変異原性 QSAR 本間正充 国立医薬品食品衛生研究所 変異遺伝部
何故今 変異原性 QSAR なのか? 医薬品の遺伝毒性不純物のリスク評価と管理への利用 QSAR による変異原性の評価と TTC による包括的管理 ICH-M7 ガイドライン化 (Step2) 化学物質の安全性評価への利用 スクリーニング評価 優先付け 動物愛護 (3R) の促進
医薬品中に含まれる遺伝毒性不純物とは? F 3 C X=Cl, Br X + NH 2 CN F 3 C CN Step 1 F 3 C Step 2 Pd catalyst/ Ligand N H 1) conc H 2 SO 4 Base toluene N H 2) toluene/ (1) heptane (2) O NH 2 Cl Step 3 Step 4 O Step 5 O O LiOt-Bu THF F 3 C N H O N H O O 1) NaBH 4 / MgCl 2 /MeOH 2) aqhcl F 3 C HN N H 3) Ethanol/water (3) (4) O 1) Cl O O Sodium carbonate Tetrahydrofuran 2) Ethanol/water F 3 C O HN O N O O Step 6 F 3 C CF 3 1) Br (5) Methylene chloride NaOH/TBAB F 3 C CF 3 O N O F 3 C 2) Ethanol/water N O O 合成過程の合成過程の試薬 反応中間体 副産物 医薬品の分解物 不純物 遺伝毒性?
医薬品の不純物に関する ICH 品質ガイドライン ICH Q3A: 原薬の不純物に関するガイドライン ICH Q3B: 製剤の不純物に関するガイドライン 最大一日投与量構造決定が必要な閾値安全性確認が必要な閾値 原薬 2 g 0.10% 又は 1 mg/ 日の低い方 0.15% 又は 1 mgの低い方 >2 g 0.05% 0.05% 製剤 <1 mg 1.0% 又は 5 μg/ 日の低い方 1 mg ~10 mg 0.5% 又は 20 μg/ 日の低い方 10 mg~2 g 0.2% 又は2 mg/ 日の低い方 >2 g 0.10% <10 mg 1.0% 又は 5 0 μg/ 日の低い方 10 mg ~ 100mg 0.5% 又は200 μg / 日の低い方 100 mg ~ 2 g 0.2% 又は3 mg/ 日の低い方 >2 g 0.15%
遺伝毒性からみた発がん物質の特徴 直接遺伝毒性発がん物質 DNA へ直接作用 DNA 損傷あり 突然変異の誘発あり 閾値なし 不可逆的変化 放射線 紫外線 アルキル化剤 多環芳香族炭化水素 アフラトキシン等 エームス試験 間接遺伝毒性発がん物質 DNA へ間接作用 DNA 損傷なし 突然変異の誘発あり 閾値あり 不可逆的変化 DNA 合成阻害剤 トポイソメラーゼ阻害剤 細胞分裂阻害剤等 ( 変異原性 ) 非遺伝毒性発がん物質 DNA へ間接作用 DNA 損傷なし 突然変異の誘発なし 閾値あり 可逆的変化 塩素化合物 ペルオキシゾーム増殖剤 ホルボールエステル ホルモン類 催眠薬 ( フェノバルビタール ) 等 染色体異常試験 小核試験 MLA
遺伝毒性閾値と TTC 反応 閾値あり化合物 ( 非遺伝毒性物質 ) 反応 閾値を問わない化合物 ( 遺伝毒性物質 ) 反応 閾値なし化合物 ( 遺伝毒性物質 ) 閾値 TTC 閾値なし 用量用量安全性量実質安全性量 (VSD) 安全性量? 用量
毒性学的懸念の閾値 (Thresholds of Toxicological Concern ;TTC) すべての化学物質について その値以下では明らかな健康被害がないとするヒトでの包括的な実質安全性閾値 (Virtual Safety Dose; VSD) の設定について述べた概念 1.5μg/ 人 / 日 0.025μg/kg bw/day 0.5 ppb 未知の化学物質の 10% が発がん物質と仮定して その 99% が 10-5 の発がんリスクで担保される設定閾値 医薬品に含まれる遺伝毒性 / 要注意構造を持つ発がん物質 (COC は除く )
医薬品遺伝毒性不純物ガイドライン (M7) 一般原則 対象は低レベルでDNAに直接損傷を与える変異原物質のみ 変異原物質はエームス試験で検出できる エームス試験の結果は (Q)SARによって予測可能である 変異原性が確認された場合はそのレベルを許容水準 (TTC 等 ) 以下にしなければならない
ハザード評価 I. 不純物の分類 II. 構造活性相関 (SAR) 解析 III. エームス試験 IV. In vivo 試験によるフォローアップ
遺伝毒性不純物の分類と管理方法 不純物分類カテゴリー 1 カテゴリー 2 カテゴリー 3 カテゴリー 4 カテゴリー 5 定義 既知の変異原性発がん物質 変異原性を有するが発がん性不明 原薬の構造に関連しないアラート構造を有する 変異原性データはない 原薬と類似したアラート構造を有する 原薬の変異原性は試験データは陰性 構造アラートの特徴なし 予想される管理方法 TCC or 他の方法 非変異原物質として評価
構造活性相関 ((Q)SAR) 解析 互いに相補的な2 種類の (Q)SAR 予測モデルを用いるべきである 1つは専門的な経験に基づくルールベースの方法 2つ目は統計ベースの手法である 用いられる (Q)SARモデルはOECD 原則に従い バリデーションされるべきである コンピュータシステムに基づいた解析の最終結果は 専門的知識を利用し判断されるべきである これは 陽性か陰性かの予測結果を支持する追加の証拠を提供すること および矛盾する結果が生じた場合の原因を理解することに重要である 2つの相補的な (Q)SAR( ルールベース 統計ベース ) により警告構造が無いことが指摘された場合は不純物に変異原性の懸念は無いと結論するのに十分であり それ以上 試験は必要ない DEREK Oncologic HazardExpert Toxtree ルールベース 統計ベース MCASE SciQSAR (MDL-QSAR) TOPKAT ADMEWORKS
DNA 反応性不純物の安全性確認のためのフローチャート 非変異原物質として評価 クラス 4, 5 クラス 1,2 不純物の分類 クラス 3 不純物含量は TTC レベルを超えているか? はい TTC もしくは個別管理 いいえ 更なる検討は不要 (Q)SAR? はい エームス? 陽性 いいえ いいえ 更なる検討は不要 更なる検討は不要 不純物の含量を TTC 以下に減らす もしくは in vivo 遺伝子突然変異試験を行い 生体影響を評価する
変異原性 (Q)SAR ツール Expert RULE-BASED Derek,OncoLogic,HazardExpert,Toxtree 化合物の構造からその毒性を予測する知識ベース (Knowledge Base) のエキスパートシステム 多くの知見から得られた部分構造活性相関 (SAR) の経験則をルール化した知識ベースにより, 定性的毒性予測を行う Hybrid OASIS-TIMES 化合物の構造からその毒性を予測する知識ベース (Knowledge Base) と統計を組み合わせもの 代謝予測機能を持つ Statistical QSAR-BASED Multi-Case 化学物質の構造と特徴を表す構造記述子と多数の部分構造 (Biophore) を機械的に検出し ベイズ統計理論を用いて毒性に関与する構造記述子を選別し 毒性を予測する MDL-QSAR,ADME-WORKS,TOPKAT 化学物質の構造を多数のパラメータ ( 数値データ ) に変換し 毒性と相関性の高いパラメータを用い 多変量解析 パターン認識により毒性を予測する
医薬品中変異原性不純物評価に推奨される (Q)SAR EU USA Japan, ICH Complement?
国内製薬企業の利用状況 ( 日本製薬協調査 ) DEREK or MCASE DEREK + Others DEREK 遺伝毒性不純物 の評価には何を使っているか?
Derek vs. Multi-CASE 購入実績 : 03 年 = 70 社以上 ( 国内 16 社 ) 現在 = 225 sites ( 国内 25sites) 購入実績 : 41 社 ( 国内 4 社 ) コンサルタント 39 件世界のメガファーマ 90% 以上 使用感 < プラス > すべての化合物が検索できる リスクの根拠が明らかである 操作が簡単である ユーザーの要望に沿い, プログラムが改善される ( ユーザー会議 ) 使用感 < マイナス > ユーザー独自の DB の作成 編集が複雑である 使用感 < プラス > ユーザー独自の DB の作成 編集が容易である DB 間の比較ができる 使用感 < マイナス > リスクの根拠が分かりづらい Smiles 記法に変換する必要がある 扱える原子種, 数が制限される
ICH-M7 Step2 ドラフトガイドライン http://www.ich.org/
化学物質の安全性評価への QSAR 等の利用の背景 改正化審法 (H23 年 4 月施行 ) ハザード評価からリスク評価へ 既存化学物質を含む全ての化学物質 ( 一般化学物質 : 約 2 万 ) のスクリーニング評価 優先評価化学物質の絞り込み (Q)SAR の利用 カテゴリーアプローチの利用
国立衛研で化学物質の変異原性評価に利用している (Q)SAR ツール DEREK Multi-Case(MCPC4) ADMEWorks (TIMES)
既存化学物質 (206) の (Q)SAR 予測 Ames + - In silico + - 19 21 7 159 40 166 DEREK Total 26 180 206 Applicability: 100.0% (206/206) Sensitivity 73.1 % Specificity 88.3 % Concordance 86.4 % Hayashi et al., Mutat Res, 588, 129-135 (2005) MCASE AWORKS Ames + - In silico + - 13 7 13 133 159 40 140 Total 20 146 166 Sensitivity 65.0 % Specificity 91.1 % Concordance 88.0 % Ames + - In silico + - 19 7 54 124 159 73 131 Total 26 178 204 Sensitivity 73.1 % Specificity 69.7 % Concordance 70.1 % Applicability: 80.6% (166/206) Applicability: 99.0% (204/206)
3 つの結果の組合せによる評価 Combination 1 DEREK MCASE AWORKS Positive Negative + - + + - - + - + + - + - + - - + + + - + - - - Combination 2 DEREK MCASE AWORKS Pos. Inconclusive + - + + - - + - + + - + - + - - + + + - + - - - Neg.
決定樹 (Combination 1) <MW 3,000 N Epoxide N Negative Y Y Positive MCASE DEREK AWORKS 2: +ve 2: -ve Positive Negative Ames + - In silico >++ > -- 19 77 23 147 42 154 Total 26 170 196 Sensitivity 73.1 % Specificity 86.5 % Concordance 84.7 % Applicability 95.1% (196/206)
決定樹 (Combination 2) <MW 3,000 N Epoxide N Negative Y Y Positive MCASE DEREK AWORKS =3: +ve =3: -ve Positive 2: +ve or 2:-ve Gray Negative Ames + - In silico +++ --- 19 13 23 5 2 7 147 94 18 96 Total 15 99 114 Sensitivity 86.7 % Specificity 94.9 % Concordance 93.9 % Applicability 55.3 % (114/206)
DEREK と MCASE によるエームス陽性物質の検出力 DEREK (%) MCASE (%) 一般化学物質 Hayashi et al., Mutat Res, 588, 129-135 (2005) 73.1% (19/26) 65.0% (13/20) 医薬品 Snyder, Environ Mol Mutagen 50, 435 (2009) 61.5% (23/38) 44.7% (18/38)
4 つの (Q)SAR モデルのエームス陽性物質の検出力 Hillebrecht A et al., Comparative Evaluation of in Silico Systems for Ames Test Mutagenicity Prediction: Scope and Limitations., Chem Res Toxicol, 24, 843-853, 2011)
香料の変異原性評価
367 種類の香料の変異原性評価
367 種類の香料の変異原性評価 偽陰性 エームス陽性の確認 (WOE) 新しいアラートの開発
新しいデータベースの構築 一般化学物質 + 医薬品 899 化合物からなる新しいデータベースの予測結果 Ames Positive (189) + judge SensitivityApplicability Ames Negative (709) - judge Specificity Applicability DEREK Ver.13 188 133 70.7 99.5 707 649 91.8 99.7 Mcase AZ2 158 92 58.2 83.6 656 631 96.2 92.5 ADMEWORKS Ver.4 with Ames-Proto1-5000 180 128 71.1 95.2 670 581 86.7 94.5 TIMES Ver 2.26.3 In domain 93 81 87.1 49.2 231 207 89.6 32.6 Ver. 2.26.3 in/out of domain 176 125 71.0 93.1 635 489 77.0 89.6 * 判定不能もしくは疑陽性を除外した
( オン 1,3,5-トリスオキシラニルメチル )-1,3,5-トリアジン 2,4,6(1H,3H,5H)-トリ + Active Positive MOL_NAME_J DEREK MCASE AWORKS 相補性? ルールベース vs. 統計ベース 物質名 DEREK MCASE AWORKS 物質名 DEREK MCASE AWORKS " ホルムアルデヒド + No Test Positive 1,1,1- トリクロロエタン ( 気体 ) - Inactive Positive 1,1-ジメチルヒドラジン + Inactive Positive 1,2-エポキシシクロヘキサン + Inactive Positive 1,2-ジクロロ -4-ニトロベンゼン + Active Positive 1,2-ジクロロエタン + Borderline Positive 1,2-ジブロモプロパン + Active Positive 1,2-ビス (2-クロロエトキシエタン + Inactive Positive 1,3-ジクロロプロペン + Active Positive 1,3-ジブロモプロパン + Active Positive 1,3-フェニレンジアミン二塩酸塩 + Active Positive 1,3-ブタジエン気体 + Borderline Negative 1,4-ジアミノアントラキノン + Active Positive 1,4-ジクロロ -2-ニトロベンゼン + Active Negative 1,4-ジヒドロキシアントラキノン + Active Positive 1,4-ジブロモブタン + Active Positive 1,5-ジニトロナフタレン + Active Positive 1,5-ジブロモペンタン + Active Negative 1,6-ジニトロピレン + Active Positive 2- ビニルピリジン - Inactive Negative 3-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸 - Inactive Negative アセトアセトアニリド - Inactive Negative ペロスピロン塩酸塩 - Active Negative ジエチレントリアミン - Inactive Negative 4,4'-ジアミノベンズアニリド - Inactive Positive N-アセトアセチル-p- トルイジン - Inactive Negative 2-アミノ-4-クロロフェノール - Active Negative リボフラビン 5'-モノホスファートナトリウム - Borderline Positive D-アラボアスコルビン酸 - Inactive Negative 8-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸 - Inactive Positive p,p'-ジベンゾイルキノンジオキシム - Inactive Positive 2,4,6-トリニトロフェノール - Active Positive p-アニシジン - Borderline Positive アントラキノン - Active Positive 1,6-ジニトロベンゾ [a] ピレン + Active Positive 1,8-ジニトロナフタレン + Active Positive 1,8-ジニトロピレン + Active Positive 1-アミノアントラキノン + Active Positive 1-エチル-1- ニトロソ-3- ニトログアニジン + Active Positive 1-クロロ -2,3-エポキシプロパン + Active Positive 1-クロロ -2,4-ジニトロベンゼン + Active Positive 1-クロロ -4-ニトロベンゼン + Active Positive 1-ナフチルアミン + Active Positive 1-ニトロベンゾ (a) ピレン + Active Positive 1-ブロモ-2-ヨードテトラフルオロエタン気体 - Prob.Inactiv Negative 1-ブロモ-3-クロロプロパン + Active Positive 2,3-ジクロロ -1,4-ナフトキノン + Inactive Positive 2,3-ジメチルアニリン + Active Negative 2,4,6-トリニトロフェノール - Active Positive 2,4-ジアミノトルエン + Active Positive 2,4-ジクロロニトロベンゼン + Active Positive 2,6-ジアミノピリジン - Active Negative 2,6-ジメチルアニリン - Inactive Positive 2-アセトアミドフルオレン + Active Positive 2-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸 - Inactive Positive 2-アミノ-4-クロロフェノール - Active Negative 2-アミノ-5-ニトロベンゾニトリル + Active Positive 2-アミノアゾトルエン + Active Positive 2-アミノアントラセン + Active Positive 2-アミノエタンチオール塩酸塩 - Inactive Positive 2-アミノベンゼンチオール - Inactive Negative 2-イミダゾリジンチオン - Inactive Negative 2-クロロ -4-ヨードアニリン - Inactive Positive 2-クロロエタノール + Borderline Positive 2-クロロニトロベンゼン + Active Positive 2-ニトロフルオレン + Active Positive 2-ビニルピリジン - Inactive Negative 2-ブロモプロパン + Inactive Negative 2-ブロモプロピオン酸 + Inactive Positive 2-ペンチルアントラキノン - Inactive Negative 2-メチル-5-ニトロベンゼンスルホン酸 + Active Negative 2-メトキシ-4-ニトロアニリン + Active Positive 2-メトキシ-5-メチルアニリン + Active Negative 3,3'-ジメチル-4,4'-ジアミノビフェニル + Active Positive 3,3'-ジメチル-4,4'-ビフェニリレンジイソシアナート + Poss.Activ Positive 3,4-キシリジン + Active Positive アントラセン - Inactive Positive アセチルアセトン - Inactive Negative チオフェノール - Inactive Negative 2-アミノベンゼンチオール - Inactive Negative 2,6-ジアミノピリジン - Active Negative ホスホロクロリドチオ酸 O,O-ジメチル - Prob.Inactiv Negative アセト酢酸メチル - Inactive Negative 二酸化チオ尿素 - Prob.Inactiv Positive m- アニシジン - Active Negative o-アニシジン - Borderline Negative L-システイン塩酸塩一水和物 - Inactive Positive 乳酸第 1 鉄三水和物 - Inactive Negative 2-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸 - Inactive Positive アクリル酸 2-( ジメチルアミノエチルエステル - Inactive Negative 4-(1-メチルエチルアニリン - Inactive Positive N-フェニルマレイミド - Inactive Negative シクロヘキセン - Inactive Negative 2-アミノエタンチオール塩酸塩 - Inactive Positive パラジクロロベンゼン気体 - Inactive Negative アクリル酸 2-ヒドロキシエチル - Inactive Negative 1,1,1-トリクロロエタン気体 - Inactive Positive イソブチロニトリル - Inactive Negative 2-クロロ -4-ヨードアニリン - Inactive Positive 1-ブロモ-2-ヨードテトラフルオロエタン気体 - Prob.Inactiv Negative ジチオりん酸 O,O-ジエチル - Prob.Inactiv Negative テモゾロミド - Inactive Positive テノホビルジソプロキシルフマル酸塩 - Prob.Inactiv Negative 4トリフルオロメチルアニリン ;4-アミノベンゾトリフルオリド - Inactive Negative 2,6-ジメチルアニリン - Inactive Positive 2-イミダゾリジンチオン - Inactive Negative 2-ペンチルアントラキノン - Inactive Negative o-ジアニシジン + Active Positive p-ニトロアニソール + Active Positive 1-クロロ -2,4-ジニトロベンゼン + Active Positive 1,4-ジクロロ -2-ニトロベンゼン + Active Negative 2-クロロニトロベンゼン + Active Positive マイトマイシン C + Poss.Activ Positive 2-アセトアミドフルオレン + Active Positive 7,12-ジメチルベンズ (a) アントラセン + Active Positive 2-アミノアントラセン + Active Positive メチルイエロー + Active Positive 2-ブロモプロピオン酸 + Inactive Positive 5-クロロ -2-ニトロアニリン + Active Positive 2-メトキシ-4-ニトロアニリン + Active Positive 1-アミノアントラキノン + Active Positive 2-アミノ-5-ニトロベンゾニトリル + Active Positive 169 エームス陽性物質 3,4-ジクロロ -1-ブテン + Inactive Positive 3,6 ジニトロベンゾ [a] ピレン + Active Positive 3'-アミノ-4'-メトキシアセトアニリド + Active Positive 3-クロロプロピオン酸 + Inactive Positive 3-ニトロアニリン + Active Positive 3-ニトロベンゾ (a) ピレン + Active Positive 3-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸 - Inactive Negative 4-(1-メチルエチルアニリン - Inactive Positive 4,4'-オキシビスベンゼンスルホニルヒドラジド + Prob.Inactiv Negative 4,4'-ジアミノジフェニルエーテル + Active Positive 4,4'-ジアミノベンズアニリド - Inactive Positive 4,4'-メチレンビス (2-クロロアニリン + Inactive Positive 4トリフルオロメチルアニリン ;4-アミノベンゾトリフルオリド - Inactive Negative 4-ニトロ -1,2-フェニレンジアミン一塩酸塩 + Active Positive 4-ニトロアニリン + Active Positive 4-ニトロベンゾイルクロリド + Active Positive 5-クロロ -2-ニトロアニリン + Active Positive 6-クロロ -2,4-ジニトロアニリン + Active Positive 7,12-ジメチルベンズ (a) アントラセン + Active Positive 7-アミノ-4-ヒドロキシ-2-ナフタレンスルホン酸 + Inactive Positive 8-アミノ-1-ナフタレンスルホン酸 - Inactive Positive 9-( ヒドロキシメチルアントラセン + Active Positive 9-アミノアクリジン 塩酸塩 + Active Positive CIピグメントレッド22 + Active Positive D-アラボアスコルビン酸 - Inactive Negative L-システイン塩酸塩一水和物 - Inactive Positive m-アニシジン - Active Negative m-フェニレンジアミン + Active Positive 2,4- ジクロロニトロベンゼン + Active Positive クロラニル + Borderline Positive 2,3-ジクロロ -1,4-ナフトキノン + Inactive Positive p-クロロベンゾトリクロリド + Active Positive 1,5-ジニトロナフタレン + Active Positive 1,8-ジニトロナフタレン + Active Positive p-トルエンスルホニルヒドラジド + Prob.Inactiv Negative p-フェニレンジアミン + Inactive Positive o-フェニレンジアミン + Active Positive 1,3-ジブロモプロパン + Active Positive ヒドラジン無水 + No Test Negative 1,1-ジメチルヒドラジン + Inactive Positive 2,4-ジアミノトルエン + Active Positive スチレンオキシド + Active Positive 硫酸ジエチル + Active Positive 4,4'-ジアミノジフェニルエーテル + Active Positive ブロモ酢酸 + Borderline Positive 2-ブロモプロパン + Inactive Negative 4-ニトロアニリン + Active Positive メチルヒドラジン + Active Positive グリオキサール + Borderline Positive trans-クロトンアルデヒド + Active Positive トルエン -2,6-ジイルジイソシアナート + Borderline Positive トルエン -2,4-ジイルジイソシアナート + Active Positive キノリン + Active Negative o-ニトロアニソール + Active Positive 1-クロロ -2,3-エポキシプロパン + Active Positive 3,3'-ジメチル-4,4'-ジアミノビフェニル + Active Positive 2- クロロエタノール + Borderline Positive N-アセトアセチル-p- トルイジン - Inactive Negative N-フェニルマレイミド - Inactive Negative o-アニシジン - Borderline Negative o-ジアニシジン + Active Positive o-ニトロアニソール + Active Positive o-フェニレンジアミン + Active Positive p,p'-ジベンゾイルキノンジオキシム - Inactive Positive p-アニシジン - Borderline Positive p-クロロベンゾトリクロリド + Active Positive p-トルエンスルホニルヒドラジド + Prob.Inactiv Negative p-ニトロアニソール + Active Positive p-フェニレンジアミン + Inactive Positive trans-クロトンアルデヒド + Active Positive アクリル酸 2-( ジメチルアミノエチルエステル - Inactive Negative アクリル酸 2-ヒドロキシエチル - Inactive Negative アセチルアセトン - Inactive Negative アセトアセトアニリド - Inactive Negative アセト酢酸メチル - Inactive Negative アムルビシン塩酸塩 + Active Positive アントラキノン - Active Positive アントラセン - Inactive Positive イソブチロニトリル - Inactive Negative キノリン + Active Negative グリオキサール + Borderline Positive グリシドール + Active Positive グルタルアルデヒド + Inactive Negative クロラニル + Borderline Positive クロロジフルオロメタン気体 + Inactive Negative クロロホルム気体 + Inactive Positive ジアセチル + (EQUIVOCAL) Inactive Positive ジエチレントリアミン - Inactive Negative シクロヘキセン - Inactive Negative ジクロロメタン気体 + No Test Positive ジチオりん酸 O,O-ジエチル - Prob.Inactiv Negative ジニトロソペンタメチレンテトラアミン + Active Positive ジメチルニトロソアミン + Active Positive シンナムアルデヒド + Inactive Negative スチレンオキシド + Active Positive 3,3'-ジメチル-4,4'-ビフェニリレンジイソシアナート + Poss.Activ Positive 3,4-キシリジン + Active Positive 1-ブロモ-3-クロロプロパン + Active Positive 1,2-エポキシシクロヘキサン + Inactive Positive ジニトロソペンタメチレンテトラアミン + Active Positive 3'-アミノ-4'-メトキシアセトアニリド + Active Positive 6-クロロ -2,4-ジニトロアニリン + Active Positive ブロモアセチルブロミド + Prob.Inactiv Positive 3-ニトロアニリン + Active Positive 4-ニトロ -1,2-フェニレンジアミン一塩酸塩 + Active Positive ビス (2-クロロエチルエーテル + Inactive Positive 塩化メチル気体 + Active Positive ジクロロメタン気体 + No Test Positive ヨウ化メチル気体 + No Test Positive 2-メトキシ-5-メチルアニリン + Active Negative 臭化メチル気体 + Active Positive 1,4-ジヒドロキシアントラキノン + Active Positive ブロモ酢酸エチル + Active Positive グルタルアルデヒド + Inactive Negative 1-ナフチルアミン + Active Positive 1,3-ブタジエン気体 + Borderline Negative クロロジフルオロメタン気体 + Inactive Negative 塩化エチル気体 + Active Positive 1,2-ジブロモプロパン + Active Positive メタリルクロリド + Inactive Negative 1,5-ジブロモペンタン + Active Negative 1,4-ジブロモブタン + Active Positive 1,4-ジアミノアントラキノン + Active Positive ベンジルクロリド + Inactive Positive フェニルヒドラジン + Inactive Positive 1,3,5-トリスオキシラニルメチル )-1,3,5-トリアジン 2,4,6(1H,3H,5H)- + Active Positive トリオン 9-アミノアクリジン 塩酸塩 + Active Positive + Borderline Positive + Active Positive ベンゾ [a] ピレン + Active Positive シンナムアルデヒド + Inactive Negative 1,2-ジクロロエタン + Borderline Positive 1,3-ジクロロプロペン + Active Positive ジメチルニトロソアミン + Active Positive チオフェノール - Inactive Negative ディスパーズレッド 206 + Prob.Inactiv Positive テトラクロロエチレン ( 気体 ) + Inactive Positive テノホビルジソプロキシルフマル酸塩 - Prob.Inactiv Negative テモゾロミド - Inactive Positive トリレンジイソシアナート + Active Positive 1,6-ジニトロベンゾ [a] ピレン + Active Positive 3,6 ジニトロベンゾ [a] ピレン + Active Positive 1,6-ジニトロピレン + Active Positive 1,8-ジニトロピレン + Active Positive 1-エチル-1- ニトロソ-3- ニトログアニジン + Active Positive ホルムアルデヒド + No Test Positive フリルフラマイド + Active Positive トルエン -2,4- ジイルジイソシアナート + Active Positive メチルグリオキサール + Prob.Inactiv Positive トルエン -2,6- ジイルジイソシアナート + Borderline Positive ニトロソグアニジン + Active Positive ニトロソグアニジン + Active Positive + Active Positive パラジクロロベンゼン ( 気体 ) - Inactive Negative ビス (2-クロロエチルエーテル + Inactive Positive ヒドラジン無水 + No Test Negative + Active Positive フェニルヒドラジン + Inactive Positive 1-ニトロベンゾ (a) ピレン + Active Positive 3-ニトロベンゾ (a) ピレン + Active Positive + Active Positive フリルフラマイド + Active Positive ブロモアセチルブロミド + Prob.Inactiv Positive ブロモ酢酸 + Borderline Positive ブロモ酢酸エチル + Active Positive ペロスピロン塩酸塩 - Active Negative ベンジルクロリド + Inactive Positive ベンゾ [a] ピレン + Active Positive ホスホロクロリドチオ酸 O,O-ジメチル - Prob.Inactiv Negative + Active Positive マイトマイシン C + Poss.Activ Positive メタリルクロリド + Inactive Negative 2-ニトロフルオレン + Active Positive 2-アミノアゾトルエン + Active Positive m- フェニレンジアミン + Active Positive メトキシメタノール + Inactive Negative 7-アミノ-4-ヒドロキシ-2-ナフタレンスルホン酸 + Inactive Positive 3,4-ジクロロ -1-ブテン + Inactive Positive 2,3-ジメチルアニリン + Active Negative 2- メチル -5- ニトロベンゼンスルホン酸 + Active Negative トリレンジイソシアナート + Active Positive メチルイエロー + Active Positive CI ピグメントレッド 22 + Active Positive メチルグリオキサール + Prob.Inactiv Positive ディスパーズレッド 206 + Prob.Inactiv Positive メチルヒドラジン + Active Positive 1,2- ジクロロ -4- ニトロベンゼン + Active Positive メトキシメタノール + Inactive Negative 4- ニトロベンゾイルクロリド + Active Positive モキシフロキサシン塩酸塩 + Active Negative 塩化アリル + Active Positive ヨウ化メチル ( 気体 ) + No Test Positive 四塩化炭素 ( 気体 ) + Inactive Negative リボフラビン 5'- モノホスファートナトリウム - Borderline Positive クロロホルム ( 気体 ) + Inactive Positive 塩化アリル + Active Positive 塩化エチル気体 + Active Positive 塩化メチル気体 + Active Positive 四塩化炭素気体 + Inactive Negative 臭化メチル気体 + Active Positive 二酸化チオ尿素 - Prob.Inactiv Positive 乳酸第 1 鉄三水和物 - Inactive Negative 硫酸ジエチル + Active Positive + Borderline Positive + Active Positive + Active Positive + Active Positive 1-クロロ -4-ニトロベンゼン + Active Positive 3-クロロプロピオン酸 + Inactive Positive グリシドール + Active Positive 1,3-フェニレンジアミン二塩酸塩 + Active Positive テトラクロロエチレン気体 + Inactive Positive 9-( ヒドロキシメチルアントラセン + Active Positive モキシフロキサシン塩酸塩 + Active Negative + Borderline Positive アムルビシン塩酸塩 + Active Positive 4,4'-メチレンビス (2-クロロアニリン + Inactive Positive 4,4'-オキシビスベンゼンスルホニルヒドラジド + Prob.Inactiv Negative 1,2-ビス (2-クロロエトキシエタン + Inactive Positive + Active Positive + Active Positive M: MCASE A: AWORKS DEREK(-) 46 物質 M(-)/A(-): 24 (52%) M(+)/A(+): 4 (9%) M(+)/A(-): 5 (11%) M(-)/A(+): 13 (28%) DEREK(+) 123 物質 M(-)/A(-): 8 (7%) M(+)/A(+): 89 (72%) M(+)/A(-): 8 (7%) M(-)/A(+): 18 (15%) ジアセチル + (EQUIVOCAL) Inactive Positive
エームス試験以外の遺伝毒性 QSAR In vitro 染色体異常試験の予測 DEREK MCASE AWORKS TIMES In vivo 遺伝毒性試験の予測 DEREK TIMES
既存化学物質の染色体異常試験結果の予測 DEREK Chrom. ab. + - In silico + - 60 34 29 86 159 89 120 Total 94 115 209 Sensitivity 63.8 % Specificity 74.8 % Concordance 69.9 % Applicability: 95.4 % (209/219) MCASE AWORKS Chrom. ab. + - In silico + - 55 10 30 82 159 65 112 Total 85 92 177 Sensitivity 64.7 % Specificity 89.1 % Concordance 77.4 % Chrom. ab. + - In silico + - 71 46 27 69 1 117 96 Total 98 115 213 Sensitivity 72.4 % Specificity 60.0 % Concordance 65.7 % Applicability: 80.8 % (177/219) Applicability: 97.3 % (213/219)
In vivo 遺伝毒性予測のためのフロー (1) Level I Level II Level III in vitro mutagenicity in vivo liver genotoxicity in vivo MN genotoxicity not active not active not active chemical not active not active (detoxification) active Mekenyan et al. Investigating the relationship between in vitro - in vivo genotoxicity: Derivation of mechanistic QSAR models for in vivo liver genotoxicity and in vivo bone marrow micronucleus formation which encompass metabolism. Chem Res Toxicol. 25, 277-296 (2012) active not active (bio-exhausting) active
In vivo 遺伝毒性予測のためのフロー (2) Level I Level II Level III in vitro Mutagenicity AMES (with S9), CA, MLA in vivo liver Genotoxicity Comet, UDS, TRMA 33 negative 31 negative in vivo MN bone marrow genotoxicity 30 negative 1 positive 162 chemical 2 positive 2 negative 125 positive 40 negative 34 negative 6 positive 85 positive 32 negative 53 positive
In vivo 遺伝毒性予測のためのフロー (3) Level I Level II Level III in vitro Mutagenicity AMES (with S9), CA, MLA in vivo liver Genotoxicity Comet, UDS, TRMA 33 negative 31 negative in vivo MN bone marrow genotoxicity 30 negative 1 positive H O HCH H 3 Cl CH 3 O CH 3 O H H O CH 3 2 positive Level II Liver bioactivation 2 negative Cyproterone acetate 125 positive 40 negative 34 negative 6 positive 85 positive 32 negative 53 positive
Cyproterone acetate Cyproterone acetate の遺伝毒性発現経路
TIMES の遺伝毒性予測能力 Level I Level II Level III in vitro mutagenicity in vivo liver genotoxicity in vivo MN genotoxicity <Ames with metabolic activation> Sensitivity 73% Specificity 78% <CA with metabolic activation> Sensitivity 75% Specificity 56% <Liver UDS, Comet, TGR> Sensitivity: 85% Specificity: 49% <Bone marrow MN> Sensitivity: 82% Specificity: 61%
変異原性 遺伝毒性予測の問題点 遺伝毒性試験は発がん性を予測できるのか? 遺伝毒性試験結果は発がん性試験結果と一致するか?( 定性的予測 ) 遺伝毒性の程度は発がん性の程度と相関するか?( 定量的予測 ) げっ歯類の発がん性はヒトでの発がん性と相関するのか? 遺伝毒性 QSAR 遺伝毒性試験 げっ歯類発がん性試験 ヒト発がん性
ラットとマウスによる発がん性試験の相関性 発がん性 ラット マウス 1989 *1 1999 *2 + + - - + - + - 67 32 36 131 111 47 54 180 一致率 74%(198/266) 74%(291/392) *1 Haseman, JK et al., Environ Health Perspect., 74, 229-235, 1987 *2 NTP, January 1999
遺伝毒性試験とげっ歯類発がん性試験の相関性 報告 エームス MLA 染色体異常 小核 (Vitro) 小核 (Vivo) Krikland et al., Mutat. Res. 584, 1, 2005 感度 特異性 58.8 73.9 73.1 39.0 65.6 44.9 78.7 30.8 Zeiger Reg. Tox. Pharm. 28, 85, 1998 感度 特異性 54.0 79.0 74.0 32.0 52.0 68.0 28.0 82.0
エームス試験の強さは発がん性の強さと相関するか? リスクの緩和
一般化学物質と医薬品不純物の化学物質構造の比較 一般化学物質 医薬品中不純物して検出しうる化合物 (Galloway et al, in preparation)
構造クラス別の許容レベル (10-5 リスク ) とその分布 Alert Name Number in CPDB % in CPDB Number in Synthetic Routes % in Synthetic Routes Daily dose Resulting in a 1 in 100,000 Excess Cancer Risk (µg) Min. 10% 25% Med. 75% 90% Max. Aromatic amine or amide, N hydroxylamine 43 21.6 125 20.8 0.40 0.824 2.30 14.94 67.71 279.24 3636 N-Nitro or N-nitroso compound 34 17.1 0 0.0 0.009 0.04 0.098 0.35 2.81 8.98 38.52 Aromatic nitro compound 33 16.6 88 14.6 0.017 0.77 4.95 13.68 139.80 296.88 793.20 Alkylating agent 19 9.5 156 25.9 2.94 3.65 6.65 45.36 79.95 1149 1656 Aromatic azo compound 9 4.5 8 1.3 1.13 1.13 1.95 4.62 73.02 844.80 844.80 Epoxide 5 2.5 13 2.2 1.79 1.79 5.355 36.84 36.84 36.84 36.84 Halogenated alkene 5 2.5 0 0.0 0.44 0.44 2.865 12.24 20.1 21.48 21.48 (Galloway et al, in preparation)
まとめと展望 医薬品不純物の変異原性の評価に (Q)SAR を用いることが国際ガイドラインに組み入れられた この流れは (Q)SAR の利用 研究の追い風となる (Q)SAR による予測率の向上は 試験データの量と質が重要である 産官の協力により大量化学物質データベースの構築が望まれる 遺伝毒性 (Q)SAR 結果は遺伝毒性の有無だけでなく 構造に依存した遺伝毒性や 発がん性の程度を提供することにより リスク評価 管理に利用できる 遺伝毒性メカニズムに基づく (Q)SAR モデルにより 特定のエンドポイントの予測を超えた遺伝毒性の予測が可能となる