LC/MSの 基 礎 と 実 践 日 本 電 子 開 発 本 部 高 橋 豊 CERIクロマトセミナー2009
目 次 LC/MSの 基 礎 イオン 源 の 種 類 と 原 理 質 量 分 離 部 ( 分 析 計 )の 種 類 と 原 理 LC/MSにおける 定 性 分 析 LC/MSにおける 定 量 分 析 分 析 上 の 注 意 点 ノウハウ
LC/MSの 基 礎
LC/MSとは 液 体 クロマトグラフィーと 質 量 分 析 法 を 接 続 した 機 器 分 析 法 Liquid Chromatography Mass Spectrometryの 略 語 分 析 手 法 を 表 す 略 語 装 置 を 表 す 略 語 はLC-MSを 推 奨 液 体 クロマトグラフ 質 量 分 析 計 (TOF) 日 本 電 子 製 AccuTOF
類 似 用 語 と 意 味 Liquid Chromatography (Mass Spectrometry) Liquid Chromatograph ( Mass Spectrometer) Liquid Chromatogram (Mass Spectrum) Liquid Chromatographer ( Mass Spectrometrist) 方 法 学 問 装 置 チャート 人
LC/MSで 何 ができるか? LCによる 混 合 物 の 分 離 +MSによる 検 出 LC 分 離 : 不 揮 発 性 熱 不 安 定 性 高 分 子 物 質 が 対 象 MS 検 出 定 性 目 的 :マススペクトルによる 物 質 同 定 MS/MS 測 定 による 構 造 推 定 MSの 高 選 択 性 定 量 目 的 : 選 択 イオン 検 出 法 (SIM) 選 択 反 応 検 出 法 (SRM or MRM) MSの 高 感 度 高 選 択 性 GC(GC/MS) GC 分 離 : 揮 発 性 熱 安 定 性 物 質 が 対 象 MS 検 出 :ライブラリーサーチによる 同 定 SIM, SRMを 用 いた 定 量 分 析
LC/MSでできないこと イオン 化 しない 物 質 の 分 析 イオン 化 し 難 い 物 質 の 高 感 度 分 析 (イオン 化 し 易 くする 方 法 はある( 誘 導 体 化 やイオン 化 助 剤 の 添 加 など)) MSは 高 感 度 な 分 析 装 置 UVよりもレスポンスの 低 い 物 質 は 沢 山 ある
LC/MSの 応 用 範 囲 1. 天 然 物 化 学 / 有 機 合 成 化 学 分 子 量 の 確 認 構 造 解 析 2. 生 化 学 / 医 学 / 薬 学 / 法 医 学 など 生 体 高 分 子 (タンパク 質 核 酸 糖 糖 脂 質 など)の 分 析 イムノアッセイ 臨 床 診 断 の 一 助 ( 先 天 性 代 謝 異 常 など) ドーピングテスト 薬 物 動 態 3. 環 境 分 析 農 薬 環 境 ホルモン 様 物 質 などの 定 量 モニタリング 4. 製 品 管 理 不 純 物 分 析 など 5.その 他 合 成 高 分 子 化 学 ( 添 加 剤 ) 材 料 分 析 石 油 化 学 など
MS 装 置 の 構 成 分 離 装 置 (LC) イオン 源 (API) インターフェイス 分 析 部 検 出 部 制 御 部 大 気 圧 低 真 空 中 真 空 高 真 空 LC-MSの 構 成 分 離 装 置 (GC) 大 気 圧 イオン 源 (EI) 分 析 部 検 出 部 制 御 部 高 真 空 GC-MSの 構 成
LC/MSで 得 られるデータ 強 度 Total Ion Current (TIC) Profile 時 間 Extracted Ion Chromatogram m/z Mass Spectra (Scan) Selected Ion Monitoring (SIM) ( 測 定 法 ) SIM Chromatogram
マススペクトル 強 度 m/z m: イオンの 質 量 z: イオンの 電 荷 数 Zが1の 時 m/z 値 = 質 量 ( 電 子 の 質 量 を 無 視 した 場 合 )
マススペクトルから 何 がわかる? 分 子 量 関 連 イオンのピークからの 分 子 の 質 量 ( 分 子 量 確 認 ) フラグメントイオンのピークから 分 子 の 構 造 ( 構 造 情 報 ) 同 位 体 イオンピークの 高 さから 構 成 元 素 の 種 類 と 数 ( 元 素 情 報 ) 精 密 質 量 からイオン 組 成 式 分 子 量 確 認 構 造 情 報 元 素 情 報 注 )LC/MSでは 通 常 フラグメントイオンは 観 測 されない
イオンの 種 類 最 近 は 推 奨 されない 用 語 分 子 量 関 連 イオン: 試 料 化 合 物 の 分 子 量 情 報 に 直 接 役 立 つイオン 分 子 イオン 試 料 分 子 から 電 子 を 取 り 去 るか 電 子 を 付 加 することによって 生 成 するイオンのこと M + またはM のように 不 対 電 子 を 持 っている イオンの 質 量 = 分 子 量 ( 電 子 の 質 量 を 無 視 すれば) プロトン 化 分 子 試 料 分 子 にプロトンが 付 加 して 生 成 するイオンのこと [M+H] + のように 表 示 する イオンの 質 量 = 分 子 量 +1 脱 プロトン 化 分 子 試 料 分 子 にプロトンが 失 われて 生 成 するイオンのこと [M H] + あるいは[M H] - のように 表 示 する イオンの 質 量 = 分 子 量 -1 フラグメントイオン: 分 子 量 関 連 イオンが 結 合 の 開 裂 を 起 こして 生 成 した 分 子 量 より 質 量 の 小 さいイオンのこと
ノミナル 質 量 と 精 密 質 量 ノミナル 質 量 (Nominal( mass) 質 量 数 各 元 素 について 天 然 存 在 比 が 最 大 の 同 位 体 の 質 量 に 最 も 近 い 整 数 値 を 用 いて 計 算 した 質 量 = 原 子 では 質 量 数 と 同 じ 値 ( 例 ) 12 C=12, 1 H=1, 16 O=16, 14 N=14, 35 Cl=35 など 精 密 質 量 (Exact( mass) 炭 素 同 位 体 12Cの 質 量 を 基 準 値 として12.000000u(or Da)とし 単 一 同 位 体 で 構 成 された 分 子 やイオンの 質 量 を ミリダルトン 以 下 まで 計 算 した 質 量 ( 例 ) 1 H=1.007825, 16 O=15.994917, 14 N=14.003074, 35 Cl=34.968853 など モノアイソトピック 質 量 (Monoisotopic( mass) 原 子 に 対 して 使 う 用 語
原 子 分 子 の 質 量 と 原 子 量 分 子 量 質 量 分 析 で 測 定 される 質 量 は 個 々の 原 子 あるいは 分 子 など の 質 量 であり 原 子 の 天 然 同 位 体 存 在 比 を 考 慮 した 原 子 量 や 分 子 量 とは 異 なる 原 子 量 : 相 対 原 子 質 量 (Relative atomic mass)ともいう 炭 素 原 子 12 C の 質 量 の 1/12 に 対 する ある 元 素 の 一 原 子 あたりの 平 均 質 量 の 比 で 表 される 無 次 元 量 ある 元 素 の 原 子 量 は その 元 素 の 同 位 体 の 質 量 に 質 量 分 析 装 置 によって 計 測 される 各 同 位 体 の 存 在 比 を 重 率 として 掛 けて 求 めた 平 均 値 ( 例 ) C = 12.011, H = 1.008, O = 15.999, N = 14.007 など 分 子 量 分 子 量 : 相 対 分 子 質 量 (Relative molecular mass) ともいう 炭 素 原 子 12 C の 質 量 の 1/12 に 対 する ある 化 合 物 の 一 分 子 あたりの 平 均 質 量 の 比 で 表 される 無 次 元 量 ある 分 子 の 分 子 量 は その 分 子 を 構 成 する 総 ての 元 素 の 相 対 原 子 質 量 ( 原 子 量 )の 和 に 等 しい
相 対 分 子 質 量 ノミナル 質 量 精 密 質 量 ( 12 C=12.011) ( 12 C=12) ( 12 C=12.000000) 相 対 分 子 質 量 298.5042 ノミナル 質 量 298 精 密 質 量 298.2862 ステアリン 酸 メチルの 分 子 イオン
質 量 分 解 能 と 分 子 質 量 相 対 分 子 質 量 分 子 量 約 10,000の 物 質 を 質 量 分 解 能 6,000と50,000のMS 装 置 で 分 析 したら... C500H1000N100O100 100 相 対 強 度 10014.65 質 量 分 解 能 6,000 (FWHM) 50 0 10010 10020 10030 質 量 電 荷 比 (m/z) C500H1000N100O100 100 相 対 強 度 10014.65 質 量 分 解 能 50,000 (FWHM) 50 0 10010 10020 10030 質 量 電 荷 比 (m/z)
塩 素 Clのみ 35 Cl/ 37 Cl=3/1 塩 素 Clと 臭 素 Br の 組 み 合 わせ 臭 素 Brのみ 79 Br/ 81 Br=1/1 塩 素 Clと と 臭 素 Brの の 同 位 体 パターン
窒 素 ルール 窒 素 原 子 を 奇 数 個 含 む 化 合 物 の 整 数 質 量 は 奇 数 になる 窒 素 を 含 まないか もしくは 偶 数 個 含 む 化 合 物 の 整 数 質 量 は 偶 数 になる ただし 次 の2つの 条 件 が 満 たされていなければならない 分 子 量 関 連 イオンは 正 の 主 分 子 イオンM + または 負 の 主 分 子 イオンM - でなければならない プロトン 付 加 分 子 イオン[M+H] + あるいはプロトン 脱 離 イオン[ M-H] - などの 場 合 は 整 数 質 量 の 偶 奇 性 が 逆 転 する 分 子 イオンの 質 量 は 整 数 で 表 示 されていなければならない 例 ベンゼン C6H6=72 ニトロベンゼン C6H5NO2=123
イオン 源 の 種 類 と 原 理
LC-MSインターフェイス (イオン 源 )の 種 類 役 割 : 試 料 のイオン 化 エレクトロスプレー(ESI) 大 気 圧 化 学 イオン 化 (APCI) 大 気 圧 光 イオン 化 (APPI) サーモスプレー(TSP) パーティクルビーム(PB) フローFAB 大 気 圧 イオン 化 真 空 中 イオン 化
N ESIの 構 造 と 原 理 2 LC 溶 出 液 スプレイヤー 高 電 界 による 静 電 噴 霧 帯 電 液 滴 の 生 成 加 熱 脱 溶 媒 イオン 蒸 発 脱 溶 媒 室 高 電 圧 リングレンズ (1~2 kv) 適 する 移 動 相 流 量 : 0.2 ml/min イオンガイド イオンが 生 成 する 位 置 オリフィス (コーン, キャピラ リ) ロータリーポンプ ターボ 分 子 ポンプ
ESIのイオン 生 成 大 気 圧 中 + + + + 帯 電 液 滴 + + + + + + 加 熱 脱 溶 媒 レイリー リミット + + + + + + + + + + 液 滴 の 分 裂 + + + + + + + + + + クーロン 反 発 [M 1 +Na] + [M 1 +H] + [M 2 +2H] 2+ [M 3 +2H] 2+ イオンエバポレーション MS
APCIの 構 造 と 原 理 N 2 LC 溶 出 液 スプレイヤー 高 圧 ガスによる 噴 霧 加 熱 気 化 コロナ 放 電 溶 媒 分 子 イオンの 生 成 溶 媒 イオンと 試 料 分 子 の 衝 突 試 料 イオン 生 成 適 する 移 動 相 流 量 : 1 ml/min 気 化 管 イオンが 生 成 する 位 置 リングレンズ イオンガイド 放 電 電 極 高 電 圧 (3~5 オリフィス kv) (コーン,キャ ピラリ) ロータリーポンプ ターボ 分 子 ポンプ
APPIの 構 造 と 原 理 N 2 LC 溶 出 液 スプレイヤー 高 圧 ガスによる 噴 霧 加 熱 気 化 光 子 エネルギーによる 試 料 分 子 の 直 接 イオン 化 気 化 管 リングレンズ 試 料 分 子 のイオン 化 電 圧 が 光 子 のエネル ギー(10 ev)より 低 い 場 合 のみ イオンが 生 成 する 位 置 UVラン プ イオンガイド 適 する 移 動 相 流 量 : 0.2 ml/min オリフィス (コーン,キャ ピラリ) ロータリーポンプ ターボ 分 子 ポンプ
LC/MSで 得 られるイオン 種 基 本 的 に 溶 媒 とのプロトン 移 動 でイオンが 生 成 する 正 イオン 検 出 :[M+H] + 負 イオン 検 出 :[M-H] - ( 呼 び 方 :プロトン 化 分 子 脱 プロトン 化 分 子 ) その 他 溶 媒 中 の 不 純 物 や 溶 媒 分 子 の 付 加 イ オンが 生 成 し 易 い [M+Na] +, [M+NH 4 ] +, [M+H+Sol] +, [M+Cl] - など LC/MSで 用 いられているイオン 化 法 は イオン 化 のエネルギー が 低 いので フラグメントイオンは 殆 ど 生 成 しない
質 量 分 離 部 ( 分 析 計 )の 種 類 と 原 理
質 量 分 離 部 ( 分 析 計 )の 種 類 役 割 :イオンをm/z 値 に 応 じて 分 離 四 重 極 (Q) 三 連 四 重 極 (QqQ) イオントラップ(IT) 飛 行 時 間 (TOF) 磁 場 型 (Sector) フーリエ 変 換 イオンサイクロトロン 共 鳴 (FTICR) ハイブリッドタンデム(MS/MS) Q-TOF, IT-TOF, Qトラップ, Q-FTICR
四 重 極 質 量 分 析 計 (Q-MS) ロッドの 印 加 電 圧 ±(Vdc+Vac cosωt) Vdc : 直 流 電 圧 Vac : 高 周 波 交 流 電 圧 周 期 的 にポールの 極 性 を 変 えることに より イオンはz 軸 上 を 振 動 しながら 進 む m/z=k(vac/r0 2 f 2 ) Vac : 高 周 波 交 流 電 圧 [V] r0 : z 軸 と 電 極 の 距 離 [mm] f : 高 周 波 数 [MHz]
直 流 電 圧 と 高 周 波 電 圧 の 比 が 一 定 となるように 電 圧 を 変 化 させる L 定 分 解 能 モード 定 mモード m 3 の 安 定 振 動 領 域 化 学 同 人 これならわかるマススペクトロメトリー より 抜 粋 直 流 電 圧 と 高 周 波 電 圧 の 比 を 連 続 走 査 スキャン 測 定 マススペクトル: 定 性 直 流 電 圧 と 高 周 波 電 圧 の 比 を 段 階 的 に 変 化 SIM 測 定 SIMクロマトグラム: 定 量
三 連 四 重 極 質 量 分 析 計 (QqQ-MS) MS1 MS2 M1 イオン M2 M3 イオン 源 CID M2 m1,m2,m3 m1 m2 m3 検 出 器 特 定 イオンを 選 択 イオンの 分 解 生 成 イオンの 分 離 検 出
イオントラップ 質 量 分 析 計 (IT-MS) エンドキャップ 電 極 アース 電 位 高 周 波 電 圧 を 印 加 リング 電 極 エンドキャップ 電 極 イオンは 振 動 しながら 電 極 内 部 の 空 間 に 留 まる m/z=kvac Va : 高 周 波 交 流 電 圧 [V]
高 周 波 電 圧 のみを 変 化 させることで 振 動 が 不 安 定 になったイオ ンがエンドキャップ 電 極 の 出 口 から 外 に 飛 び 出 す 化 学 同 人 これならわかるマススペクトロメトリー より 抜 粋
飛 行 時 間 質 量 分 析 計 (TOF-MS) m/z の 小 さなイオン m/z の 大 きなイオン イオン 源 自 由 飛 行 領 域 (L) 加 速 電 圧 イオン 検 出 器 強 度 m/z マススペクトル リニア 型 TOF-MS MSの の 原 理
Vreflector リフレクタ E 0V 第 1 自 由 空 間 第 2 自 由 空 間 イオン 源 検 出 器 リフレクトロン 型 TOF-MS MSの の 原 理 は 同 じm/z のイオン
直 交 加 速 (oa) 技 術 oa: orthogonal acceleration Focal Plane 2 (Spatial) Reflectron (Ion Mirror) Detector V push (+) Field Free Region 0 V pull (-) Push-out Plate G1G2 Ion Source V beam (+) G3 Orthogonal Accelerator v Y θ Focal Plane 1 (Spatial) v X G4 V flight_tube (-) V reflectron (+) tanθ = (v Y /v X ) = ((-V flight_tube + 1/2 V push ) / V beam ) 1/2
磁 場 型 質 量 分 析 計 (Sector-MS) 磁 場 逆 配 置 質 量 分 析 計 電 場 電 場 磁 場 正 配 置 質 量 分 析 計
磁 場 に 入 射 するイオンは 磁 界 に 垂 直 の 方 向 に 力 が 働 く イオンの 流 れに 相 当 フレミングの 左 手 の 法 則
目 的 別 分 析 計 種 類 (1) 定 量 分 析 ( 夾 雑 成 分 の 少 ない 試 料 ) 中 心 あ るいは 分 子 量 確 認 &スペクトル 確 認 QMS 定 量 分 析 ( 夾 雑 成 分 の 多 い 試 料 ) 中 心 一 寸 した 構 造 解 析 トリプルQMS, リニアイオントラップ ハイスループットミリマス 測 定 中 心 TOF
目 的 別 分 析 計 種 類 (2) 構 造 解 析 中 心 ( 低 質 量 精 度 ) イオントラップ,リニアイオントラップ 本 格 的 な 構 造 解 析 ( 高 質 量 精 度 ) Q-TOF, FT-ICR, Orbi-trap イオンー 分 子 反 応 の 観 測 FT-ICR
LC/MSにおける 定 性 分 析
LC/MSにおける 定 性 分 析 (1) API (ESI, APCI)の 特 徴 ソフトイオン 化 プロトン 化 分 子 ([M+H] + ) 脱 プロトン 化 分 子 ([M-H] - )が 得 られ 易 い 溶 媒 不 純 物 の 付 加 イオン [M+Na] +, [M+NH 4 ] +, [M+H+Solv] +, [M+Cl] -, クラスターイオン([2M+H] +, [3M+Na] + ) フラグメントイオンが 生 成 し 難 い 構 造 情 報 が 乏 しい
LC/MSにおける 定 性 分 析 (2) MS/MS 測 定 (タンデム(MS/MS)のみ 可 能 ) イオン 源 で 生 じた 様 々なイオン 種 に 対 して 衝 突 誘 起 解 離 (CID )などを 利 用 して 特 定 なイオンの 分 解 によって 生 成 するイオンや, 分 解 によって 特 定 なイオン 種 を 生 成 する 元 のイオン 種,を 検 出 する 測 定 法 例 ) 三 連 四 重 極 MSによるプロダクトイオンスキャン MS1 MS2 M1 イオン M2 M3 イオン 源 CID M2 m1,m2,m3 m1 m2 m3 検 出 器 特 定 イオンを 選 択 イオンの 分 解 生 成 イオンの 分 離 検 出 その 他 プリカーサーイオンスキャン: 特 定 イオン 種 を 生 成 するような 前 駆 イオンを 検 出 トニュートラルロススキャン: 特 定 中 性 分 子 種 を 生 成 するような 前 駆 イオンを 検 出 コンスタン
MS/MS 分 析 可 能 な 装 置 トリプルQMS 4-Sector MS ハイブリッド Q-TOF, Qqリニアトラップ Tandem in Space イオントラップ FT-ICR Tandem in Time
LC/MSにおける 定 性 分 析 (3) 精 密 質 量 測 定 ( 高 分 解 能 装 置 で 可 能 ) 炭 素 同 位 体 12 Cの 質 量 を 基 準 値 として12.000000u(or Da)とした 時 の 各 元 素 の 質 量 ( 例 ) 1 H=1.007825, 16 O=15.994917, 14 N=14.003074, 35 Cl=34.968853 など 分 解 能 500 分 解 能 1000 分 解 能 5000 リファレンスイオン( 精 密 質 量 既 知 ) 試 料 由 来 イオン 両 イオンの 距 離 試 料 イオンの 精 密 質 量 演 算 m/z 構 成 元 素 の 組 成 推 定
LC/MSにおける 定 性 分 析 (4) In-Source CID( 全 てのLC-MSで 可 能 ) オリフィス 電 圧 10 V リングレンズ イオンガイド オリフィス 電 圧 :10 V [M+H] + 609.2800 70 V + + + 0 200 400 600 800 質 量 電 荷 比 (m/z) オリフィス 電 圧 :70 V 174.0913 フラグメントイオン [M+H] + 609.2816 オリフィス (コーン,キャピラ リ) 0 397.2120 195.0649 365.1850 448.1978 200 300 400 500 600 質 量 電 荷 比 (m/z)
LC/MSにおける 定 量 分 析
LC/MSを 用 いた 定 量 分 析 未 分 離 ピークをMS 的 に 分 離 UV, DADの 選 択 性 MSの 選 択 性 ( 低 分 解 能 1 u)
定 量 分 析 に 用 いられる 測 定 法 SIM (Selected Ion Monitoring) イオン M1 M2 M3 検 出 器 SRM (Selected Reaction Monitoring) イオン M1 M2 M3 CID M2 m1,m2,m3 m1 m2 m3 検 出 器
選 択 反 応 検 出 法 (SRM or MRM) ~MS/MS 測 定 を 利 用 した 定 量 分 析 ~ MS/MS: 本 来 はイオンの 構 造 解 析 手 法 選 択 性 向 上 の 目 的 で 定 量 分 析 に 応 用 方 法 :プロダクトイオンスキャン+SIM 測 定 ( 使 用 装 置 :QqQ or QqLIT) 1 Q1で 目 的 イオンを 選 択 ( 複 数 設 定 可 能 ) 2 qで 開 裂 (CID) プロダクトイオン 生 成 3 Q3で 定 量 するプロダクトイオンを 選 択 検 出 ( 化 合 物 特 異 的 なプロダクトイオンを 選 択 すると 良 い)
高 分 解 能 を 利 用 した 選 択 性 の 向 上 高 分 解 能 SIM 法 高 分 解 能 マスクロマトグラム 法 分 解 能 500 m=1.44u 信 号 を 取 り 込 むm/z 範 囲 : 広 選 択 性 : 低 分 解 能 5000 m=0.144u 信 号 を 取 り 込 むm/z 範 囲 : 狭 選 択 性 : 高 使 用 装 置 : 磁 場 型 TOF
SIM, SRM, 高 分 解 能 SIMデータ ポリカーボネート 製 プラスチック 中 のビスフェ ビスフェノールA? ノールAの 分 析 SIM 法 ノイズレベル: 高 選 択 性 : 低 ノイズレベル: 低 m/z 227 選 択 性 : 高 ビスフェノールA ビスフェノールA SRM 法 R = 5,000 m/z 227 m/z 221 m/z 227.1072
LC/MSによる 定 量 分 析 の 注 意 点 1 マトリックス 効 果 :マトリックス 成 分 による 分 析 対 象 成 分 のイオン 化 阻 害 or イオン 化 促 進 例 )ある 標 準 物 質 を 超 純 水 と 含 マトリックス 液 ( 河 川 水 など)に 溶 解 LC-MS 分 析 した 時 の 試 料 成 分 のマス(SIM)クロマトグラム 試 料 成 分 ピーク マトリックス 成 分 ピーク 未 分 離 のマト リックス 成 分 に よるイオン 化 阻 害 標 準 試 料 ( 超 純 水 溶 液 ) 標 準 試 料 (マトリックス 溶 液 )
LC/MSによる 定 量 分 析 の 注 意 点 2 イオン 強 度 の 長 期 安 定 性 :イオン 源 汚 染 による 感 度 低 下 例 )ある 標 準 物 質 を 血 漿 試 料 に 溶 解 100 回 連 続 でLC-MS 分 析 した 時 の 試 料 成 分 のマス(SIM)クロマトグラム 試 料 成 分 ピーク イオン 源 汚 染 による 検 出 感 度 の 低 下 測 定 1 回 目 測 定 100 回 目
LC/MSによる 定 量 分 析 内 標 の 利 用 安 定 同 位 体 ( 2 H, 13 Cなど) 標 識 化 合 物 が 望 ましい イオン 源 汚 染 による 感 度 低 下 夾 雑 成 分 によるイオン 化 阻 害 補 正 可 能!
分 析 上 の 注 意 点 ノウハウ
試 料 前 処 理 基 本 的 にはLC 分 析 と 同 じ ただし 幾 つか 注 意 点 が... 1 洗 浄 済 みのガラス 器 具 を 使 用 する 時 洗 剤 で 洗 った 器 具 は 界 面 活 性 材 残 存 の 可 能 性 中 性 洗 剤 で 洗 浄 したガラス 器 具 内 壁 の 残 存 成 分 をメタノールで 抽 出 LC-MSで 分 析
試 料 前 処 理 つづき 2 プラスチック 製 サンプルチューブの 使 用 内 壁 からの 溶 出 成 分 に 注 意!! MS[1];0.620..0.887;ESI+;TubeTest09 強 度 (14,000) x10 3 強 度 (13966) 202.16 B 社 製 MS[1];0.439..0.636;ESI+;TubeTest03 強 度 強 (500) 度 (531) A 社 製 500 338.33 226.93 10 0 719.38 500 1000 1500 質 量 電 荷 比 (m/z) m/z 566.85 726.42 0 500 1000 1500 質 量 電 荷 比 (m/z) m/z
TIC[1]; / APCI+ / MeOH_APCI_001 強 度 (11500) x10 3 0.065 10 測 定 準 備 セプタムキャップからの 溶 出 物 に 注 意! バイアルにメタノールを 注 入 セプタムキャップをして メタノールを2 回 続 けて 測 定 TIC[1]; / APCI+ / MeOH_APCI_001_01 x10 3 強 度 (83900) 80 0.064 6.692 1 回 目 2 回 目 2 0 0 10 20 経 過 時 間 [min] 1 回 目 の 注 入 時 にセプタムの 破 片 がバイ アルに 落 ち ポリメチルシロキサンが 溶 出 したと 考 えられる MS[1];18.620..18.820;-1.0*MS[1];18.160..18.260; / ESI+ / 1105_esi+_0002 強 度 (2043) 2000 1000 0 74 m/z 500 1000 1500 質 量 電 荷 比 (m/z)
移 動 相 溶 媒 通 常 のHPLCで 良 く 用 いられるリン 酸 バッ ファーなどの 不 揮 発 性 緩 衝 液 は ニードルな どの 目 詰 まり, 塩 析 出 に 伴 う 感 度 低 下,イオ ン 化 阻 害 などの 理 由 からLC/MSには 適 さな い 有 機 溶 媒 に 関 しても イオン 源 の 種 類 (ESIか APCIか)によっては シグナルが 安 定 しない 感 度 が 悪 いなどの 理 由 から 使 用 が 推 奨 され ない 溶 媒 もある
推 奨 される 緩 衝 液 酢 酸 ギ 酸 (0.1%): LC/MSで 最 も 汎 用 的 に 使 用 される 緩 衝 液 としてより 正 イオン 測 定 におけるプロトンドナーとして 用 いられる 酢 酸 アンモニウム(10mM): 酢 酸 ギ 酸 と 共 にLC-MSでは 最 もポピュラーな 緩 衝 液 酸 性 物 質 に 弱 いイオンペア 効 果 を 示 す TFA (0.1% 以 下 ):ペプチドなどアミン 系 化 合 物 に 適 する 酸 性 度 が 高 すぎる ために 負 イオン 測 定 には 適 さない 正 イオン 測 定 においても 若 干 の 感 度 低 下 を 招 くことがある まれに 負 イオン 測 定 でTFA 付 加 イオンとして 良 いデータ を 与 えることがある PFBA (0.1% 以 下 ) : TFAではODSに 保 持 され 難 い 親 水 性 の 高 いアミン 系 化 合 物 の 分 析 に 有 効 である オクタンスルホン 酸 の 代 わりになる ジブチルアミン 酢 酸 (5mM): カルボン 酸 やスルホン 酸 系 化 合 物 のイオンペア 試 薬 として 使 用 できる トリエチルアミン 酢 酸 (5mM):ジブチルアミン 酢 酸 と 同 様 に 使 用 される N-H を 持 たないために LCラインやイオン 源 内 にコンタミし 難 い
推 奨 される 有 機 溶 媒 メタノール:アセトニトリルと 比 較 してカラム 圧 が 高 い 負 イオン 測 定 に 適 している 正 イオンESI 測 定 に 用 いると [M+Na] + イオンが 観 測 され 易 い アセトニトリル:メタノールよりも 若 干 溶 出 力 が 高 い 正 イオンESI 測 定 に 用 いると [M+NH 4 ] + イオンが 観 測 され 易 い エタノール:アセトニトリルよりも 更 に 溶 出 力 が 高 いが カラム 圧 が 非 常 に 高 くなる アセトン: 溶 出 力 が 高 く 水 にも 溶 けやすいので 疎 水 性 の 高 い 化 合 物 の ODSカラムでの 分 析 に 適 している THF:アセトンと 同 様 に 溶 出 力 が 高 い バックグラウンドイオンが 多 く 生 成 され 試 料 のイオン 化 に 悪 影 響 を 与 えることがあるので 注 意 が 必 要 クロロホルム: 溶 出 力 が 高 く 水 にほとんど 溶 けない アセトニトリル100% の 系 でもODSカラムに 吸 着 する 様 な 疎 水 性 の 高 い 化 合 物 の 分 析 に 用 いる
移 動 相 溶 媒 と 生 成 し 易 い 付 加 イオン イオン 化 法 極 性 移 動 相 溶 媒 生 成 し 易 い 付 加 イオン ESI + メタノール [M + H] +, [M + NH 4 ] +, [M + Na] +, [M + K] + + アセトニトリル [M + H] +, [M + NH 4 ] +, [M + Na] +, [M + K] + + 含 酢 酸 アンモニウム [M + H] +, [M + NH 4 ] + + 含 トリエチルアミンなど [M + H] +, [M + H + N(CH 2 CH 3 ) 3 ] + APCI + メタノール [M + H] +, [M + H + CH 3 OH] + + アセトニトリル [M + H] +, [M + H + CH 3 CN] + + 含 酢 酸 アンモニウム [M + H] +, [M + NH 4 ] + + 含 トリエチルアミンなど [M + H] +, [M + H + N(CH 2 CH 3 ) 3 ] + ESI - 酸 を 含 まない 系 [M H] -, [M + Cl] - - 含 酢 酸, 酢 酸 アンモニウムなど [M H] -, [M + CH 3 COO] - - 含 ギ 酸 [M H] -, [M + HCOO] - - 含 トリフロロ 酢 酸 [M H] -, [M + CF 3 COO] - APCI - 酸 を 含 まない 系 [M H] -, [M + Cl] - - 含 酢 酸, 酢 酸 アンモニウム [M H] -, [M + CH 3 COO] - - 含 ギ 酸 [M H] -, [M + HCOO] - - 含 トリフロロ 酢 酸 [M H] -, [M + CF 3 COO] -
ポンプからのバックグラウンド 新 品 のLCポンプと 使 い 込 まれたLCポンプにメタノールを 通 液 した 時 に 観 測 されたバックグラウンドスペクトル 例 使 い 込 まれたポンプ シリコーン 製 品 由 来 のバックグ ラウンドイオン 74 u 新 品 のポンプ
イオン 源 の 汚 れと 感 度 低 下 オリフィス 高 電 圧 (1~2 kv) リングレンズ キャピラリ イオンガイド オリフィス (コーン,キャピラリ) オリフィスの 汚 染 イオン 取 り 込 み 効 率 の 低 下 感 度 低 下
APIイオン 源 の 構 造
LCとMSの 接 続 カラム 出 口 からイオン 源 入 り 口 までのデッ ドボリュームが 出 来 るだけ 小 さくなるように 配 管 や 接 続 部 などに 気 を 配 る 特 にUV 検 出 器 とイオン 源 を 直 列 で 接 続 す る 場 合 UVセルの 容 量 が 重 要 セミミクロLCを 使 用 する 場 合 配 管 内 径 0.1~0.2 mm ゼロデッドユニオン ミクロ フローセルを 使 用 する
装 置 の 設 置 LCとMSは 可 能 な 限 り 近 くに 配 置 する HPLC HPLC MS MS
配 管 の 接 続 必 要 以 上 に 長 い 配 管 や 内 径 の 大 きな 配 管 は 使 用 しない カラム イオン 源 までは, 配 管 内 ボリュームが 最 小 になるよう 接 続 する カラムーイオン 源 までの 配 管 A) 50 mm 0.132 min B) 1000 mm スプレイヤーに 高 電 圧 を 印 加 するタ イプの 装 置 では 感 電 の 恐 れがあるた め, 金 属 の 配 管 は 使 用 しない ピーク ピーク 幅 が 広 がる がる 0.162 min
参 考 資 料 マススペクトロメトリーってなあに ( 質 量 分 析 学 会 編 国 際 文 献 印 刷 社 ) これならわかるマススペクトロメトリー ( 化 学 同 人 ) マススペクトロメトリー 関 連 用 語 集 (web 版 :http://www.mssj/indexjp.html) 液 クロ 龍 彪 犬 武 文 の 巻 ( 液 クロ 研 究 懇 談 会 編 丸 善 ) 液 クロ 実 験 How to マニュアル ( 液 クロ 研 究 懇 談 会 編 みみずく 舎 )
おわりに ご 質 問 は 以 下 まで!! E-mail: tyutaka@jeol.co.jp,