微 小 がんの 発 見 と 発 現 分 子 診 断 を 目 指 した 複 数 分 子 同 時 イメージング 法 開 発 独 立 行 政 法 人 理 化 学 研 究 所 分 子 イメージング 科 学 研 究 センター 金 山 洋 介 背 景 がん 診 断 技 術 に 求 められることはより 微 小 ながんの 検 出 と 非 侵 襲 的 ながん 発 現 分 子 の 解 析 で ある がん 病 巣 の 早 期 発 見 は 浸 潤 転 移 の 可 能 性 を 低 減 し またその 分 子 発 現 を 知 ることで 効 果 的 な 治 療 法 選 択 が 可 能 と 考 えられる 現 在 がんの 早 期 発 見 には 18 F-FDG を 用 いた PET イメー ジングがよく 行 われるが グルコース 代 謝 の 亢 進 を 捉 えるため がん 組 織 特 異 的 でなく 糖 代 謝 が 活 発 な 部 位 などに 限 定 される 一 方 がん 発 現 分 子 診 断 にはバイオプシーが 行 われ 侵 襲 性 が 高 い 問 題 がある 治 療 の 進 行 や 浸 潤 転 移 による 分 子 発 現 変 化 に 合 わせた 効 果 的 な 治 療 法 を 選 択 するためには 非 侵 襲 的 に 繰 り 返 し 利 用 可 能 な 分 子 イメージング 診 断 法 が 有 効 である 我 々の 研 究 室 では 新 しい 分 子 イメージング 装 置 として 半 導 体 コンプトンカメラ GREI の 開 発 を 行 っ ている GREI は 既 存 の 分 子 イメージング 装 置 である PET や SPECT と 同 様 に 放 射 性 核 種 が 放 出 す るガンマ 線 によって 放 射 能 分 布 を 画 像 化 する 装 置 であるが 高 純 度 Ge 半 導 体 検 出 器 の 優 れたエ ネルギー 分 解 能 とコンプトンカメラの 原 理 によって 複 数 の 放 射 性 核 種 動 態 を 同 時 に 可 視 化 できる 革 新 的 な 装 置 である 個 々の 分 子 プローブをそれぞれ 別 のガンマ 線 エネルギーを 持 つ 放 射 性 核 種 で 標 識 することで 複 数 分 子 同 時 イメージングが 可 能 となる がんを 対 象 とした 複 数 分 子 同 時 イ メージングの 実 現 は 炎 症 とがんの 識 別 や 複 数 の 分 子 発 現 を 非 侵 襲 的 に 解 析 するなど 革 新 的 な 診 断 を 可 能 とする さらに 微 小 ながんは 細 胞 数 が 少 なく 即 ち 標 的 分 子 数 も 少 なくなるため 検 出 感 度 が 低 下 するが 複 数 分 子 同 時 イメージング 法 であれば 複 数 の 標 的 分 子 への 集 積 を 重 ね 合 わせることで 検 出 感 度 が 向 上 すると 考 えられる この 様 な 複 数 分 子 同 時 イメージングを 実 現 するには 装 置 開 発 だけなく 複 数 分 子 同 時 イメー ジングに 適 した 分 子 プローブの 探 索 と 開 発 が 必 要 である しかしながら 開 発 途 上 の GREI を 用 いてプローブ 開 発 を 行 うことは 困 難 であるため 小 動 物 用 PET を 用 いてプローブ 開 発 を 進 め 有 用 なプローブを GREI イメージングに 適 用 することを 考 えた 現 在 GREI イメージングには 数 時 間 以 上 の 撮 像 が 必 要 であるため 標 識 プローブにも 比 較 的 長 い 物 理 学 的 生 物 学 的 半 減 期 が 求 め られる このため 我 々はこれまでに PET イメージングと GREI イメージング 両 方 に 利 用 可 能 な ポジトロン 放 出 核 種 64 Cu( 半 減 期 12.7h)の 製 造 技 術 と キレート 分 子 (DOTA)を 用 いた 64 Cu 標 識 抗 体 分 子 プローブ 合 成 法 を 確 立 してきた これにより 抗 EGFR 抗 体 セツキシマブを 64 Cu 標 識 プロ ーブとし PET と GREI 両 方 で 同 一 の 担 がんモデルマウスを 撮 像 し EGFR 高 発 現 がんのイメー ジングに 成 功 した この 成 果 を 元 に がん 細 胞 に 高 発 現 する 様 々な 分 子 を 解 析 し それらに 対 す る 抗 体 分 子 プローブを 合 成 し 同 時 に 用 いることで 担 がんモデルマウスを 用 いた 複 数 分 子 同 時 イメージングを 実 現 することを 目 指 し 検 討 した - 15 -
各 種 がん 細 胞 株 の 分 子 発 現 解 析 がん 細 胞 株 として ヒト 扁 平 上 皮 がん 細 胞 株 ヒト 卵 巣 がん 細 胞 株 ラットグリ オーマ 細 胞 株 C6 マウス 乳 がん 細 胞 株 を 用 いた これらを 各 0.5~1 10 6 個 PBS またはマ トリゲルに 懸 濁 して BALB/c ヌードマウスに 皮 下 注 射 し 担 がんモデルマウスを 作 成 した この 担 がんマウスよりがん 部 位 を 摘 出 し 蛍 光 抗 体 免 疫 染 色 法 により EGFR HER2 VEGF の 発 現 を 解 析 した 結 果 として において EGFR および HER2 の 高 発 現 を 確 認 した C6 SK OV 3 EGFR HER2 図 1 VEGF また 一 方 で 新 しい 標 的 分 子 の 候 補 として 亜 鉛 のがん 集 積 性 に 着 目 し 腎 臓 がんなどで 発 現 亢 進 の 報 告 のある 亜 鉛 トランスポーターzip6 の 発 現 について Hela 293 MCF7 の 各 細 胞 株 においてウェスタンブロッティングを 用 いて 解 析 した その 結 果 担 がんモデル 作 成 に 使 用 した 株 における 高 発 現 を 確 認 した( 図 2) そこで 更 に zip6 のイメージング 標 的 としての 可 能 性 を 検 討 するため 蛍 光 抗 体 免 疫 染 色 により 細 胞 膜 透 過 処 理 を 行 った 場 合 と 行 わ なかった 場 合 の 染 色 像 を 核 内 タンパク 質 YY1 の 発 現 と 比 較 することにより zip6 の 局 在 性 を 検 討 した 1 2 3 4 5 anti-zip6 anti-tubulin 図 2 1: Hela, 2: 293, 3:, 4: MCF7, 5: - 16 -
その 結 果 ともに 透 過 処 理 した 場 合 のみ 染 色 が 見 られる YY1 に 対 し zip6 は 透 過 処 理 の 有 無 に 関 わらず 染 色 が 確 認 できた このことから zip6 は 膜 表 面 に 局 在 し 標 的 分 子 として 有 用 と 考 えられた Permeate Non permeate Permeate Non permeate anti yy1/alexa594 anti zip6/alexa488 図 3 Merge さらに 細 胞 は 高 い 転 移 性 を 有 していることから 転 移 巣 を 微 小 がんイメージングモデル として 利 用 することを 考 えた そこで 肺 転 移 巣 組 織 における ErbB2(HER2 のマウス 相 同 性 タ ンパク 質 )と zip6 発 現 を 蛍 光 抗 体 免 疫 染 色 により 解 析 した DAPI Actin ErbB2 Merge / primary / lung metastatic DAPI Actin Zip6 Merge / primary 図 4 / lung metastatic - 17 -
結 果 として ErbB2 については 移 植 原 発 巣 転 移 巣 ともに 発 現 を 確 認 できたが zip6 については 移 植 原 発 巣 にのみ 発 現 が 確 認 でき 転 移 巣 では 確 認 できなかった 転 移 巣 のイメージング 標 的 と して zip6 は 適 さない 結 果 となるが 転 移 巣 組 織 タンパク 質 を 抽 出 して 発 現 を 確 認 する 必 要 があ り また 他 の 部 位 での 転 移 巣 が 生 じた 場 合 についても 今 後 検 討 していきたい 抗 体 分 子 イメージングの 検 討 抗 体 医 薬 である 抗 EGFR 抗 体 セツキシマブ 抗 HER2 抗 体 トラスツズマブ 抗 VEGF 抗 体 ベバ シズマブを 用 い 64 Cu 標 識 プローブ 化 を 行 った 標 識 にはまずキレーター 分 子 DOTA を 各 抗 体 に モル 比 100-200 倍 の DOTA-NHS-ester を 混 合 し 3 時 間 振 盪 することで 結 合 させ 標 識 前 駆 体 とす る その 後 37 ph6.5 の 酢 酸 バッファー 溶 液 中 で 1 時 間 インキュベートすることで 64 Cu を 標 識 した 遠 心 フィルタろ 過 法 により 標 識 抗 体 を 精 製 し 注 射 溶 液 を 作 製 した これを C6 の 4 種 の 細 胞 株 移 植 担 がんモデルマウスに 投 与 し 24 時 間 後 57 時 間 後 に 小 動 物 用 PET 装 置 により 撮 像 した その 結 果 抗 EGFR 抗 体 抗 HER2 抗 体 の がん 部 位 への 高 集 積 が 見 られた またその 集 積 は 投 与 後 24 時 間 より 57 時 間 の 方 で 高 くなる 傾 向 にあった 抗 VEGF 抗 体 は 全 体 に 他 2 抗 体 ほどの 高 い 集 積 は 見 られなかった 24 h anti VEGF anti HER2 anti EGFR C6 C6 C6 5 57 h 0 (SUV) 図 5 (maximum intensity projection 画 像 で 表 示 ) - 18 -
24 時 間 後 から 57 時 間 後 にかけて 集 積 増 加 が 見 られることは 抗 体 の 血 中 安 定 性 の 高 さから 標 的 分 子 が 膜 表 面 に 現 れる 度 に 結 合 し 細 胞 内 部 に 取 り 込 まれることで 経 時 的 に 蓄 積 が 増 加 する からと 考 えられる この 結 果 から 抗 EGFR 抗 HER2 プローブをそれぞれ 異 なるエネルギーの ガンマ 線 放 出 核 種 で 標 識 し 18 F-FDG と 同 時 に 投 与 することで EGFR 発 現 HER2 発 現 グルコ ース 代 謝 を 同 時 に 解 析 可 能 な 複 数 分 子 同 時 イメージングが 可 能 になると 考 えられる しかしなが ら 現 在 のところ 容 易 に 入 手 可 能 な 市 販 されている 核 種 では 比 放 射 能 や 化 学 的 純 度 の 問 題 から イメージングに 適 さないものが 多 く またこれら 比 放 射 能 や 純 度 が 高 い 核 種 であっても 抗 体 に 影 響 を 与 えない 温 和 な 条 件 で 標 識 可 能 なキレーター 分 子 の 探 索 中 であり GREI によるがん 複 数 分 子 同 時 イメージング 実 施 には 至 らなかった また 一 方 で 蛍 光 抗 体 免 疫 染 色 法 の 結 果 から EGFR HER2 発 現 の 見 られなかった C6 でも 若 干 の 集 積 が 見 られた この 点 についてさらに 検 証 するため を 移 植 した 担 がん マウスの 左 足 にテレピン 油 により 炎 症 を 誘 発 した 後 (がん 炎 症 併 発 モデル) 抗 HER2 抗 体 を 投 与 し 24 時 間 後 に PET 撮 像 を 行 った またさらに 移 植 担 がんマウスに 対 して 抗 HER2 抗 体 とマウス IgG のアイソタイプコントロールを 同 様 に 標 識 して 投 与 し 同 じく 24 時 間 後 に PET 撮 像 した anti HER2 anti HER2 Control IgG 5 Inflammation 0 (SUV) 図 6 (maximum intensity projection 画 像 で 表 示 ) その 結 果 がん 炎 症 併 発 モデルでは 炎 症 部 位 にがんと 同 程 度 の 高 集 積 を 確 認 した また 抗 原 性 が 無 いにも 関 わらず がん 部 位 に 抗 HER2 抗 体 コントロール IgG ともにほぼ 同 程 度 の 集 積 を 確 認 した この 事 は 抗 体 を 用 いる 最 も 有 利 な 点 である 抗 原 - 抗 体 反 応 の 特 異 性 以 外 の 機 序 で がんや 炎 症 部 位 に 抗 体 が 集 積 することを 示 している この 非 特 異 的 な 集 積 は 複 数 の 抗 体 を 同 時 に 使 用 した 場 合 に 大 きな 問 題 となる 可 能 性 が 高 い これら 非 特 異 的 集 積 を 生 じる 要 因 として マクロファージなどによる 抗 体 分 子 の 貪 食 作 用 Fc 受 容 体 への 結 合 Fc 部 位 を 介 した 補 体 結 合 EPR 効 果 による 血 中 から 細 胞 外 液 中 への 浸 潤 などが 考 えられる この 問 題 を 打 破 する 方 法 として 一 つには 抗 体 の Fc 部 位 を 除 去 した Fab F(ab )2 などへのフラグメント 化 が 考 えられる これにより Fc 受 容 体 への 結 合 補 体 結 合 は 回 避 される - 19 -
しかし 一 方 で フラグメント 化 により 血 中 安 定 性 が 低 下 し 時 間 とともに 集 積 が 増 加 する 上 述 の 作 用 が 見 込 めず 特 異 的 集 積 も 低 下 することが 考 えられる またもう 一 つの 方 法 として より 長 い 半 減 期 の 放 射 性 核 種 で 標 識 し さらに 長 時 間 の 蓄 積 の 後 にイメージングする 手 法 が 考 えられる この 場 合 には 非 特 異 的 集 積 と 特 異 的 集 積 の 差 が 経 時 的 に 大 きくなり 結 果 として 特 異 的 集 積 をと らえやすくなる 可 能 性 がある 今 後 これらをさらに 検 討 することが 複 数 分 子 同 時 イメージン グを 成 功 に 導 くために 必 要 と 考 えられた まとめ 本 研 究 では がん 複 数 分 子 同 時 イメージング 法 の 確 立 を 目 指 し 標 的 分 子 の 探 索 とそれらに 対 する 抗 体 分 子 を 用 いたイメージング 法 の 検 討 を 行 った 現 在 の 段 階 では 未 だ 抗 体 分 子 を 様 々な 放 射 性 核 種 で 標 識 する 技 術 環 境 を 確 立 するに 至 っておらず GREI を 用 いた 複 数 分 子 同 時 イメ ージングは 実 施 できていない しかしながら 発 現 分 子 解 析 の 結 果 から 標 的 分 子 として 有 望 な zip6 を 新 たに 見 出 すことができた また PET イメージングを 通 して 抗 体 プローブを 複 数 用 い る 場 合 の 問 題 点 も 洗 い 出 された 今 後 これらを 更 に 検 討 することで がん 複 数 分 子 同 時 イメー ジング 実 現 を 目 指 したい - 20 -