Post-bisulfite Adaptor Taggingプロトコールリビジョン 12

試 薬 類 Qubit dsdna BR Assay Kit (ライフテクノロジーズ, # Q32850) Qubit dsdna HS Assay Kit (ライフテクノロジーズ, # Q32851) Qubit ssdna Assay Kit (ライフテクノロジーズ, # Q10212) Agencourt AMPure XP (ベックマンコールター, # A63880) 一 般 的 な 10 PCR buffer (100 mm Tris-HCl (ph 8.3), 500 mm KCl, 15 mm MgCl2) アジレント RNA 6000 Pico Kit (アジレント, #5067-1513) 10 mm Tris-acetate, ph 8.0 10 mm Tris-HCl, ph 7.5 Klenow Fragment (3 5 exo ) (NEB, #M0212M) 一 般 的 な 濃 度 の 酵 素 (5,000 U/ml:NEB, #M0212S や#M0212L)ではなくて 必 ず 10 倍 濃 度 標 品 (50,000 U/ml: #M0212M)を 使 用 すること Bst DNA polymerase large fragment (NEB, #M0275S) Exonuclease I (NEB, #M0293S) Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes, #F-540S) EZ DNA Methylation-Gold Kit (ZYMO Research, #D5005) Dynabeads M-280 Streptavidin (ライフテクノロジーズ, #112-05D) 2 BW(Li) Solution (50 ml) LiCl * 6.3 g 1 M Tris-HCl, ph 8.0 0.5 ml 500 mm EDTA 0.1 ml * LiCl の 溶 解 は 発 熱 を 伴 う 溶 液 の 突 沸 を 防 ぐため 秤 量 した LiCl の 粉 末 を 50ml の 遠 沈 管 に 移 した 後 これを 40ml の 水 で 一 気 に 溶 解 すると 良 い 完 全 に LiCl の 粉 が 溶 けた 後 に Tris と EDTA を 加 え 水 で 50ml にメスアップする 0.1 N NaOH 溶 液 10N の NaOH 溶 液 を 使 用 直 前 に 希 釈 する KAPA Library Quantification Kit for Illumina (KAPA, # KK4824 あるいは qpcr のプラットフォーム 専 用 の 相 当 品 でも 良 い) Hybridization Buffer A (50 ml) 1

5 M NaCl 9 ml ( 最 終 濃 度 900 mm) 1 M Tris-HCl, ph 7.4 9 ml ( 最 終 濃 度 180 mm) ddh2o 32 ml オリゴヌクレオチド (OPC グレード 品 で 良 い) Bio-PEA2-N4 (100 µm) 5 -biotin-aca CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TCT NNN N-3 PE-reverse-N4 (100 µm) 5 -CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN N-3 PBAT-PE-iX-N4 (いずれも 100 µm) 5 -CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT XXX XXX GTA AAA CGA CGG CCA GCA GGA AAC AGC TAT GAC NNN N-3 下 線 を 引 いた6 塩 基 を 以 下 のインデックス 配 列 で 置 換 したオリゴヌクレオチドを 用 意 する これらの 配 列 はイルミナ 社 TruSeq DNA LT Sample Prep Kit で 用 いられているインデック ス 配 列 の 相 補 鎖 に 相 当 するので これらを 用 いることによって 上 記 キットと 同 一 インデッ クス 番 号 をそのまま 利 用 することが 出 来 る なおインデックス 番 号 17 24 および 26 は 上 記 キットでも 欠 番 である インデックス 配 列 インデックス 配 列 インデックス 配 列 1 CGTGAT 9 CTGATC 18 GCGGAC 2 ACATCG 10 AAGCTA 19 TTTCAC 3 GCCTAA 11 GTAGCC 20 GGCCAC 2

4 TGGTCA 12 TACAAG 21 CGAAAC 5 CACTGT 13 TTGACT 22 CGTACG 6 ATTGGC 14 GGAACT 23 CCACTC 7 GATCTG 15 TGACAT 25 ATCAGT 8 TCAAGT 16 GGACGG 27 AGGAAT Primer 3 (100 µm) 5 -AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T-3 PBAT-PE-Seq (100 µm) 5 -GTA AAA CGA CGG CCA GCA GGA AAC AGC TAT GAC-3 PBAT-PE-Idx (100 µm) 5 -GTC ATA GCT GTT TCC TGC TGG CCG TCG TTT TAC-3 プラスチック 消 耗 品 チューブ 全 てのステップにおいて 低 吸 着 タイプの 1.5-ml および 0.2-ml のチューブを 使 用 する チップ ストレプトアビジンビーズをチップ 内 に 吸 い 込 む 操 作 では 低 吸 着 タイプのチ ップを 使 用 する 3

装 置 DynaMag-2 Magnet (ライフテクノロジーズ) あるいは 相 当 品 SPRIPlate 96R 磁 石 プレート(ベックマンコールター)あるいは 相 当 品 トミーMX-301 冷 却 微 量 遠 心 機 あるいは 相 当 品 アジレント Bioanalyzer 2100 Qubit Fluorometer or Qubit 2.0 Fluorometer (ライフテクノロジーズ) TOMY PMC-060 小 型 遠 心 機 あるいは 相 当 品 ABI9700 サーマルサイクラーあるいは 相 当 品 StepOnePlus リアルタイム PCR システム (アプライドバイオシステムズ) あるい は 相 当 品 XCell SureLock Mini-Gel (ライフテクノロジーズ)あるいは 相 当 品 電 気 泳 動 用 のパワーサプライ 4

サーマルサイクラーで 使 用 するプログラム プログラム 1 (バイサルファイト 処 理 用 セクション II) 1. 98 C で 10 分 2. 64 C で 2 時 間 30 分 3. 4 C でソーク プログラム 2 ( 第 1 鎖 合 成 用 セクション III) 1. 94 C で 5 分 2. 4 C で 20 分 3. 4 C から 37 C まで 1 C/ 分 で 温 度 を 上 げる* 4. 37 C で 1 時 間 30 分 5. 70 C で 10 分 6. 4 C でソーク プログラム 3 ( 第 2 鎖 合 成 用 セクション VI) 1. 94 C で 5 分 2. 4 C で 20 分 3. 4 C から 37 C まで 1 C/ 分 で 温 度 を 上 げる* 4. 37 C で 30 分 5. 70 C で 10 分 6. 4 C でソーク プログラム 4 ( 溶 出 用 セクション VII) 1. 94 C で 5 分 2. 55 C で 15 分 3. 68 C で 30 分 4. 4 C でソーク *サーマルサイクラーで+1 / 分 での 温 度 変 化 の 制 御 が 難 しい 場 合 は 2ステップのサイクルプロ グラムを 使 用 してこれを 実 現 することが 可 能 である 最 初 のサイクルでは 4.0-30 秒 と 4.5-30 秒 の2ステップを 実 施 し 以 降 のサイクルではサイクル 毎 に 1 ずつそれぞれのステップの 温 度 を 上 昇 させれば 33 サイクル 後 には 37 に 到 達 する 5

I. DNA 濃 度 の 測 定 (1 日 目 ) DNA 濃 度 の 正 確 な 算 出 は 非 常 に 重 要 である Qubit dsdna BR Assay Kit を 用 いた 定 量 が 手 軽 で 十 分 な 精 度 がある OD260 の 測 定 は この 波 長 領 域 に 他 の 生 体 物 質 の 吸 収 帯 が 重 なり DNA 量 を 過 大 に 見 積 もってしまうため 避 けること 1. サンプル DNA の 濃 度 を Qubit dsdna BR Assay Kit と Qubit Fluorometer を 使 用 して 定 量 する II. バイサルファイト 処 理 (1 日 目 ) 操 作 が 容 易 であることから ルーチンワークでは 100ng 程 度 の DNA を 開 始 量 にすると 良 い しかし 鋳 型 調 製 は~1ng 程 度 から 始 めるのが 最 も 効 率 的 であるため より 効 率 的 な 調 製 を 行 う 必 要 がある 場 合 は バイサルファイト 処 理 後 の DNA をいくつかのチューブに 分 けたうえで 第 1 鎖 合 成 (ステップ III)に 取 りかかると 良 いだろう 以 下 のプロトコールは ZYMO Research 社 の EZ DNA Methylation-Gold Kit に 基 づくが 一 部 変 更 箇 所 がある 1. 900 µl のミリ Q 水 50 µl の M-Dissolving Buffer および 300 µl の M-Dilution Buffer を CT Conversion Reagent のチューブに 加 え 混 合 する 高 収 率 で 効 率 的 なバイサルファイト 処 理 を 行 うためには CT Conversion Reagent は 用 時 調 製 すべきである 2. CT Conversion Reagent のチューブを 室 温 で 10 分 間 ローテーターに 設 置 して 十 分 溶 解 させる 3. 以 下 の 内 容 を 混 合 する CT Conversion Reagent 130 µl ミリ Q 水 (20 x) µl サンプル DNA x µl 4. 上 記 溶 液 を 50 µl ずつ 3 本 の 0.2-ml チューブに 分 注 する 5. サーマルサイクラーにセットしプログラム 1 を 開 始 する 6. キット 付 属 のスピンカラムをコレクションチューブに 乗 せ 600 µl の M-Binding Buffer をカラムに 分 注 する 6

7. ステップ 5 の 処 理 が 終 わったサンプルをカラムに 添 加 した M-Binding Buffer に 全 量 加 えた 後 キャップを 閉 めて 数 回 転 倒 混 和 を 行 って 十 分 混 合 する 8. 微 量 遠 心 機 の 最 高 回 転 数 ( 10,000 g)で 30 秒 間 遠 心 する 9. フロースルーを 再 度 カラムに 乗 せる EZ DNA Methylation-Gold キットに 付 属 するシリカカラムでは 時 々 溶 液 がレジンと 接 触 し ないままにスッポ 抜 けることがある 確 実 に DNA を 回 収 するために カラムの 状 態 をよく 確 認 してから 操 作 を 始 めること 上 記 のようにフロースルーを 再 度 カラムに 乗 せて 遠 心 する 操 作 はこ のような 事 故 をなるべく 少 なくするための 工 夫 の 一 つである 10. 微 量 遠 心 機 の 最 高 回 転 数 で( 10,000 g) 30 秒 間 遠 心 する 11. フロースルーを 捨 てる 12. 100 µl の M-Wash Buffer を 加 え 微 量 遠 心 機 の 最 高 回 転 数 で 30 秒 間 遠 心 し フ ロースルーを 捨 てる 13. 200 µl の M-Desulphonation Buffer をカラムに 乗 せ 室 温 で 15 分 間 インキュベー ションを 行 う 14. 微 量 遠 心 機 の 最 高 回 転 数 で 30 秒 間 遠 心 し フロースルーを 捨 てる 15. 200 µl の M-Wash Buffer をカラムに 乗 せ 最 高 回 転 数 で 30 秒 間 遠 心 し フロー スルーを 捨 てる 16. ステップ 15 をもう 一 度 繰 り 返 し カラムを 空 の 新 しいチューブに 乗 せる 17. 22 µl の M-Elution Buffer を 直 接 レジンに 乗 せ 室 温 で 2 分 間 インキュベーション した 後 最 高 回 転 数 で 30 秒 間 遠 心 して DNA を 溶 出 する 溶 出 の 容 積 (22 µl) には Qubit ssdna Assay Kit での 定 量 のための 1 µl と RNA 6000 Pico Kit を 用 いたアジレント Bioanalyzer でのクオリティチェック(QC)のための 1 µl が 含 まれてい る 30 ng 以 下 の DNA から 鋳 型 調 製 を 開 始 した 場 合 には Qubit も Bioanalyzer も 検 出 限 界 以 下 になるなので これらの QC ステップは 省 き ステップ 16 の 溶 出 容 積 を 20 µl に 減 らす な お 上 記 操 作 による 通 常 の 収 率 は 開 始 DNA の 30%から 70%である また 得 られる DNA は 100~1,000 nt で 600 nt にピークを 有 するスメアーパターンの 分 布 を 示 す バイサルファイト 処 理 後 の DNA は 不 安 定 であることから このステップで 実 験 を 停 止 してはな らない 次 の 第 1 鎖 合 成 に 最 適 な 停 止 点 があるので そこまで 進 めること III. 第 1 鎖 合 成 (1 日 目 ) 1. 以 下 の 第 1 鎖 合 成 用 反 応 溶 液 を 準 備 する 7

10 NEBuffer 2 5 µl 2.5 mm dntps 5 µl ミリ Q 水 16 µl Bio-PEA2-N4 (100 µm) 4 µl バイサルファイト 処 理 済 DNA 20 µl 2. チューブをサーマルサイクラーに 乗 せプログラム 2 を 開 始 する 3. プログラム 2 のステップ2(4 C でのインキュベーションステップ)の 開 始 5 分 後 に プログラムをポーズさせ チューブをサーマルサイクラーから 取 り 出 し 1.5 µl の Klenow Fragment (3 5 exo )(10 倍 濃 度 品 )を 上 記 溶 液 に 添 加 し よく 混 合 す る 4. チューブをサーマルサイクラーに 再 び 乗 せ 停 止 していたプログラム 2 を 再 開 させ 第 1 鎖 合 成 を 進 める この 部 分 が 実 験 の 停 止 に 適 した 部 分 である 酵 素 を 加 えた 後 はサーマルサイクラーのプロ グラムに 任 せて 次 の 日 まで 鋳 型 調 製 のことは 忘 れてしまおう なお 反 応 後 のチューブは 4 C あるいは 20 C で 保 存 可 能 である これは このステップではバイサルファイト 処 理 DNA が 2 本 鎖 化 されており かつ 過 剰 量 のプライマーがチューブ 壁 への 吸 着 による 損 失 を 抑 えてくれる 効 果 によるものと 考 えられる IV. 過 剰 なプライマーの 除 去 (2 日 目 ) 1. 第 1 鎖 合 成 の 反 応 液 (~50 µl)を 新 しい 1.5-ml のチューブに 移 し 50 µl の AMPure XP を 添 加 してよく 混 合 する この 混 合 量 比 (つまり DNA 溶 液 : AMPure XP 比 = 1:1)では 200 bp 以 下 の DNA 断 片 が 効 率 的 に 除 かれる 第 1 鎖 合 成 で 合 成 された DNA は 200 bp 以 上 の 断 片 である 一 方 で プライマーダイ マー 等 のサイズは 100 bp 以 下 である 2. チューブを 室 温 で 10 分 間 インキュベーションする 3. チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 め 上 清 を 除 く 8

4. 200 µl の 75%エタノールを 加 えてビーズを 洗 浄 し 再 び 除 く 5. 45 µl の 10 mm Tris-acetate (ph 8.0)を 加 えてボルテックスし ビーズをよく 分 散 させる 6. 軽 く 遠 心 した 後 チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 める 7. 上 清 を 新 しい 1.5-ml のチューブに 移 し 5 µl の 10 PCR Buffer と 50 µl の AMPure XP を 加 え よく 混 合 して 軽 くスピンダウンする 10 PCR Buffer を 加 えると AMPure XP による 精 製 の 再 現 性 と 回 収 率 が 良 くなる 8. チューブを 室 温 で 10 分 間 インキュベーションする 9. チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 め 上 清 を 除 く 10. 200 µl の 75%エタノールを 加 えてビーズを 洗 浄 し 再 び 除 く 11. 51 µl の 10 mm Tris-acetate (ph 8.0)を 加 え ボルテックスでよくビーズを 分 散 さ せ 軽 くスピンダウンして チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 め る 12. 上 清 を 新 しい 1.5-ml チューブに 移 す 13. 上 清 を 1 µl 使 い Qubit dsdna HS Kit を 用 いて DNA の 量 を 定 量 する このステップの 典 型 的 な 収 率 は 開 始 DNA 量 の 40%~60%の 値 となる 30 ng 以 下 の DNA か ら 鋳 型 調 製 を 開 始 した 場 合 には Qubit の 定 量 限 界 以 下 になるのでこのステップを 省 略 し ステ ップ 11 における 溶 出 の 容 積 を 50 µl に 減 らす V. ビオチン 化 標 識 された DNA のストレプトアビジンビーズ 上 への キャプチャー (2 日 目 ) 1. よく 懸 濁 した Dynabeads M280 ストレプトアビジンビーズ 20 µl を 1.5-ml チュー ブに 取 り チューブをマグネットスタンドに 立 てる 2. 上 清 を 除 き 2 BW(Li) solution を 50 µl 加 えてビーズを 懸 濁 する 3. セクション IV の 溶 出 DNA に 対 して ビーズ 懸 濁 液 を 加 える 4. 室 温 でゆっくり 回 転 させながらインキュベーションする 5. チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 め 上 清 を 除 く 9

6. 180 µl の 2 BW(Li) solution をビーズに 加 え ボルテックス 後 軽 くスピンダウン する 7. チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 め 上 清 を 除 く 8. 180 µl の 0.1 N NaOH 溶 液 を 加 えてボルテックスし 室 温 で2 分 間 インキュベー ションし 軽 くスピンダウンする 9. チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 め 上 清 を 除 く 10. ステップ 8 と 9 をもう 一 度 繰 り 返 す 11. 180 µl の 2x BW(Li) solution をビーズに 加 え ボルテックス 後 軽 くスピンダウン する 12. チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 め 上 清 を 除 く 13. 180 µl の 10 mm Tris-HCl (ph 7.5) をビーズに 加 え ボルテックス 後 軽 くスピン ダウンする VI. 第 2 鎖 合 成 (2 日 目 ) 1. チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 め 上 清 を 除 く 2. 以 下 の 試 薬 を 混 ぜ 第 2 鎖 合 成 用 反 応 溶 液 を 準 備 する 10 NEBuffer 2 5 µl 2.5 mm dntps 5 µl ddh2o 36 µl PE-reverse-N4 (100 µm)(シングルエンド 用 ) 4 µl PBAT-PE-iX-N4 (100 µm)(インデックス 付 ペアエンド 用 ) 3. ビーズをボルテックスで 懸 濁 し ビーズ 懸 濁 液 を 新 しい 0.2-ml チューブに 移 す 4. サーマルサイクラーにチューブをセットしプログラム 3 を 開 始 する 5. プログラム 3 のステップ2(4 C でのインキュベーションステップ)の 開 始 5 分 後 にプログラムをポーズさせ チューブをサーマルサイクラーから 取 り 出 し 1.5 µl の Klenow Fragment (3 5 exo )(10 倍 濃 度 品 )を 上 記 溶 液 に 添 加 し よく 混 合 する 10

6. チューブをサーマルサイクラーに 再 び 乗 せ 停 止 していたプログラム 3 を 再 開 させ 第 2 鎖 合 成 を 進 める VII. 後 追 い 反 応 (2 日 目 ) 1. チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 め 上 清 を 除 く 2. 以 下 の 試 薬 をまぜ 後 追 い 反 応 溶 液 を 調 製 し ビーズに 加 える 10 ThermoPol Buffer 5 µl 2.5 mm dntps 5 µl ddh2o 40 µl Bst DNA polymerase large fragment 1 µl 3. 65 C で 30 分 間 インキュベーションする VIII. 鋳 型 DNA の 溶 出 / 二 本 鎖 化 (2 日 目 ) 1. チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 め 上 清 を 除 く 2. 以 下 の 試 薬 を 混 合 して 溶 出 / 二 本 鎖 化 反 応 液 を 調 製 する 5 Phusion HS Buffer 10.0 µl 2.5 mm dntps 5 µl ddh2o 35 µl Primer 3 (100 µm) 0.4 µl Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase 1 µl このステップには 溶 出 される DNA を 二 本 鎖 化 して SPRI ビーズによるサイズ 分 画 を 再 現 性 良 くするのみならず イルミナシークエンサでのブリッジ PCR に 必 要 なプライ マー 配 列 を 鋳 型 に 導 入 する 目 的 もある 3. プログラム 4 を 開 始 する 11

4. チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 め 上 清 を 新 しい 1.5-ml チュ ーブに 移 す 5. Exonuclease I を µl 加 え 37 で 30 分 間 と 70 で 10 分 間 インキュベーション する 6. 溶 出 DNA の µl を Qubit dsdna HS Kit を 使 って 定 量 する IX. サイズ 分 画 (2 日 目 ) 1. 溶 出 した DNA (50 µl)に 50 µl の AMPure XP を 加 え 混 合 して 軽 くスピンダウン する 2. 室 温 で 10 分 間 インキュベーションする 3. チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 め 上 清 を 除 く 4. 200 µl の 75%エタノールを 加 えてビーズを 洗 浄 し 再 び 除 く 5. 45 µl の 10mM Tris-acetate (ph 8.0)を 加 えてボルテックスし ビーズをよく 分 散 させる 6. 軽 く 遠 心 した 後 チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 める 7. 上 清 を 新 しい 1.5-ml のチューブに 移 し 5 µl の 10 PCR Buffer と 50 µl の AMPure XP を 加 え よく 混 合 して 軽 くスピンダウンする 8. チューブを 室 温 で 10 分 間 インキュベーションする 9. チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 め 上 清 を 除 く 10. 200 µl の 75%エタノールを 加 えてビーズを 洗 浄 し 再 び 除 く 11. 22 µl の 10 mm Tris-acetate (ph 8.0)を 加 え ボルテックスでよくビーズを 分 散 さ せ 軽 くスピンダウンして チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 め る 12. 上 清 を 新 しい 1.5-ml チューブに 移 す 13. 上 清 を 1 µl 使 って Qubit dsdna HS Kit を 用 いて DNA 量 を 定 量 する 通 常 このステップの 収 率 は 開 始 DNA の 20%~40%である 30 ng 以 下 の DNA から 開 始 した 場 合 には 定 量 の 限 界 以 下 になるのでこの QC のステップを 省 き ステップ 9 の 溶 出 容 積 を 21 µl に 減 らす 12

X. qpcr による 鋳 型 DNA の 定 量 (3 日 目 ) 1. 適 切 な qpcr 法 を 用 いて 鋳 型 中 の 有 効 鋳 型 分 子 のモル 量 を 正 確 に 測 定 する ステップ IX で 得 られる DNA 溶 液 中 には 鋳 型 分 子 の 他 に 10 倍 量 程 度 の 副 産 物 が 含 まれている したがって 蛍 光 法 ではなくて qpcr による 定 量 を 利 用 して 正 確 な 濃 度 を 求 めることが 非 常 に 重 要 である 我 々は 再 現 性 の 高 さと 簡 便 さから Library Quantification Kits for Illumina (KAPA biosystems)を 説 明 書 にしたがって 使 用 している この 時 の 収 量 は 通 常 開 始 DNA の 2~8% 程 度 である 100 ng の DNA から 開 始 した 場 合 通 常 20 fmol 程 度 の 鋳 型 分 子 に 相 当 す る 鋳 型 が 得 られることになる これは イルミナ HiSeq 2000 なら 20 レーン 分 MiSeq ならば 4 レーン 分 の 配 列 決 定 に 十 分 な 鋳 型 量 である 副 産 物 の 存 在 は 電 気 泳 動 による 鋳 型 DNA 分 子 のサイズ 決 定 も 困 難 にする そこで 鋳 型 そのも のではなくて その qpcr 産 物 を TBE-Urea 系 の 変 性 ポリアクリルアミドゲル 電 気 泳 動 で 分 析 すると 良 い 通 常 300 nt にピークを 有 する 200~500 nt のサイズ 分 布 を 示 す XI. 配 列 決 定 (3 日 目 ) インデックス 付 ペアエンドシーケンスを 行 う 際 には PBAT-PE-Seq をリード 2 用 プライマーミ ックスに PBAT-PE-Idx をインデックス 用 プライマーミックスに それぞれ 最 終 濃 度 0.5 µm になるように 添 加 すること 配 列 決 定 に 必 要 な 鋳 型 量 の 決 定 1. クラスター 形 成 に 必 要 な 鋳 型 量 を 以 下 の 式 とパラメータを 用 いて 計 算 する 装 置 名 HiSeq 2000 HiSeq 2500 High Output モード HiSeq 2500 cbot を 使 う Rapid Run モード 目 標 とする 鋳 型 の 最 終 濃 度 (pm) 10 * HiSeq 2500 cbot を 使 わ ない Rapid モ ード または MiSeq 13

目 標 とする 鋳 型 溶 液 の 体 積 (µl) 120 70 480 希 釈 前 の 鋳 型 のモル 濃 度 (pm) 加 える 鋳 型 の 体 積 = x (µl) 120 10 y *10 pm から 鋳 型 濃 度 の 最 適 化 を 行 うのが 良 いだろう Y 70 10 y 480 10 y cbot を 用 いる HiSeq 2000 あるいは HiSeq 2500 High Output Mode 用 の プロトコール(1レーン 分 ) 1. Hybridization Buffer A を 1.5-ml チューブに 分 注 し 氷 上 に 置 く 2. 2 N の NaOH 溶 液 を 10 N の NaOH 溶 液 を5 倍 希 釈 して 用 意 する 3. 配 列 決 定 用 の 鋳 型 を 以 下 の 組 成 で 混 ぜ 変 性 させる 鋳 型 DNA 溶 液 x µl ddh2o (19 x) µl 2 N NaOH 溶 液 1 µl 4. 室 温 で5 分 間 インキュベーションする 5. 100 µl の 氷 冷 した Hybridization Buffer A を 変 性 させた 鋳 型 に 加 え 混 合 して 氷 上 に 置 く 6. イルミナ 社 のプロトコールに 従 いクラスター 形 成 を 行 う バイサルファイト 変 換 された DNA では 極 端 に 偏 った 塩 基 組 成 のために 蛍 光 シグナルの 補 正 が うまくゆかないので フローセル 中 の1レーンを phix コントロールに 充 てねばならない cbot を 用 いる HiSeq 2500 Rapid Run Mode 用 のプロトコール(1レー ン 分 ) 1. Hybridization Buffer A を 1.5-ml チューブに 分 注 し 氷 上 に 置 く 2. 2 N の NaOH 溶 液 を 10 N の NaOH 溶 液 を5 倍 希 釈 して 用 意 する 3. 配 列 決 定 用 の 鋳 型 を 以 下 の 組 成 で 混 ぜ 変 性 させる 鋳 型 DNA 溶 液 x µl ddh2o (11 x) µl 2 N NaOH 溶 液 0.6 µl 4. 室 温 で5 分 間 インキュベーションする 14

5. 58 µl の 氷 冷 した Hybridization Buffer A を 変 性 させた 鋳 型 に 加 え 混 合 して 氷 上 に 置 く 6. イルミナ 社 のプロトコールに 従 い 用 意 した 70 µl の 8 pm phix コントロール 溶 液 を 加 え 混 合 する HiSeq 2500 の Rapid Run Mode では 蛍 光 シグナル 補 正 のためのコントロールレーンが 無 いので コントロールとなる 鋳 型 (phix コントロール)をサンプルに 混 ぜて 配 列 決 定 せねばならない 7. イルミナ 社 のプロトコールに 従 いクラスター 形 成 を 行 う cbot を 用 いない HiSeq 2500 Rapid Run Mode あるいは MiSeq 用 のプロ トコール 1. Hybridization Buffer A を 1.5-ml チューブに 分 注 し 氷 上 に 置 く 2. 2 N の NaOH 溶 液 を 10 N の NaOH 溶 液 を5 倍 希 釈 して 用 意 する 3. 配 列 決 定 用 の 鋳 型 を 以 下 の 組 成 で 混 ぜ 変 性 させる 鋳 型 DNA 溶 液 x µl ddh2o (76 x) µl 2 N NaOH 溶 液 4 µl 4. 室 温 で5 分 間 インキュベーションする 5. 400 µl の 氷 冷 した Hybridization Buffer A を 変 性 させた 鋳 型 に 加 え 混 合 して 氷 上 に 置 く 6. イルミナ 社 のプロトコールに 従 い 用 意 した 120 µl の 8 pm phix コントロール 溶 液 を 加 え 混 合 する HiSeq 2500 の Rapid Run Mode や MiSeq では 蛍 光 シグナル 補 正 のためのコントロールレーン が 無 いので コントロールとなる 鋳 型 (phix コントロール)をサンプルに 混 ぜて 配 列 決 定 せねば ならない 7. イルミナ 社 のプロトコールに 従 いクラスター 形 成 を 行 う 15

文 献 Miura, F., Enomoto, Y., Dairiki, R. & Ito, T. (2012) Amplification-free whole genome bisulfite sequencing by post-bisulfite adaptor tagging. Nucleic Acids Res. 40, e136. Kobayashi, H., Sakurai, T., Miura, F., Imai, M., Mochizuki, K., Yanagisawa, E., Sakashita, A., Wakai, T., Suzuki, Y., Ito, T., Matsui, Y. & Kono, T. (2013) High resolution DNA methylome analysis of primordial germ cells identifies gender-specific reprogramming in mice. Genome Res. 23, 616 627. Shirane, K., Toh, H., Kobayashi, H., Miura, F., Chiba, H., Ito, T., Kono, T. & Sasaki, H. (2013) Mouse oocyte methylomes at base resolution reveal genome-wide accumulation of non-cpg methylation and role of DNA methyltransferases. PLoS Genet. 9, e1003439. 16