USB ExoSAP-IT PCR product Clean-up Reagent Product Guide アフィメトリクスは USB ExoSAP-IT の 唯 一 のサプライヤーです
ExoSAP-IT とは? 未 反 応 のプライマーおよび dntps を 酵 素 反 応 により 除 去 する ワンステップの PCR 産 物 精 製 用 試 薬 です! ExoSAP-IT は DNA シークエンシングや 一 塩 基 多 型 (SNP) 解 析 などの 下 流 のアプリケーションに 用 いるた めに 設 計 された シンプルかつ 迅 速 な PCR 精 製 試 薬 です PCR 増 幅 後 PCR 反 応 液 中 に 未 反 応 の dntps やプライマーが 残 っていると 下 流 アプリケーションの 妨 げになります ExoSAP-IT は これらの 混 入 物 を 除 去 します 製 品 の 特 長 ワンチューブ/ワンステップの PCR 産 物 精 製 -ExoSAP-IT を PCR 産 物 に 直 接 加 えるだけ 混 在 しているプライマーと dntps を 除 去 - 下 流 のアプリケーションへの 影 響 なし 処 理 後 はそのままシークエンス 等 のステップに 使 用 可 能 PCR サンプルのロスなし 短 鎖 長 鎖 の PCR 産 物 をいずれも 100% 回 収 スピンカラム 不 使 用 - 収 量 は 増 加 時 間 とコストを 削 減 1
プロトコール ExoSAP-IT 2μl を PCR 産 物 5μl に 直 接 添 加 し 37 で 15 分 間 処 理 します その 後 15 分 間 80 に 加 熱 し すべての 酵 素 を 不 活 化 します ( 図 1) ExoSAP-IT で 必 要 なのは たった 1 回 のピペッティングと 2 回 のインキュベーションだけです 必 要 なのはシ ンプルなピペット 操 作 だけなので 手 動 でもロボットでも 多 くのサンプルを 一 度 に 処 理 できます PCR 産 物 に ExoSAP-IT を 加 えるだけで 30 分 以 内 にシークエンシングや SNP 解 析 を 行 うことができます 図 1 ExoSAP-IT による PCR 産 物 処 理 の 概 要 原 理 ExoSAP-IT では PCR 産 物 から 不 要 な dntps やプライマーを 除 去 するため 特 別 な 組 成 のバッファーと 2 つの 加 水 分 解 酵 素 エキソヌクレアーゼ I(Exonuclease I)および Shrimp 由 来 アルカリホスファターゼ( 組 換 え 体 rsap)を 利 用 します Exonuclease I は PCR 反 応 後 に 残 存 した 一 本 鎖 Primer および 不 要 な 一 本 鎖 DNA を 除 去 します rsap は PCR 混 合 物 に 残 留 した dntp を 除 去 します 2
データ 1 カラム 法 G 社 酵 素 法 商 品 との 比 較 ExoSAP-IT 試 薬 は 蛍 光 または 放 射 性 標 識 による DNA シークエンシングや SNP 解 析 その 他 過 剰 なヌク レオチドやプライマーを 含 まない PCR 産 物 を 必 要 とするアプリケーションの 前 の 効 果 的 な 精 製 方 法 として 使 用 できます 下 記 のデータは ExoSAP-IT 試 薬 カラム G 社 製 品 のいずれかの 方 法 で 精 製 した PCR 産 物 の 下 流 プロセ スの 結 果 を 示 したものです ExoSAP-IT 試 薬 のデータには ミスコールやフレームシフト 変 異 がありません 図 2 図 3 G 社 製 品 図 2:1,007bp の PCR 産 物 の 蛍 光 シークエンシングの 結 果 1,007 bp の 断 片 を 増 幅 し ExoSAP-IT 試 薬 ( 上 段 )または G 社 製 品 ( 下 段 )で 処 理 し シークエンシングを 行 いました フェログラムを 見 ると ExoSAP-IT 試 薬 ではミスコールがないのに 対 して G 社 製 品 では 25 26 30 39 番 目 に 4 カ 所 のミスコールが 認 められます PCR 産 物 5 l は ExoSAP-IT 試 薬 2 l または G 社 製 品 の 2 本 のチューブに 含 まれる Exo I を 1 l と alkaline phosphatase 1 l で 処 理 しました 注 :4 カ 所 のミスコールのうち 2 カ 所 は フレームシフト 図 3:100 bp の puc18 PCR 断 片 を -20 フォワードプライマーを 用 いて 蛍 光 シークエンシング 試 薬 により 蛍 光 シークエンシングした 結 果 (a)exosap-it 試 薬 (b)pcr 用 に 設 計 されたカラムを 使 用 して PCR 精 製 (b)でみられるベースミスコー ルは カラム 使 用 時 に 短 い PCR 産 物 が 低 収 率 であることに 起 因 するものです 3
データ 2 サンプルロスなし ExoSAP-IT の 使 用 により ゲルやカラム 精 製 沈 降 分 離 ろ 過 ビーズ/ 磁 気 分 離 は 一 切 不 要 になります ExoSAP-IT では 短 鎖 および 長 鎖 の PCR 産 物 をいずれも 100% 回 収 します( 図 4) 図 4 図 4: ExoSAP-IT によるサンプルロスのない PCR 産 物 処 理 ヒトゲノム DNA からシングルコピーのターゲットを 増 幅 HES-1(125 bp) numb (455 bp) NRAGE (1.55 kb) numb (4.6 kb)についてそれぞれ ExoSAP-IT 処 理 前 (pre)および 処 理 後 (post)の PCR 産 物 を 1.5%アガロースゲル 電 気 泳 動 しました M は DNA マーカーレーンです 様 々なサイズの PCR 産 物 を (125 bp の 断 片 でさえも) サンプルロスなく ExoSAP-IT で 処 理 できることに 注 目 してください 4
FAQ (よくある 質 問 ) ExoSAP-IT 処 理 後 の PCR 産 物 の 回 収 率 はどれだけですか? ExoSAP-IT 処 理 では PCR 産 物 の 回 収 率 は 100%になり 残 留 プライマーや 未 結 合 ヌクレオチドを 含 まな い 産 物 が 得 られます この PCR 精 製 法 は 他 のクリーンアップ 法 よりはるかに 優 れているため ExoSAP-IT は 下 流 プロセスで 使 用 する 前 に PCR 産 物 をクリーニングするための 方 法 として 信 頼 性 が 高 く 簡 便 なもの となっています ExoSAP-IT 処 理 は 1 本 のチューブ 内 で 完 結 するので カラムを 用 いた 精 製 法 のようにサン プルのロスが 生 じる 心 配 がありません ExoSAP-IT 試 薬 は シークエンシング 前 の PCR 産 物 のクリーンアップに 使 用 できますか? できます 研 究 現 場 では DNA シークエンシングに 先 立 つ PCR 産 物 のクリーンアップに ExoSAP-IT が 広 く 使 用 されています カラムを 用 いた 精 製 法 は PCR 産 物 の 収 率 を 低 下 させ DNA シークエンシングのよう な 下 流 アプリケーションの 成 功 率 を 低 下 させることがあります ExoSAP-IT による PCR 産 物 の 処 理 では 貴 重 なサンプルが 100% 回 収 され 高 い 成 功 率 でシークエンシングに 用 いることができます 一 塩 基 多 型 (SNP) 分 析 の 前 に PCR 産 物 からの 未 結 合 のプライマーとヌクレオチドを 分 解 するために ExoSAP-IT クリーンアップを 使 用 することはできますか? できます ExoSAP-IT 試 薬 は PCR 産 物 から 過 剰 なプライマーやヌクレオチドを 除 去 するので 面 倒 な 問 題 を 起 こさずに SNP 分 析 を 実 施 することができます Affymetrix では 研 究 者 向 けに SBE クリーンアップ 試 薬 [PN 78260] も 提 供 しています これは ExoSAP-IT 試 薬 を Beckman Coulter SNPwareR Core 試 薬 キット [PN 101-04-300] と 組 み 合 わせて 使 用 するために 最 適 な 組 成 に 調 製 したものです 複 数 の PCR サンプルを 同 時 に 処 理 するために ExoSAP-IT を 使 用 することはできますか? できます ExoSAP-IT は 複 数 の PCR サンプルを 迅 速 簡 便 確 実 にクリーニングすることができます 1 本 のチューブの 中 で たった 1 回 のピペット 操 作 と 2 回 の 短 いインキュベーションだけで PCR 産 物 を 処 理 します 96 穴 のプレート 全 体 を 迅 速 にクリーンアップし サンプルロスを 生 じることなく 下 流 アプリケーシ ョンに 使 用 することができます In vitro トランスクリプションに 使 用 する PCR 産 物 の 処 理 に ExoSAP-IT 法 を 用 いることはできますか? できます ExoSAP-IT 試 薬 では 未 結 合 プライマーを 含 まない PCR 産 物 が 得 られます プライマーの 中 に その 後 のトランスクリプション 反 応 に 用 いる RNA ポリメラーゼプロモーターと 同 じものが 含 まれている 場 合 は とくにこのことが 重 要 になります ExoSAP-IT で 処 理 を 行 った 場 合 は 過 剰 なプライマーからの 転 写 で はなく 目 的 とする PCR 産 物 からの 転 写 だけが 確 実 に 起 こります プローブを 作 成 する 5 - 末 端 反 応 の 前 に PCR 産 物 中 の 未 結 合 プライマーとヌクレオチドを 分 解 するために ExoSAP-IT 試 薬 を 用 いることはできますか? ExoSAP-IT 試 薬 は エキソヌクレアーゼ I と Shrimp アルカリホスファターゼを 含 んでいます エキソヌク レアーゼ I はモノおよびジヌクレオチドを 生 成 し Shrimp アルカリホスファターゼは 無 機 リン 酸 とピロリン 酸 を 生 成 します モノおよびジヌクレオチドは キナーゼ 反 応 で PCR 産 物 と 競 合 します 無 機 リン 酸 とピロ 5
リン 酸 もキナーゼ 活 性 を 阻 害 することがあります その 結 果 ExoSAP-IT 処 理 後 のキナーゼ 反 応 でのラベリ ング 効 率 が 低 下 することがあります PCR 産 物 からのプライマーダイマーの 消 化 に ExoSAP-IT 処 理 を 用 いることができますか? ExoSAP-IT 試 薬 は dsdna を 消 化 しません そのため PCR 産 物 とプライマーダイマーは 消 化 されないま まの 状 態 で 残 ります PCR 反 応 からの ssdna プライマー および 未 使 用 ヌクレオチドは 効 率 よく 除 去 さ れます プライマーダイマーを 形 成 させないためには HotStart-ITR 結 合 タンパク 質 [PN 71194] を PCR に 適 した DNA ポリメラーゼと 併 用 することで 収 率 と 特 異 性 の 向 上 を 図 ることをお 勧 めします プライマー 設 計 と PCR 条 件 を 最 適 化 することも 場 合 によっては 効 果 的 です ExoSAP-IT の 使 用 期 限 は 何 年 間 ですか? 製 品 に 記 載 されています Assay Date から 2 年 間 が 使 用 期 限 になります ExoSAP-IT の 推 奨 保 管 温 度 はどれだけですか? ExoSAP-IT は -20 で 保 管 し 使 用 時 に-20 から 出 したときには かならず 氷 の 上 に 置 いてください ExoSAP-IT はドライアイスで 冷 却 して 出 荷 されるため 凍 結 していることがあります ExoSAP-IT は 8 回 まで 凍 結 と 解 凍 を 繰 り 返 しても 活 性 が 著 しく 低 下 しないことが 機 能 安 定 性 試 験 によって 確 認 されています ExoSAP-IT を 何 回 も 凍 結 解 凍 することは 避 けてください この 試 薬 は -20 では 凍 結 しません ExoSAP-IT は 室 温 でどれだけの 期 間 活 性 を 保 ちますか? 室 温 の 保 存 用 緩 衝 液 中 で 2 週 間 のインキュベーションを 行 った 場 合 98%の 活 性 を 保 持 します 活 性 は 活 性 アッセイによって 測 定 され 機 能 アッセイによって 確 認 されています ExoSAP-IT は 4 でどれだけの 期 間 活 性 を 保 ちますか? 機 能 アッセイによると 4 の 保 存 用 緩 衝 液 中 で 2 カ 月 のインキュベーションを 行 った 場 合 95%の 活 性 を 保 持 します 6
製 品 および 関 連 製 品 製 品 名 容 量 製 品 コード 100 反 応 分 78200 200UL ExoSAP-IT PCR Product Cleanup 500 反 応 分 78201 1ML 2,000 反 応 分 78202 4X1 ML 5,000 反 応 分 78205 10ML 関 連 製 品 Shrimp Alkaline Phosphotase, Recombinant (rsap) 1,000 回 分 78390 1000UN 5,000 回 分 78390 5000UN Exonuclease l, Standard concentration 5,000 回 分 70073X 5000UN 2,500 回 分 70073Z 2500 UN 100 反 応 分 70995 PCR Product Pre-Sequencing Kit 500 反 応 分 70996 2,000 反 応 分 70997 保 存 ドライアイス 同 梱 にて 発 送 いたします -20 度 で 保 存 してください 本 製 品 は 試 験 研 究 用 です 診 断 の 目 的 には 使 用 できません アフィメトリクス ジャパン 株 式 会 社 105-0013 東 京 都 港 区 浜 松 町 1-24-8 ORIX 浜 松 町 ビル 7F TEL:03-6430-4020 FAX:03-6430-4021 E-mail:salesjapan@affymetrix.com ホームページ:http://www.affymetrix.com/jp/ BR1302 01-02 7