑制 促進に関わるのか その機序は不明である DP0401, DP0402 慢性化抑制と関連 ウイルス排除と関連 ワクチン応答と関連 DP0501, DP0901 慢性化と関連 ワクチン不応答と関連 CTL 活性化 (Th1) B 細胞活性化 (Th2)? ウイルス排除 中和抗体産生 慢性肝炎 1. HLA-DP 提示 HBV 抗原の同定 HLA-DPアリル3 種類について HBs, HBc 抗原領域を対象とした結合スクリーニングを実施した 2. T 細胞エピトープ探索健常人末梢血 (HBVワクチン陽性者) を用いたT 細胞エピトープ探索を行うための HLA- 抗原複合体の安定発現株 ( 抗原提示細胞 ) の作成を開始した 3.T 細胞染色試薬 (HLAテトラマー) の大量調製系を確立する 技術的な課題があり計画を一部変更した HLAテトラマーに代わる方法としてHLA- 抗原複合体の安定発現株 ( 抗原提示細胞 ) のパネルを作成し これを用いたT 細胞染色を行うこととした
1. HLA-DP 提示 HBV 抗原の同定 HLA- ペプチド結合解析の測定法を二種類確立し HBs, HBc ライブラリーから HLA-DP アリル特異的に結合する領域を見出した 今後 HLA 結合領域を対象として T 細胞エピトープを同定する 1 10 20 30 40 50 60 M G G W S S K P R Q G M G T N L S V P N P L G F F P D H Q L D P A F G A N S N N P D W D F N P N K D H W P E A N Q V G A 70 80 90 100 110 120 G A F G P G F T P P H G G L L G W S P Q A Q G I L T T V P A A P P P A S T N R Q S G R Q P T P I S P P L R D S H P Q A M 130 140 150 160 170 180 Q W N S T T F H Q A L L D P R V R G L Y F P A G G S S S G T V N P V P T T A S P I S S I F S R T G D P A P N M E N T T S 190 200 210 220 230 240 G F L G P L L V L Q A G F F L L T R I L T I P Q S L D S W W T S L N F L G G A P T C P G Q N S Q S P T S N H S P T S C P 250 260 270 280 290 300 P I C P G Y R W M C L R R F I I F L F I L L L C L I F L L V L L D Y Q G M L P V C P L L P G T S T T S T G P C K T C T I 310 320 330 340 350 360 P A Q G T S M F P S C C C T K P S D G N C T C I P I P S S W A F A R F L W E W A S V R F S W L S L L V P F V Q W F V G L 370 380 390 400 S P T V W L S V I W M M W Y W G P S L Y N I L S P F L P L L P I F F C L W V Y I 10 20 30 40 50 60 M Q L F H L C L I I S C S C P T V Q A S K L C L G W L W G M D I D P Y K E F G A S V E L L S F L P S D F F P S I R D L L 70 80 90 100 110 120 D T A S A L Y R E A L E S P E H C S P H H T A L R Q A I L C W G E L M N L A T W V G S N L E D P A S R E L V V S Y V N V 130 140 150 160 170 180 N M G L K I R Q L L W F H I S C L T F G R E T V L E Y L V S F G V W I R T P P A Y R P P N A P I L S T L P E T T V V R R 190 200 210 R G R S P R R R T P S P R R R R S Q S P R R R R S Q S R E S Q C 1HLA- ペプチド結合測定により HLA-DP 結合 HBV 抗原ペプチドを同定した 2HLA 発現アッセイにより HBs, HBc 全領域から HLA 提示領域を見出した wikimedia.org pres1 HBs( 表面抗原 ) ペプチドライブラリー TM1 TM2 S pres2 HBc( コア抗原 ) ペプチドライブラリー HLA 発現アッセイの概要 (Miyadera, et al. 2015 J. Clin. Invest. を改変 ) TM4 TM3 1HLAII α 鎖安定発現株 ビオチン化ペプチド アビジン -HRP DPA1 puro R 安定発現 Ni-NTA plate (96-well) 組換え HLA-DP DP0402 DP0401 DP0201 DP0301 DP0501 DP0901 Mock HBs( 表面抗原 ) HBc( コア抗原 ) C. Chen, manuscript in preparation 2HLAII β 鎖を一過性発現 ( レトロウイルスベクター pmxs-ig) 異なるウイルス濃度 (2~3 点 ) で感染 DPA1 DPB1 IRES GFP 一過性発現 puro R HLA GFP Peptide [um] 0 0.01 0.05 0.1 0.25 0.5 1 2.5 5 10 20 50 Peptide_#1 (HBs) z Peptide [um] 0 2 5 10 20 50 Mock Peptide_#2 (HBc) DP*aa DP*bb DP*cc DP*dd DP*ee DP*ff 3HLA, GFP 発現量測定 GFP HLA GFP ( 内部コントロール ) Mock DP*aa DP*bb DP*cc DP*dd DP*ee DP*ff
研究発表及び特許取得報告について 課題番号 : 27 指 1303 研究課題名 : 慢性 B 型肝炎の病態変動を検出するための T 細胞染色試薬の開発 主任研究者名 : 宮寺浩子 論文発表 論文タイトル著者掲載誌掲載号年 HLA クラス II 結合ペプチドの探索 同定法の開発 宮寺浩子 野口恵美子 溝上雅史 徳永勝士 日本臨床免疫学会会誌 Vol. 40 No.1 2017 年 学会発表 タイトル発表者学会名場所年月 Stability profiling of HLA class II protein for disease association studies Hiroko Miyadera, Jun Ohashi and Katsushi Tokunaga The 13th International Congress of Human Genetics 京都 2016 年 4 月 A large scale screening of HLA-class IIbinding peptides from HBs and HBc peptide libraries Hiroko Miyadera, Yuki Okabe, Cindy Chen, Katsushi Tokunaga, Masashi Mizokami The American Association of Immunologist (AAI) annual meeting 米国 2016 年 5 月 HLA-DP 提示 HBs HBc 抗原領域の探索 宮寺浩子 岡部由紀 Cindy Chia- Jung Chen 徳永勝士 考藤達哉 溝上雅史 第 52 回日本肝臓学会総会 幕張 2016 年 5 月 HLA class II protein stability and disease susceptibility. Miyadera, J. Ohashi, and K. Tokunaga 16th International Congress of Immunology 豪州 2016 年 8 月 HLA 結合ペプチドの大規模探索法の開発 宮寺浩子 徳永勝士 野口恵美子 第 44 回日本臨床免疫学会総会 東京 2016 年 9 月 HLA クラス II 提示 B 型肝炎ウイルス抗原領域の探索 宮寺浩子 岡部由紀 Cindy Chia- Jung Chen 徳永勝士 溝上雅史 第 25 回日本組織適合性学会大会 札幌 2016 年 10 月 Large scale analysis of HLA-peptide interactions H. Miyadera, Y. Okabe, K. Tokunaga, and E. Noguchi 66th Annual Meeting of the American Society of Human Genetics カナダ 2016 年 10 月
研究発表及び特許取得報告について その他発表 ( 雑誌 テレビ ラジオ等 ) タイトル発表者発表先場所年月日 該当なし 特許取得状況について 出願申請中のものは ( ) 記載のこと 発明名称 登録番号 特許権者 ( 申請者 ) ( 共願は全記載 ) 登録日 ( 申請日 ) 出願国 該当なし 該当がない項目の欄には 該当なし と記載のこと 主任研究者が班全員分の内容を記載のこ