2015 年度 卒業論文 アルギン酸分解酵素の予備精製 Prepurification of alginate lyase 高知工科大学 環境理工学群 1160207 小林史弥 指導教員有賀修准教授 2016 年 3 月 18 日 1
目次第 1 章緒言 3 第 2 章 Cellvibrio sp. OA-2007 由来の酵素によるアルギン酸の分解 4 2-1. 実験材料調製 4 2-1-1. 実験材料 4 2-1-2. 寒天分解菌の培養 4 2-1-3. 粗酵素の調製 4 2-2. 実験方法 5 2-2-1. 分解反応実験 5 2-2-2. 滴下実験 5 2-3. 結果と考察 5 第 3 章アルギン酸分解酵素の予備精製 8 3-1. 実験材料調製 8 3-1-1. 実験材料 8 3-1-2. 粗酵素の調製 8 3-2. 実験方法 8 3-2-1. 活性 8 3-2-2. タンパク質量 8 3-2-3. 比活性 8 3-2-4. 精製度 9 3-2-5. 硫安 9 3-2-6. HAp 9 3-3. 結果と考察 9 3-3-1. 硫安による精製 9 3-3-2. HAp による精製 9 3-3-3. 精製度 9 第 4 章アルギン酸分解酵素の耐熱性 13 4-1. 実験材料調製 13 4-2. 実験方法 13 4-3. 結果と考察 13 第 5 章結言 15 謝辞 16 参考文献 17 2
第 1 章緒言 アルギン酸とは 褐藻類の細胞間粘質多糖成分の一つで β-d- マンヌロン酸 (M) と α -L- グルロン酸 (G) のウロン酸が 1,4 結合を繰り返す多糖である 食品 化粧品 医薬品など様々な用途に使用される しかし アルギン酸は水に溶解すると極めて高粘性を示すため 食品 化粧品 医薬品など様々な用途に適用するためには アルギン酸リアーゼでアルギン酸を分解することにより アルギン酸水溶液の粘度を低下させることが必要である また アルギン酸に酵素を添加することで β 脱離反応が起こり 二重結合をもつオリゴ糖が生成される このオリゴ糖には植物の根の生長促進効果 腸内細菌の増殖促進など 様々な生理活性作用が報告されている 本研究では 硫酸アンモニウム ( 硫安 ) とヒドロキシアパタイト (HAp) を用いて アルギン酸分解酵素の精製を試みた Cellvibrio sp.oa-2007 を アルギン酸ナトリウムを加えた培地で培養した後 トリス緩衝液で菌体を洗浄し 超音波破壊を行い 粗酵素液を調製した アルギン酸ナトリウム溶液に粗酵素を添加し 25 で種々の時間反応させ 加熱 (100 ) により反応を止めた 反応液を針 ( 内径 0.7mm) 付きシリンジに入れ 1mL が滴下する時間を計測した 粗酵素を種々の濃度の硫安で硫安分画を行った さらに HAp を用いて種々の濃度で酵素の精製を行った アルギン酸分解酵素の活性を 反応液の 235nm の吸光度から算出し タンパク質濃度を BCA Assay Kit を使用し測定し 比活性 ( タンパク質量当たりの活性 ) を算出した 精製度は 粗酵素の比活性あたりの精製した酵素の比活性から算出した また HAp 処理を行った酵素の耐熱性を調べた 3
第 2 章 Cellvibrio sp. OA-2007 由来の酵素によるアルギン酸の分解 2-1. 実験材料調製 2-1-1. 実験材料寒天分解菌 Cellvibrio sp. OA-2007 については有賀先生が作成し 冷凍保存したものを使用した 硝酸ナトリウム (NaNO3) りん酸水素二ナトリウム 12 水和物 (Na2HPO4 12H2O) りん酸二水素カリウム (KH2PO4) 硫酸マグネシウム七水和物(MgSO4 7H2O) 塩化カリウム (KCl) Agar アルギン酸ナトリウム りん酸水素二カリウム (K2HPO4) については シグマアルドリッチジャパン合同会社さんから購入した 針 ( 内径 0.7mm) シリンジ(10mL 中口 ) については TERUMO 株式会社さんから購入した 2-1-2. 寒天分解菌の培養寒天培地 ( 硝酸ナトリウム 1.0g, りん酸水素二ナトリウム 12 水和物 1.57g, りん酸二水素カリウム 0.9g, 硫酸マグネシウム七水和物 0.5g, 塩化カリウム 0.5g,Agar 1.0g,H2O 1L) を 400mL 作り 100mL ずつ 4 本の三角フラスコに分け オートクレーブで滅菌した また アルギン酸培地 ( 硝酸ナトリウム 1.0g, りん酸水素二ナトリウム 12 水和物 1.57g, りん酸二水素カリウム 0.9g, 硫酸マグネシウム七水和物 0.5g, 塩化カリウム 0.5g, アルギン酸ナトリウム 5.0g,H2O 1L) を 2L 作り 三角フラスコに入れ オートクレーブで滅菌した 冷凍保存された OA-2007 株を寒天培地 2 本に 2mL 植菌し 25 で 48 時間振とう培養した この前々培養液を寒天培地 2 本に 3mL 植菌し 25 で 48 時間振とう培養した この前培養液をアルギン酸培地に 5mL 植菌し 25 で 48 時間振とう培養した 2-1-3. 粗酵素の調製培養液を遠心分離 (8000rpm, 4, 10 min) し 上清液を取り除いた 沈殿物を 20mM りん酸緩衝液 (ph7.0) で懸濁 遠心分離 (8000rpm, 4, 10min) し 上清液を取り除き 沈殿物をりん酸緩衝液で懸濁した 懸濁液を超音波処理 ( 出力 60%, 15min, 1 秒間隔で ON/OFF, Max 9 ) し 懸濁破砕液を遠心分離 (8000rpm, 4, 10 min) し 上清液を粗酵素液として回収した 4
2-2. 実験方法 2-2-1. 分解反応実験 10g/L の濃度で 20mM りん酸緩衝液にアルギン酸ナトリウムを溶解させ アルギン酸水溶液を調製 全量 5mL, 濃度 6g/L (10g/L アルギン酸水溶液 3mL, りん酸緩衝液 1mL, 粗酵素 1mL) の反応液を 30 分から 6 時間振とう (25 ) し 100 の沸騰水で加熱し反応を止めた 2-2-2. 滴下実験 針を付けたシリンジに 2-2-1. で反応を停止したサンプルを入れ 4ml~3ml 間の 1ml が 針の先から滴下する時間を計測した ( 図 1) 2-3. 結果と考察反応時間が長くなるにつれて 滴下にかかる時間が速くなっていることから 粘性を持つアルギン酸が Cellvibriosp. OA-2007 由来の酵素によってアルギン酸が分解されていることが分かった ( 図 2) 5
図 1 6
滴下時間 (s) 800 600 400 200 0 0 2 4 6 反応時間 (h) 図 2 反応時間に対する滴下時間 7
第 3 章アルギン酸分解酵素の予備精製 3-1. 実験材料調製 3-1-1. 実験材料塩酸 (HCl) トリス( ヒドロキシメチル ) アミノメタン (NH2C(CH2OH)3) 硫酸アンモニウム ((NH4)2SO4) については シグマアルドリッチジャパン合同会社さんから購入した ハイドロキシアパタイト (Ca10(Po4)6(OH)2) については 日本ケミカルさんから購入した Micro BCA TM Protein Assay Kit については Thermo Fisher SCIENTIFIC 株式会社さんから購入した ビバスピン (VIVASPIN 2) については 四国理科株式会社から購入した 3-1-2. 粗酵素の調製 2-1-2. の培養液を遠心分離 (8000rpm, 4, 10 min) し 上清液を取り除いた 沈殿物を 50mM トリス緩衝液 (ph7.0) で懸濁 遠心分離 (8000rpm, 4, 10min) し 上清液を取り除き 沈殿物をトリス緩衝液で懸濁した 懸濁液を超音波処理 ( 出力 60%, 15min, 1 秒間隔で ON/OFF, Max 9 ) し 懸濁破砕液を遠心分離 (8000rpm, 4, 10 min) し 上清液を粗酵素液として回収した 3-2. 実験方法 3-2-1. 活性 2g/L アルギン酸ナトリウム水溶液 0.5mL に酵素液 0.2mL と 50mM トリス緩衝液 (ph7.0) 0.3mL を加え 振とう (37, 1h) 100 の沸騰水で反応を止めた その後 反応液 0.6mL に 33mMHCl を 0.6mL 加えて未反応のアルギン酸ナトリウムを除去するために遠心分離 (8,000rpm, 5min) した後 上澄み液の 235nm の吸光度を計測することでリア-ゼ活性により生じる不飽和ウロン酸量を測定 反応時間当たりの 測定した吸光度 235nm の値を活性として算出した 3-2-2. タンパク質量 タンパク質量については BCA Protein Assay Kit を用いて 説明書に従って 562nm の 吸光度を測定した 標準タンパク質としてウシ血清アルブミン (BSA) を使用した 3-2-3. 比活性 比活性は タンパク質量あたりの活性を用いて算出した 8
3-2-4. 精製度 精製度は 粗酵素の比活性あたりの精製した酵素の比活性から算出した 3-2-5. 硫安硫酸アンモニウムは 溶解度が高く また添加することで溶液中の塩濃度が高くなり タンパク質が凝集し 沈殿する この作用を利用し 酵素タンパク質の精製を試みた 粗酵素に溶液の硫安濃度が 40%,50%,60%,70% になるように硫安を添加し 1 時間冷却しながら振とう後 遠心分離 (8,000rpm, 5min) 沈殿物をトリス緩衝液で懸濁することで 硫安処理した酵素を回収し 比活性を算出した 3-2-6. Hap ヒドロキシアパタイトは 水酸化リン酸カルシウムのことで タンパク質などの分離 精製に使用されている そこで 硫安濃度 70% で処理した酵素液に 40%,50%,60%,70% の濃度で HAp を添加し 1 時間反応させ 遠心分離 (8,000rpm, 5min) した時の上澄み液を 吸着時の酵素として回収し 比活性を算出した また 沈殿物に 300mM リン酸緩衝液を添加し 1 時間反応させ 遠心分離 (8,000rpm, 5min) した時の上澄み液を 脱着時の酵素液として回収し 比活性を算出した 3-3. 結果と考察 3-3-1. 硫安による精製 硫安濃度が 70% の時 比活性の値が最も高くなっていることから 目的の酵素タンパク 質が多く沈澱していることがわかった 硫安濃度とそれに対する比活性のグラフ ( 図 3) 3-3-2. HAp による精製 HAp 濃度 60% の吸着時 酵素を最も精製できた また HAp 濃度 60% の時 脱着時と吸着時の比活性を比較したところ 脱着時の比活性が吸着時よりも低いことから HAp に目的ではない夾雑タンパク質が多く吸着していることがわかった HAp 濃度とそれに対する比活性のグラフ ( 図 4) 3-3-3. 精製度粗酵素と硫安濃度 70% で処理した酵素とそれを HAp 濃度 60% で処理した酵素の比活性を比較したところ 硫安濃度 70% で処理した酵素は 粗酵素の約 1.8 倍精製され HAp 濃度 60% で処理した酵素は 粗酵素の約 4.1 倍精製された 粗酵素と精製した酵素の比活性を比較したグラフ ( 図 5) 9
比活性 0.09 0.08 0.07 0.06 30 50 70 硫安濃度 (%) 図 3 硫安濃度とそれに対する比活性 10
比活性 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 吸着 脱着 30 50 70 HA 濃度 (%) 図 4 HAp 濃度とそれに対する比活性 11
比活性 0.4 0.3 4.1 倍 0.35 0.2 0.1 0.08 1.8 倍 0.15 0 粗酵素硫安 70% 酵素 HA60% 酵素 図 5 粗酵素と精製した酵素の比活性を比較したグラフ 12
第 4 章アルギン酸分解酵素の耐熱性 4-1. 実験材料調製 3-2-6. で得られた Hap60% 処理した吸着酵素を使用した 4-2. 実験方法酵素を 20,30,40,50,60 の温度で加温 (1h) した後 4g/L アルギン酸ナトリウム水溶液 0.5mL に酵素液 0.2mL と 50mM トリス緩衝液 (ph7.0) 0.3mL を加え 振とう (37, 2h) 100 の沸騰水で反応を止めた その後 反応液 0.6mL に 33mMHCl を 0.6mL 加えて未反応のアルギン酸ナトリウムを除去するために遠心分離 (8,000rpm, 5min) した後 上澄み液の 235nm の吸光度を計測することでリア-ゼ活性により生じる不飽和ウロン酸量を測定 反応時間当たりの 測定した吸光度 235nm の値を活性として算出した この時 一番活性の高いものを 100% とし 相対活性を比較することで耐熱性を調べた 4-3. 結果と考察 50 で 1 時間加温した酵素は 一番活性が高い箇所と比較すると 約 72% 活性の低下が見 られた 温度に対する相対活性のグラフ ( 図 6) 13
相対活性 (%) 100 80 60 40 100% 加温 (1 h) 20 0 28% 10 30 50 70 温度 ( ) 図 6 温度に対する相対活性のグラフ 14
第 5 章結言 Cellvibrio sp. OA-2007 が生産する酵素により アルギン酸が分解されていることを確認 できた 硫安と HA によりアルギン酸分解酵素を約 4.1 倍精製できた HA 処理を行なった 酵素は 50 で 1 時間加温したところ約 72 % 活性が低下した 15
謝辞 この研究を卒業論文として形にするにあたり 有賀修准教授に最後まで厳しくも熱心なご指導を賜りました ここに 深謝の意を申し上げます また 日頃から多くの知識と激励を頂きました川本雄基先輩 辛い研究の中に笑いを提供して頂きました坂口直人氏 毎日実験のモチベーションを高めて頂きました仲原将太氏 多大な助言 助力を頂きました安居菜摘氏 研究に行き詰まった際 多くの示唆を頂きました山崎和真氏に心より感謝するとともに 皆様のご活躍を祈っております 最後に日頃から 支えて頂いた百田研究室卒業生山口上昇先輩 環境理工学群の同期の方々 他学群のご友人方 有賀研究室の後輩方に感謝申し上げます 16
参考文献 1. 日野裕司海洋細菌 Pseudoalteromonas sp.al-430f 株由来のアルギン酸リアーゼ遺伝子の解析と発現酵素の性質三重大学大学院生物資源学研究科博士前期課程生物圏生命科学専攻修士論文 (2008) 2. 吉本雄大新規グリコシルグリセロールの合成とその特性高知工科大学大学院工学研究科基盤工学専攻物質 環境システム工学コース修士論文 (2009) 3. 久保元 Cellvibrio sp. OA-2007 由来の組み換えβ-アガラーゼの精製とキャラクタライゼーション高知工科大学大学院工学研究科基盤工学専攻物質 環境システム工学コース修士論文 (2009) 17