カンキツグリーニング 病 原 細 菌 の 培 養 と

National Agriculture and Food Research Organization 農 業 食 品 産 業 技 術 総 合 研 究 機 構 第 7 回 アグリ 技 術 シーズセミナー - 果 樹 生 産 の 最 新 技 術 と6 次 産 業 化 の 可 能 性 - カンキツグリーニング 病 原 細 菌 の 培 養 と 藤 川 貴 史 果 樹 研 究 所 品 種 育 成 病 害 虫 研 究 領 域 ftakashi@affrc.go.jp 農 研 機 構 は 食 料 農 業 農 村 に 関 する 研 究 開 発 などを 総 合 的 に 行 う 我 が 国 最 大 の 機 関 です

カンキツグリーニング 病 原 細 菌 の 培 養 と

そもそもカンキツグリーニング 病 って 何 なの? なぜ 培 養 するの? 培 養 したら 何 かいいこと あるの? 診 断 キットは 誰 が 使 うの? 簡 易 診 断 キットって? 6 次 産 業 化 と 何 か 関 係 あるの?

2~ 数 年

アメリカ(フロリダ) 中 国 メキシコ World Citrus belt ブラジル World Citrus belt World Citrus belt World Citrus belt 輸 入 禁 止 地 域 (カンキツグ リーニング 病 原 菌 が 有 害 対 象 微 生 物 ) 植 物 防 疫 法 別 表 二 ( 第 九 条 関 係 ) 世 界 のカンキツ 栽 培 地 域 世 界 の 主 要 なカンキツ 栽 培 地 域 で カンキツグリーニング 病 が 発 生 している カンキツグリーニング 病 の 発 生 地 のカンキツ 類 やミカン 科 の 植 物 (ワンピ ゾウノリンゴ 等 )の 生 植 物 は 輸 入 でき ない 他 の 病 害 虫 害 の 危 険 もあって この 地 域 のカンキツは 果 実 も 輸 入 されていない

グリーニング 病 + 媒 介 虫 蔓 延 どうしたらいいのか? グリーニング 病 原 菌 感 染 樹 の 検 査 診 断 感 染 樹 の 除 去 殺 虫 剤 による 媒 介 虫 の 駆 除 コストがかかるが やるしかない! 健 全 苗 木 の 生 産 確 保 健 全 樹 への 改 植 及 び 生 育 非 収 穫 時 期 中 の 収 量 低 下 罹 病 樹 の 果 実 収 量 減 少 品 質 低 下 罹 病 樹 の 枯 死

日 本 国 内 においては2003 年 まで 本 病 害 が 北 上 していた 現 在 緊 急 防 除 や 根 絶 事 業 で 病 害 の 北 進 を 食 い 止 めている カンキツグリーニング 病 原 細 菌 の 培 養 と 日 本 では ストップ! 北 上 Citrus Production Belt 2003 喜 界 島 Jeollanam Jeju Fukuoka 2003 徳 之 島 2002 与 論 島 Zhejiang Okinawa Guangdong Taiwan Citrus Greening Disease Area 1994 沖 縄 本 島 1988 西 表 島

国 内 のみかん 及 びかんきつ 類 は 青 果 だけで2000 億 円 規 模 の 産 業 みかん その 他 かんきつ みかん その 他 かんきつ 栽 培 面 積 ( 平 成 23 年 ) 48,000 ha 栽 培 面 積 ( 平 成 23 年 ) 28,000 ha 卸 売 数 量 ( 平 成 22 年 ) 676,442 t 卸 売 数 量 ( 平 成 22 年 ) 397,005 t みかん 卸 売 価 額 ( 平 成 22 年 ) 1462 億 円 その 他 かんきつ 卸 売 価 額 ( 平 成 22 年 ) 774 億 円 農 林 水 産 省 統 計 より カンキツグリーニング 病 の 餌 食 にならないようにする

グリーニング 病 原 細 菌 とは? Candidatus Liberibacter asiaticus (Las) Candidatus Liberibacter africanus (Laf) Candidatus Liberibacter americanus (Lam) 日 本 に 侵 入 している 菌 2~5μm 根 粒 菌 (マメ 科 植 物 の 根 で 窒 素 固 定 をする 共 生 菌 )の 仲 間 なのに 植 物 病 原 細 菌 らしい 病 原 因 子 をもっていない ( 見 つかっていない) それどころか 自 活 して 生 きていく 為 の 遺 伝 子 をたくさん 失 っている (ゲノムDNAのサイズは 大 腸 菌 の4 分 の1 程 度 ) 伝 染 方 法 (1) 虫 媒 伝 染 (2) 接 木 伝 染 成 虫 幼 虫 体 長 3mm ミカンキジラミ 写 真 : 果 樹 研 上 地 博 士 提 供 ミカンキジラミが 葉 や 枝 から 師 管 液 を 吸 汁 する 時 に 伝 播 される ミカンキジラミの 体 内 で 菌 は 増 殖 できる 罹 病 樹 と 媒 介 虫 のセットで 病 原 菌 は 健 全 樹 に 感 染 し 拡 がっていく 罹 病 樹 から 病 原 菌 が 接 いだ 健 全 樹 に 感 染 し 拡 がっていく

髄 木 部 ( 早 ) 木 部 ( 晩 ) 形 成 層 篩 部 コルク 層 皮 層 枝 の 断 面 グリーニング 病 原 細 菌 は 宿 主 植 物 の 篩 部 ( 師 部 )に 局 在 偏 在 する 篩 部 = 養 分 の 通 り 道 人 間 で 言 えば 血 液 の 中 に 菌 がいるようなもの 防 除 が 難 しい

そもそもカンキツグリーニング 病 って 何 なの? なぜ 培 養 するの? 培 養 したら 何 かいいこと あるの? 診 断 キットは 誰 が 使 うの? 簡 易 診 断 キットって? 6 次 産 業 化 と 何 か 関 係 あるの?

単 離 菌 の 性 状 特 性 がわかる 遺 伝 子 組 換 えが 行 える 培 養 罹 病 樹 実 用 研 究 接 種 試 験 抵 抗 性 品 種 の 育 種 選 抜 新 規 農 薬 の 選 抜 検 定 人 工 接 種 コッホの 原 則 を 満 たす Candidatus でなくなる 病 原 性 因 子 の 同 定 基 礎 研 究 感 染 様 式 の 特 定 細 菌 検 出 同 定 法 の 改 良 グリーニング 病 防 除 への 道

これまでこの 病 原 細 菌 を 培 養 できた という 報 告 はあるが LiberA MIG

これまでこの 病 原 細 菌 を 培 養 できた という 報 告 はあるが 世 界 中 でグリーニング 病 原 細 菌 は 培 養 できていない! LiberA MIG

罹 病 葉 を 回 収 カンキツグリーニング 病 原 細 菌 の 培 養 と 我 々が 開 発 中 の 方 法 (1) 単 離 中 肋 を 破 砕 し 滅 菌 水 に 懸 濁 スピンカラムで 裁 断 し 沈 殿 物 を 滅 菌 水 に 懸 濁 5μmフィルター で 懸 濁 液 を 濾 過 Las 選 択 培 地 で 培 養 罹 病 葉 の 中 肋 を 回 収 生 きた 病 原 菌 を 回 収 することに 成 功 している

罹 病 葉 を 回 収 カンキツグリーニング 病 原 細 菌 の 培 養 と 我 々が 開 発 中 の 方 法 (1) 単 離 中 肋 を 破 砕 し 滅 菌 水 に 懸 濁 スピンカラムで 裁 断 し 沈 殿 物 を 滅 菌 水 に 懸 濁 5μmフィルター で 懸 濁 液 を 濾 過 Las 選 択 培 地 で 培 養 罹 病 葉 の 中 肋 を 回 収 難 点 この 作 業 に 手 間 が 掛 かる ( 人 力 のルーチンワークだが 多 数 のサンプルを 扱 うには 不 向 き)

グリーニング 病 原 細 菌 の 選 択 培 地 をつくるには ゲノム 情 報 を 利 用 する 病 原 細 菌 が 有 している 遺 伝 子 から 代 謝 系 を 予 測 不 完 全 な 代 謝 系 に 対 して 培 地 に 関 係 する 成 分 を 添 加 する (= 健 康 サプリメントの 発 想 ) カンキツの 篩 管 液 の 成 分 を 考 慮 する 病 原 細 菌 はカンキツの 篩 部 に 局 在 している カンキツの 篩 管 液 成 分 が 培 地 成 分 になる 培 地 成 分 について 改 めて 考 え 直 す 寒 天 培 地 といっても agarがいいのか? 窒 素 源 アミノ 酸 源 としてペプトンでいいのか? 他 の 菌 ( 雑 菌 )のコンタミネーションを 防 ぐには?

Ishigaki1 OK901 KIN1 Plant (Ishigaki1-infected) DNA 10ng カンキツグリーニング 病 原 細 菌 の 培 養 と 我 々が 開 発 中 の 方 法 (2) 培 養 開 発 した 培 地 (A) 2 週 間 培 養 病 原 菌 DNA 検 出 culture 14days 目 に 見 えるコロニーはない しかし 培 地 表 面 を 調 べてみると 病 原 菌 のDNAが 検 出 される = 菌 が 存 在 する 本 病 原 菌 を 継 続 して 培 養 できることに 成 功 している! 培 地 表 面 を 掻 き 取 り 懸 濁 液 を 調 整 し 新 たな 培 地 (A)に 塗 布 し 培 養 する 20 日 後 培 地 で 病 原 菌 のDNAが 検 出 された 3 回 の 継 代 培 養 ができている

新 しく 開 発 した 培 地 (A)で 培 養 DAPI ( 生 菌 を 染 色 ) LAS-specific site of 16S rrna (LSS) 培 地 上 で 菌 のコロニーは 目 に 見 えないが FISH 法 による 観 察 を 行 うと 生 きた 菌 体 が 確 認 できる

Ishigaki1 OK901 KIN1 Plant (Ishigaki1-infected) DNA 10ng カンキツグリーニング 病 原 細 菌 の 培 養 と 我 々が 開 発 中 の 方 法 (2) 培 養 目 に 見 えるコロニーはない 難 点 開 発 した 培 地 (A) 2 週 間 培 養 病 原 菌 DNA 検 出 しかし 培 地 表 面 を 調 べてみると 病 原 菌 のDNAが 検 出 される 培 地 を 作 製 するのに 手 間 がかかる ( 微 量 な 成 分 を 他 種 類 用 いるので 研 究 室 では 良 いが 多 量 のサンプルを = 調 菌 べるような が 存 在 する 検 定 現 場 では XEW culture 効 率 が 悪 い) 14days * 医 療 現 場 では 培 地 がキット 化 されている 目 に 見 えないので 普 及 して 使 用 できない ( 毎 回 DNA 検 出 するのは コストが 掛 かる) * 培 地 の 改 良 * 可 視 化 ツールの 作 成 本 病 原 菌 を 継 続 して 培 養 できることに 成 功 している! 培 地 表 面 を 掻 き 取 り 懸 濁 液 を 調 整 し 新 たな 培 地 (A)に 塗 布 し 培 養 する 20 日 後 培 地 で 病 原 菌 のDNAが 検 出 された 3 回 の 継 代 培 養 ができている

そもそもカンキツグリーニン グ 病 って 何 なの? なぜ 培 養 するの? 培 養 したら 何 かいいこと あるの? 診 断 キットは 誰 が 使 うの? 簡 易 診 断 キットって? 6 次 産 業 化 と 何 か 関 係 あるの?

カンキツグリーニング 病 原 細 菌 及 び 罹 病 樹 の 診 断 方 法 1.DNA 検 定 (1) PCR 法 最 も 普 及 している ( 機 械 と 試 薬 が 必 要 ) (2) リアルタイムPCR 法 正 確 性 が 高 い ( 高 額 機 械 と 高 額 試 薬 が 必 要 ) (3) LAMP 法 簡 便 キットとして 市 販 されている (4) ICAN 法 簡 便 キットとして 市 販 されている 2. 物 質 検 定 (1) ヨウ 素 デンプン 反 応 罹 病 樹 はデンプンが 蓄 積 されることを 利 用 ( 誤 差 が 大 きい) (2) 鉄 マンガン 含 有 量 罹 病 樹 は 内 在 する 鉄 イオンやマンガンイオンが 減 少 することを 利 用 ( 誤 差 が 大 きい) (3) 近 赤 外 線 波 長 罹 病 樹 と 健 全 樹 で 近 赤 外 線 波 長 の 吸 収 量 が 異 なる ( 他 の 病 害 と 区 別 できていない) 3. 免 疫 検 定 菌 体 を 含 む 罹 病 樹 液 成 分 を 抗 原 としてELISA 法 による 検 定 ( 失 敗 に 終 わっている) 4. 接 ぎ 木 検 定 罹 病 樹 の 疑 いのある 木 から 穂 木 をとり 健 全 樹 に 接 ぎ 木 して 病 徴 が 健 全 樹 体 に 現 れるかをみる ( 熟 練 者 でないと 成 功 しない) 5. 見 取 り 検 定 目 視 で 病 徴 を 確 認 する ( 熟 練 者 であっても 正 確 に 判 断 するのは 難 しい)

1.DNA 検 定 カンキツグリーニング 病 原 細 菌 及 び 罹 病 樹 の 診 断 方 法 罹 病 樹 のサンプル 中 の 菌 が 少 ないと 擬 陰 性 になる (1) PCR 法 最 も 普 及 している ( 機 械 と 試 薬 が 必 要 ) (2) リアルタイムPCR 法 検 出 正 条 確 件 性 を が 間 高 違 い えると ( 高 額 擬 機 陽 械 と 性 高 になる 額 試 薬 が 必 要 ) (3) LAMP 法 死 んで 簡 便 無 キットとして 害 ( 病 原 性 市 無 販 し されている 感 染 力 無 し)の 菌 も 検 出 される (4) ICAN 法 お 金 簡 がかかる 便 キットとして 市 販 されている 2. 物 質 検 定 (1) ヨウ 素 デンプン 反 応 罹 病 樹 はデンプンが 蓄 積 されることを 利 用 ( 誤 差 が 大 きい) (2) 鉄 マンガン 含 有 量 罹 病 樹 は 内 在 する 鉄 イオンやマンガンイオンが 減 少 することを 利 用 ( 誤 差 が 大 きい) (3) 近 赤 外 線 波 長 罹 病 樹 と 健 全 樹 で 近 赤 外 線 波 長 の 吸 収 量 が 異 なる ( 他 の 病 害 と 区 別 できていない) 従 来 の 方 法 ではうまくいかない 新 ( 失 しい 敗 に 方 終 法 わっている) で 可 能 性 はある 3. 免 疫 検 定 菌 体 を 含 む 罹 病 樹 液 成 分 を 抗 原 としてELISA 法 による 検 定 従 来 の 方 法 では 誰 でもできる 技 術 ではない 新 健 しい 全 樹 方 体 法 に 現 で れるかをみる 可 能 性 はある ( 熟 練 者 でないと 成 功 しない) 4. 接 ぎ 木 検 定 罹 病 樹 の 疑 いのある 木 から 穂 木 をとり 健 全 樹 に 接 ぎ 木 して 病 徴 が 5. 見 取 り 検 定 目 視 で 病 徴 を 確 認 する ( 熟 練 者 であっても 正 確 に 判 断 するのは 難 しい)

カンキツグリーニング 病 原 細 菌 及 び 罹 病 樹 の 診 断 方 法 第 6の 検 定 方 法 として 病 原 細 菌 の 培 養 罹 病 樹 のサンプル 中 の 菌 が 少 なくても 培 養 し 増 殖 させることができる 生 きて 病 原 性 と 感 染 力 を 持 っている 菌 を 培 養 できる 特 別 な 装 置 や 技 術 を 必 要 としない 一 度 に 多 数 のサンプルを 検 定 することができる DNA 検 定 に 比 べてはるかに 安 価 である 更 に 培 養 した 菌 をDNA 検 定 することによって 二 重 の 検 定 が 可 能 である ( 免 疫 検 定 接 ぎ 木 検 定 への 応 用 性 も) 誰 が 使 用 するのか? 検 疫 や 防 除 所 研 究 機 関 産 地 ( 海 外 含 む)の 農 業 法 人 や 流 通 業 者 民 間 検 査 会 社 ( 現 状 の 国 内 では 難 しいかも) 世 界 中 で 需 要 が 見 込 まれる!

そもそもカンキツグリーニン グ 病 って 何 なの? なぜ 培 養 するの? 培 養 したら 何 かいいこと あるの? 診 断 キットは 誰 が 使 うの? 簡 易 診 断 キットって? 6 次 産 業 化 と 何 か 関 係 あるの?

病 原 細 菌 培 養 による 簡 易 診 断 キットがあれば 国 内 にこれまで 無 かった 新 しいカンキツ 類 を 食 卓 で 食 べられるかも 今 まで 利 用 できなかった 遺 伝 資 源 を 使 った 品 種 育 成 で 全 く 新 しい 果 物 ができるかも 果 実 としてではなく 新 しい 観 賞 用 植 物 が 国 内 に 流 通 するかも

ご 静 聴 ありがとうございました 藤 川 貴 史 農 業 食 品 産 業 技 術 総 合 研 究 機 構 果 樹 研 究 所 品 種 育 成 病 害 虫 研 究 領 域 ftakashi@affrc.go.jp