なぜ 私 たちは 眠 るか 眠 りの 素 は 細 胞 内 カルシウム? 1. 発 表 者 : 上 田 泰 己 ( 東 京 大 学 大 学 院 医 学 系 研 究 科 機 能 生 物 学 専 攻 薬 理 学 講 座 システムズ 薬 理 学 分 野 教 授 / 理 化 学 研 究 所 生 命 システム 研 究 センター 細 胞 デザインコア 長 兼 任 ) 2. 発 表 のポイント 新 規 の 睡 眠 の 理 論 モデルに 基 づいてカルシウムイオン 関 連 経 路 が 睡 眠 時 間 に 重 要 であるこ とを 予 測 し 本 予 測 を 遺 伝 子 改 変 マウスと 薬 理 実 験 により 世 界 で 初 めて 実 証 した 新 規 の 睡 眠 の 理 論 モデルに 基 づいて CaMKIIをはじめとするカルシウムイオン 関 連 経 路 に 含 まれる 7 遺 伝 子 について 遺 伝 子 を 改 変 したマウスの 睡 眠 時 間 が 増 減 することを 予 測 し 実 験 で 示 した 睡 眠 障 害 および 睡 眠 障 害 を 合 併 するさまざまな 精 神 疾 患 神 経 変 性 疾 患 ( 統 合 失 調 症 う つ 病 アルツハイマー 病 パーキンソン 病 など)の 機 序 の 解 明 新 規 の 標 的 遺 伝 子 の 提 案 に 繋 がることが 期 待 される 3. 発 表 概 要 : ヒトをはじめとする 哺 乳 類 の 睡 眠 時 間 覚 醒 時 間 は 一 定 に 保 たれていることが 知 られていま すが その 本 質 的 メカニズムはよくわかっていませんでした 東 京 大 学 ( 五 神 真 総 長 )と 理 化 学 研 究 所 ( 理 研 松 本 紘 理 事 長 )は 神 経 細 胞 のコンピュータシミュレーションと 動 物 実 験 を 組 み 合 わせることで 睡 眠 覚 醒 の 制 御 にカルシウムイオンが 重 要 な 役 割 を 果 たしていること を 明 らかにしました さらに カルシウムイオン カルモジュリン 依 存 性 プロテインキナーゼ II(CaMKII 注 1)をはじめとするカルシウムイオン 依 存 的 な 経 路 の 遺 伝 子 をノックアウト することで 睡 眠 時 間 が 恒 常 的 に 増 減 する 複 数 種 類 の 遺 伝 子 改 変 マウス( 睡 眠 障 害 モデルマウ ス)の 作 製 に 成 功 しました 同 睡 眠 障 害 モデルマウスは 睡 眠 障 害 だけでなく 睡 眠 障 害 を 合 併 するさまざまな 精 神 疾 患 や 神 経 変 性 疾 患 ( 統 合 失 調 症 うつ 病 アルツハイマー 病 パーキン ソン 病 など)に 対 する 診 断 法 や 治 療 法 の 開 発 に 繋 がることが 期 待 されます 本 研 究 は 東 京 大 学 大 学 院 医 学 系 研 究 科 機 能 生 物 学 専 攻 薬 理 学 講 座 システムズ 薬 理 学 分 野 の 上 田 泰 己 教 授 ( 理 研 生 命 システム 研 究 センター( 柳 田 敏 雄 センター 長 ) 細 胞 デザインコア 長 兼 任 ) 東 京 大 学 医 学 部 の 多 月 文 哉 学 部 学 生 6 年 生 理 研 生 命 システム 研 究 センターの 砂 川 玄 志 郎 元 研 究 員 ( 研 究 当 時 現 理 研 多 細 胞 システム 形 成 研 究 センター 網 膜 再 生 医 療 研 究 開 発 プロジェクト 研 究 員 ) 東 京 大 学 大 学 院 医 学 系 研 究 科 の 史 蕭 逸 博 士 課 程 3 年 生 洲 崎 悦 生 助 教 ( 理 研 客 員 研 究 員 兼 務 ) 理 研 生 命 システム 研 究 センターの 幸 長 弘 子 基 礎 科 学 特 別 研 究 員 ディミトリ ペリン 研 究 員 ( 研 究 当 時 現 理 研 客 員 研 究 員 )らの 共 同 研 究 グループの 成 果 です 本 研 究 成 果 は Neuron 3 月 17 日 オンライン 版 に 掲 載 されました 4. 発 表 内 容 : ( 背 景 ) 不 眠 や 過 眠 などの 睡 眠 障 害 は 現 代 社 会 における 重 大 な 疾 患 の 一 つであり 精 神 疾 患 や 神 経 変 性 疾 患 の 重 要 な 合 併 症 でもあります 睡 眠 障 害 に 対 する 診 断 法 治 療 法 の 開 発 には 睡 眠 覚 醒 のメカニズムを 理 解 することが 必 要 不 可 欠 です
睡 眠 はヒトを 含 む 多 種 の 生 物 で 観 察 される 基 本 的 な 生 理 現 象 であり 睡 眠 を 制 御 する 因 子 は 主 にハエを 用 いたフォワードジェネティクス( 注 2)による 探 索 で 体 内 時 計 に 関 係 した 遺 伝 子 を 中 心 に 複 数 特 定 されてきました しかしながら 体 内 時 計 とは 別 の 睡 眠 時 間 を 直 接 制 御 し ている 遺 伝 子 ( 睡 眠 時 間 制 御 因 子 注 3)は 未 解 明 のままでした 表 現 型 から 遺 伝 子 に 遡 るフ ォワードジェネティクスに 基 づいた 睡 眠 時 間 制 御 因 子 の 探 索 は 遺 伝 子 と 睡 眠 表 現 型 の 結 びつ けに 多 くの 時 間 とコストを 要 します 更 に 従 来 の 睡 眠 測 定 は 脳 波 を 取 得 するための 電 極 を 手 術 によって 頭 蓋 骨 に 装 着 する 必 要 があり 侵 襲 が 大 きく 多 くの 時 間 とコストが 同 様 にかか ります 近 年 本 研 究 グループは 遺 伝 子 と 表 現 型 を 直 接 結 びつけることができるリバースジ ェネティクス( 注 4)に 注 目 し この 手 法 を 迅 速 に 行 うために 高 速 に 遺 伝 子 改 変 動 物 を 作 製 することができる 技 術 (トリプル CRISPR 法 注 5)を 開 発 し さらに 高 速 に 睡 眠 表 現 型 を 解 析 することができる 手 法 (SSS 注 6)を 開 発 しました 今 回 本 研 究 グループは 神 経 細 胞 のコンピュータシミュレーションにより 睡 眠 時 間 制 御 因 子 を 絞 り 込 み トリプル CRISPR 法 と SSSを 組 み 合 わせることで カルシウムイオン カルモ ジュリン 依 存 性 プロテアーゼ II(CaMKII)をはじめとするカルシウムイオン 関 連 経 路 が 睡 眠 時 間 制 御 因 子 の 役 割 を 担 うことを 明 らかにしました ( 研 究 手 法 と 成 果 ) (1)コンピュータシミュレーションを 用 いた 睡 眠 時 間 制 御 因 子 の 絞 り 込 み( 図 1) 睡 眠 時 には 余 波 とよばれる 特 徴 的 な 脳 波 が 観 察 されます 本 研 究 グループは 徐 波 形 成 に 必 要 な 遺 伝 子 を 特 定 するために 平 均 場 近 似 ( 注 7)を 施 した 神 経 細 胞 のコンピュー タモデルを 作 製 して 解 析 しました その 結 果 カルシウムイオンの 流 入 に 伴 う 神 経 細 胞 の 過 分 極 が 徐 波 形 成 にきわめて 重 要 であることが 示 され その 経 路 に 含 まれる 電 位 依 存 性 カルシウムチャネル( 注 8) NMDA 型 グルタミン 酸 受 容 体 ( 注 9) カルシウ ム 依 存 性 カリウムチャネル( 注 10) カルシウムポンプ( 注 11)が 徐 波 形 成 に 必 要 な 遺 伝 子 群 として 予 測 されました (2)ノックアウトマウスを 用 いた 睡 眠 時 間 制 御 因 子 の 同 定 ( 図 2) (1)の 予 測 を 実 証 するために 本 研 究 グループは カルシウムイオン 依 存 的 な 過 分 極 経 路 に 含 まれる 遺 伝 子 をマウスのゲノム 情 報 をもとにすべて 同 定 し トリプル CRISPR 法 によりそれぞれのノックアウトマウスを 作 製 し SSS 法 を 用 いて 睡 眠 の 測 定 を 行 いま した その 結 果 Cacna1g, Cacna1h ( 電 位 依 存 性 カルシウムチャネル) Kcnn2, Kcnn3 (カルシウム 依 存 性 カリウムチャネル) Camk2a, Camk2b (カルシウムイオン カ ルモジュリン 依 存 性 プロテインキナーゼ II)ノックアウトマウスが 顕 著 な 睡 眠 時 間 の 減 少 を 示 す 一 方 で Atp2b3 (カルシウムポンプ)ノックアウトマウスは 顕 著 な 睡 眠 時 間 の 増 加 を 示 し これらの 遺 伝 子 が 睡 眠 時 間 制 御 因 子 であることが 明 らかとなりました (3) 全 脳 イメージングを 用 いた 神 経 細 胞 の 興 奮 性 解 析 ( 図 3) 本 研 究 グループは(1)で 予 測 されたカルシウムイオンの 流 入 に 必 要 な NMDA 型 グル タミン 酸 受 容 体 を 薬 理 学 的 に 阻 害 することで 詳 細 な 解 析 を 行 いました その 結 果 マ ウスの 睡 眠 時 間 が 減 少 することを 明 らかにしました さらに CUBIC( 注 12)を 用 い て 睡 眠 が 減 少 したマウスの 脳 を 透 明 化 し 一 細 胞 解 像 度 で 観 察 しました その 結 果 NMDA 受 容 体 の 阻 害 (すなわちカルシウムイオンの 流 入 阻 害 )によって 大 脳 皮 質 の 神 経 細 胞 の 興 奮 性 が 上 昇 することを 示 しました
(1)~(3)の 結 果 から カルシウムイオンの 流 入 に 伴 う 神 経 細 胞 の 過 分 極 が 睡 眠 を 誘 導 す ることを 世 界 で 初 めて 明 らかにしました 本 研 究 グループは 単 一 の 遺 伝 子 (Kcnn2, Kcnn3, Cacna1h, Cacna1g, Atp2b3, Camk2a, Camk2b)をノックアウトすることで 安 定 した 表 現 型 を 示 す 睡 眠 障 害 モデルマウスを 作 製 す ることに 成 功 しました さらに 睡 眠 障 害 と 精 神 疾 患 神 経 変 性 疾 患 との 密 接 な 関 係 から 今 後 これらの 睡 眠 障 害 マウスをより 深 く 研 究 していくことにより 精 神 疾 患 や 神 経 変 性 疾 患 の 原 因 解 明 治 療 薬 探 索 への 貢 献 が 期 待 されます 本 研 究 は 国 立 研 究 開 発 法 人 日 本 医 療 研 究 開 発 機 構 革 新 的 先 端 研 究 開 発 支 援 事 業 (AMED-CREST)の 研 究 開 発 領 域 生 体 恒 常 性 維 持 変 容 破 綻 機 構 のネットワーク 的 理 解 に 基 づく 最 適 医 療 実 現 のための 技 術 創 出 ( 研 究 開 発 総 括 : 永 井 良 三 )における 研 究 課 題 睡 眠 覚 醒 リズムをモデルとした 生 体 の 一 日 の 動 的 恒 常 性 の 解 明 ( 研 究 代 表 者 : 上 田 泰 己 ) の 一 環 で 行 われました なお 本 研 究 開 発 領 域 は 平 成 27 年 4 月 の 日 本 医 療 研 究 開 発 機 構 の 発 足 に 伴 い 国 立 研 究 開 発 法 人 科 学 技 術 振 興 機 構 から 日 本 医 療 研 究 開 発 機 構 へと 移 管 されてい ます 5. 発 表 雑 誌 : 雑 誌 名 : NEURON (2016 年 3 月 17 日 オンライン 版 ) 論 文 タイトル:Involvement of Ca2+-dependent hyperpolarization in sleep duration in mammals. 著 者 :Fumiya Tatsuki, Genshiro A. Sunagawa, Shoi Shi, Etsuo A. Susaki, Hiroko Yukinaga, Dimitri Perrin, Kenta Sumiyama, Maki Ukai-Tadenuma, Hiroshi Fujishima, Rei-ichiro Ohno, Daisuke Tone, Koji L. Ode, Katsuhiko Matsumoto and Hiroki R. Ueda* DOI 番 号 :10.1016/j.neuron.2016.02.032 6. 用 語 解 説 : ( 注 1)カルシウムイオン カルモジュリン 依 存 性 プロテインキナーゼ II (CaMK2) カルシウムイオンの 流 入 に 伴 い 活 性 化 するリン 酸 化 酵 素 脳 の 多 く 存 在 し 記 憶 や 学 習 に 重 要 な 役 割 を 果 たすことが 知 られている ( 注 2)フォワードジェネティクス 特 定 の 生 命 現 象 を 示 す 動 物 のゲノムの 変 化 を 詳 細 に 調 べることによって 関 係 している 遺 伝 子 を 同 定 していく 従 来 の 遺 伝 学 ( 注 3) 睡 眠 時 間 制 御 因 子 遺 伝 子 改 変 やノックアウトによって 睡 眠 時 間 を 変 化 させる 遺 伝 子 ( 注 4)リバースジェネティクス 特 定 の 遺 伝 子 を 改 変 し 生 命 現 象 がどのように 変 化 するか 観 察 することで 遺 伝 子 機 能 を 解 析 する 手 法 遺 伝 子 から 生 命 現 象 を 関 連 付 けるため フォワードジェネティクスとは 解 析 法 が 逆 向 きであり リバース(= 逆 方 向 の)ジェネティクスと 呼 ばれるようになった ( 注 5)トリプル CRISPR 法 CRISPR 法 (CRISPR/Cas 系 を 用 いたゲノム 編 集 技 術 の1つ)を 改 良 し 3 種 類 のガイド RNAを 用 いて 1 世 代 目 で 極 めて 高 い 確 率 (ほぼ 100%)で 大 量 の 遺 伝 子 ノックアウトマ ウスを 作 製 できる 手 法 2016 年 1 月 8 日 理 化 学 研 究 所 プレスリリース
( 注 6)SSS 法 次 世 代 型 逆 遺 伝 学 による 睡 眠 遺 伝 子 Nr3aの 発 見 - 交 配 不 要 で 解 析 も 簡 便 かつ 低 コストな 新 しい 逆 遺 伝 学 を 確 立 - http://www.riken.jp/pr/press/2016/20160108_1/ Snappy Sleep Stager 法 呼 吸 パターンを 指 標 として 用 いることで 非 侵 襲 かつ 高 効 率 に 睡 眠 表 現 型 解 析 を 行 う 手 法 2016 年 1 月 8 日 理 化 学 研 究 所 プレスリリース 次 世 代 型 逆 遺 伝 学 による 睡 眠 遺 伝 子 Nr3aの 発 見 - 交 配 不 要 で 解 析 も 簡 便 かつ 低 コストな 新 しい 逆 遺 伝 学 を 確 立 - http://www.riken.jp/pr/press/2016/20160108_1/ ( 注 7) 平 均 場 近 似 多 数 の 要 素 が 相 互 作 用 しているような 集 団 を 解 析 するために 用 いられる 数 学 的 な 近 似 手 法 ( 注 8) 電 位 依 存 性 カルシウムチャネル 細 胞 外 から 細 胞 内 へカルシウムイオンを 通 過 させるイオンチャネル てんかんや 自 閉 症 ス ペクトラム 障 害 との 関 連 が 知 られている ( 注 9)NMDA 型 グルタミン 酸 受 容 体 グルタミン 酸 受 容 体 の1つ シナプスの 可 塑 性 や 記 憶 に 関 連 する 受 容 体 として 知 られる 多 くの 精 神 依 存 性 のある 薬 物 ( 覚 せい 剤 など)の 作 用 部 位 としても 知 られ NMDA 受 容 体 の 状 態 を 乱 すことで 鎮 静 状 態 や 興 奮 状 態 を 誘 導 できる ( 注 10)カルシウム 依 存 性 カリウムチャネル カルシウム 存 在 下 でカリウムイオンを 選 択 的 に 通 過 させるイオンチャネル ( 注 11)カルシウムポンプ 細 胞 内 から 細 胞 外 へカルシウムイオンを 通 過 させるイオンチャネル ( 注 12)CUBIC Clear, Unobstructed Brain Imaging Cocktails and Computational analysisの 略 2014 年 4 月 に 理 研 の 上 田 泰 己 グループディレクター 洲 崎 悦 生 元 基 礎 科 学 特 別 研 究 員 ( 研 究 当 時 )らが 発 表 した 脳 透 明 化 と 全 脳 イメージングのための 透 明 化 試 薬 ( 化 合 物 の 混 合 溶 液 )とコンピュータ 画 像 解 析 を 合 わせた 方 法 サンプルを 試 薬 に 浸 すだけの 効 率 的 で 再 現 性 の 良 い 方 法 で 複 数 のサンプルを 同 等 な 条 件 で 透 明 化 することが 可 能 1 細 胞 解 像 度 の 全 脳 蛍 光 イメージングと 情 報 科 学 的 解 析 によるサンプル 間 のシグナル 比 較 を 実 現 2014 年 4 月 18 日 理 化 学 研 究 所 プレスリリース 成 体 の 脳 を 透 明 化 し 1 細 胞 解 像 度 で 観 察 する 新 技 術 を 開 発 http://www.riken.jp/pr/press/2014/20140418_1/
7. 添 付 資 料 : 脳 波 が 徐 波 を 示 す 睡 眠 時 は 電 位 依 存 性 カルシウムチャネル NMDA 型 グルタミン 酸 受 容 体 を 通 じてカルシウムイオンが 細 胞 内 に 流 入 し カルシウム 依 存 性 カリウムチャネルが 開 きカリウムが 細 胞 外 へ 流 出 する 一 方 覚 醒 時 はカルシウムポンプを 通 じてカルシウムイオンが 細 胞 外 へ 流 出 する
トリプル CRISPR 法 によってカルシウムイオン 関 連 経 路 に 含 まれる 21 個 の 遺 伝 子 を それぞ れノックアウトしたマウスを 作 製 した そのマウスに SSSを 用 いて 睡 眠 解 析 を 行 ったところ その うちの Cacna1g, Cacna1h ( 電 位 依 存 性 カルシウムチャネル) Kcnn2, Kcnn3 (カルシウム 依 存 性 カリウムチャネル) Camk2a, Camk2b (カルシウムイオン カルモジュリン 依 存 性 プロテインキナーゼ II)をノックアウトしたマウスの 睡 眠 時 間 が 野 生 型 のマウスと 比 べて 顕 著 に 短 いことが Atp2b3 (カルシウムポンプ)をノックアウトしたマウスの 睡 眠 時 間 が 野 生 型 のマウスと 比 べて 顕 著 に 長 いことがわかった グラフ 中 の 破 線 は 野 生 型 マウスの 睡 眠 時 間 を 示 す
NMDA 型 グルタミン 酸 受 容 体 の 阻 害 剤 を Arc-dVenusマウスへ 投 与 したところ 神 経 活 動 の 上 昇 ( 緑 シグナル)が 観 察 された Arc-dVenusマウス: 神 経 細 胞 の 活 性 化 の 指 標 である Arc 遺 伝 子 の 発 現 に 伴 い 緑 色 蛍 光 タンパ ク Venusを 発 現 する 遺 伝 子 改 変 マウス