微生物の DNA 情報に基づ いたメタン発酵の制御 東京工業大学中崎清彦 nakasaki@ide.titech.ac.jp
メタン発酵プロセス 出典 :http://www.kobelco-eco.co.jp/product/biomass/methane.html( 一部改変 )
メタン発酵プロセス 真正細菌 (Bacteria) 古細菌 (Archaea) Methane gas
Biogas Granule (self-granuration of microorganisms) Granule Wastewater UASB methane fermentation reactor 出典 :http://www.kakokishoji.co.jp/products/kankyo/kousoku_uasb.html
UASB methane fermentation reactor Canning facility (ph control) Regulating tank A UASB Hot water Regulating tank B (Temp. control) Desulfurization & Deodorization Electricity 25W gas engine Gas reserver
Methane content (%) OLR (kg COD/m 3 /d) ph (-) GPR (m 3 /m 3 /d) 40 10 30 20 10 : OLR : GPR 8 6 4 2 0 100 80 60 40 20 : CH 4 : ph 0 10 9 8 7 6 0 5 0 50 100 150 200 Fermentation time (d) Fig. The courses of organic loading rate (OLR), gas production rate (GPR), gas compositions, and ph value during methane fermentation.
<PCR-DGGE :Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis> Cell lyses Exclusion of Lipid & Protein DNA purification Recovery of microbial cells lysozyme RNase 10%SDS phenol chloroform ethanol Gel electrophoresis :16S rdna PCR polyacrylamide 6-12% denaturing gradient 0-100% Primer : 357F 517R Denature : 93-30s Annealing : 65,60,55-30s Extension : 72-60s 30 cycles
16S rrna gene 1. カットしたバンド 2. PCR TA cloning ライゲーション DGGE PCR products 形質転換 プラスミド E.coli DGGE Sequence PCR PCR products プラスミド DNA 抽出 液体培養 カラーセレクション
Bacteria Time (day) 0 1 9 26 64 72 76 83 84 95 103 125 136 143 169 190 Thermotogaceae bacterium Spirochaeta caldaria Pelotomaculum propionicicum Uncultured bacterium Uncultured bacterium Uncultured Chloroflexi bacterium Uncultured Chloroflexi bacterium Band B6
Archaea Time (day) 0 1 9 26 64 72 76 83 84 95 103 125 136 143 169 190 Methanobacterium petrolearium Methanosaeta concilii Methanosaeta harundinacea Uncultured Archaeon Anaerobic methanogenic archaeon Uncultured Archaeon Methanosarcina mazeii
OLR (kg COD/m 3 /d) GPR (m 3 /m 3 /d) Bacteria Time (day) 0 1 9 26 64 72 76 83 84 95 103 125 136 143 169 190 B6 40 30 20 10 OLR, GPR Decrease ガス発生量 in の激減 GPR 0 0 50 100 150 200 Fermentation time (d) 10 8 6 4 2 0
定量的 PCR による Band B6 の濃度測定 Band B6 Geobacillus stearothermophilus Bacillus vulcani Geobacillus pallidus Geobacillus thermodenitrificans Geobacillus subterraneus Bacillus thermoalkalophilus Bacillus subtilis 相同性高い 相同性低い 相同性の低い領域からプライマーを設計
OLR (kg-cod/m 3 /d) ne content (%) OLR (kg COD/m 3 /d) ph (-) GPR (m 3 /m 3 /d) GPR (m 3 /m 3 /d) Relative B6 conc. (-) 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 40 1 40 30 30 20 20 10 Band B6 の微生物濃度 Relative DNA concentration 10 0 0 2 100 10 : CH 0 4 : ph 0 800 50 100 150 9 200 Fermentation time (d) 60 8 40 : OLR : GPR 10 8 6 4 2 7 10 8 6 4
既往の研究 Figure 2. DGGE patterns of (a) substrate and (b) outlet samples throughout the year using archaeal primers A934f/A1390r-GC as compared with the total gas production of the fermenter (given in m3 d1) at the respective sampling dates. For each sampling point, nucleic acids of two parallel extractions were loaded in equimolar amounts (40 ng each). The arrows indicate the most predominant species, identified as (I) M. wolfei, (II) Methanoculleus sp. and (III) an uncultured bacterium related to Geobacillus sp. ( 出典 :Malin, C. & Illmer, P.: Microbiological Research, 163, 503-511 (2008) )
既往の研究 Figure 1 Comparison of DNA concentration in substrate and total gas production of the bioreactor throughout 1 year (n = 43). ( 出典 :Malin, C. & Illmer, P.: Microbiological Research, 163, 503-511 (2008) )
< 従来のメタン発酵 > 馴養過程で有機物負荷を上昇させると装置性能が上昇する 但し 有機物負荷を上昇させすぎると急激な性能低下がおこる しかしながら この急激な性能低下を予測する方法はなかった < 本発明の特徴 > 急激な性能低下の指標微生物を見出した
Glycerol By-product (glycerol) 出典 : https://sgp.undp.org/index.php?option=com_sgpprojects&view=proj ectdetail&id=18378&itemid=205 出典 : http://www.chemrec.se/useruploadimages/artikelbilder%20che mrec%20news/nov2009%20chemrecnews/eu27_biodiesel_pro duction2008.jpg バイオディーゼルの生産量が年々増加している 副産物であるグリセロールの生成量も増加して 適正な処理が求められている 17
メタン発酵実験装置 培養条件 3 L of glass flask Temperature: 39 o C Hydraulic retention time (HRT): 4 days Glycerol was used as carbon source for synthetic wastewater 18
メタン発酵に必要な微生物を種菌として接種したスムーズなスタートアップ R2( 種菌を接種 ) R3( 種菌を接種せず ) 19
< 従来のメタン発酵 > 長時間をかけて馴養し その基質に適した微生物をメタン発酵装置内で優占種にする しかしながら 馴養には長時間が必要であった < 本発明の特徴 > メタン発酵に必要な微生物を明らかにし 種菌として接種することでメタン生成速度を発酵開始直後から大きくできる メタン発酵の立ち上げをスムーズにした
従来技術とその問題点 1. メタン発酵の急速な性能低下を予測する方法がない 2. メタン発酵のスムーズな立ち上げの方法がない 新技術の特徴 従来技術との比較 1. 従来技術はメタン発酵の急速な性能低下を後追い的に説明することが可能であったが 新技術は急速な性能低下を予測し 低下を回避するための情報を提供するものである 2. 従来技術は長時間をかけて馴養したが 新技術はメタン発酵に必要な微生物を種菌として接種することでメタン発酵のスムーズな立ち上げを可能にする
想定される用途 メタン発酵のスムーズな立ち上げを可能にする 高負荷運転時における突然の性能低下を回避することで高効率メタン発酵を可能にする 有機性廃棄物の適正処理に欠かすことのできない技術としてのメタン発酵の高性能化を可能にする 想定される業界 販売者として環境装置関連業界 環境計測関連業界使用者として廃棄物処理業者 自治体 食品製造業界 農家
実用化に向けた課題 指標微生物簡便検出のためのキット作成 メタン発酵の立ち上げに有効な種菌の大量生産 企業への期待 指標微生物簡便検出のためのキット作成 メタン発酵の立ち上げに有効な種菌の大量生産 メタン発酵装置の設置 販売上記 3 項目に興味のある企業 本技術に関する知的財産権 東京工業大学 山梨罐詰株式会社
お問い合わせ先 東京工業大学産学連携推進本部産学連携コーディネーター谷村修也 TEL 03-5734-7637 FAX 03-5734-7694 e-mail tanimura@sangaku.titech.ac.jp