メンブレンメーカーだから知っているウェスタンブロッティングのコツ ラボジャパン事業本部 バイオサイエンス営業部間瀬久
Contents 1 ウェスタンブロッティングの概要 2 電気泳動 & 転写 3 免疫検出 4 トラブルシューティング 5 吸引ろ過を用いた免疫反応 2
ウェスタンブロッティングの概要 3
ウェスタンブロッティングの概要 サンプル調製電気泳動転写免疫検出 タンパク質精製 分離 濃縮 タンパク質の分離 分離したタンパク質のブロッティング膜への転写 特定のタンパク質の有無を検出 化学的サンプル調製 / 細胞 オルガネラ溶解液 アフィニティビーズ ( アガロース & 磁気 ) 濃縮 / 脱塩 電気泳動ゲル ローディングバッファー ポジティブコントロール 分子量マーカー 泳動槽 ブロッティング装置 転写バッファー メンブレン ブロッティング用ろ紙 タンパク質染色試薬 ブロッキング 洗浄液 1 次抗体 2 次抗体 検出試薬 4
ウェスタンブロッティングを成功に導くために - タンパク質のメンブレンへの結合 + 抗体反応 孔径 0.45mm/0.2mm + 疎水結合による吸着 5
6 電気泳動 & 転写
電気泳動 SDS によってタンパク質の表面荷電を負電荷で打ち消されることで タンパク質は分子量に依存して ゲルの電場中を移動 電気泳動の Tips 目的タンパク質が適切に解析できるアクリルアミドゲル濃度を選択 一定電圧 低電圧で泳動すると バンドのゆがみ防止に 7
転写 ~ 転写において重要なこと ~ 1 バッファー 2 電流 電圧 3 メンブレン 溶出 メタノール SDS 電流 電圧 吸着 メタノール SDS 電流 電圧 メンブレンの孔径 保持 メンブレンの材質 8
転写 ~ 転写バッファー ~ メタノール ゲルのサイズ保持 膨潤を防止する 脱水効果によりゲルを収縮させるため過剰の添加は溶出効率を低下させる 高分子タンパク質は溶出しにくいため メタノール濃度を下げる ( 10%) ことで溶出効率が改善する メンブレンへの吸着力の向上 バッファーやゲル中に含まれる SDS を除去しタンパク質の疎水性を高め タンパク質とメンブレンとの相互作用を強める 低分子タンパク質は吸着力が低いため 15~20% に濃度を上げると吸着力が向上する 9
転写 ~ 転写バッファー ~ SDS 溶出効率の向上 タンパク質の溶解性を高めることでアクリルアミドゲルからのタンパク質溶出促進 メンブレンとタンパク質の相互作用を阻害 アミノ酸の疎水基と疎水結合を起こすことでメンブレンとタンパク質の疎水性相互作用を阻害する 10
転写 ~ ゲルの平衡化 ~ 平衡化 ゲルを転写バッファー中で 10-15 分平衡化することで SDS が除かれ タンパク質がメンブレンへ結合しやすくなる 11
転写 ~ 転写装置 ~ Wet Tank System タンク式とセミドライ式 セミドライ式とタンク式では 転写スピード サンプルへの熱の影響が異なる Semi-Dry Tank System タンク式 セミドライ式 転写スピード遅い速い 熱の影響受けにくい受けやすい 12
転写 ~ メンブレンの材質 ~ Nitrocellulose 初めてウェスタンブロッティングに使用された材質 プレウェッティング不要 強度が弱い 結合容量が低い PVDF (polyvinylidene fluoride) メタノールなどによるプレウェッティングが必要 複数回のストリッピング リプロービング可能 長期間保存可能 結合容量が高い 13
転写 ~ メンブレンの孔径 ~ 0.45 µm 低バックグラウンドを実現する 低い表面積率 ( 内部表面積 ) 20kDa のタンパク質で最も使用される 0.2 µm タンパク質吸着容量をもたらす 高い表面積率 ( 内部表面積 ) <20kDa の低分子タンパク質 少量タンパク質のブロッティングに 注意!! 0.2mm 孔径のメ 孔径 厚さ ンブレンはバッ内部表面積 * タンパク質結合量 ** クグラウンドが Immobilon-P 0.45µm 140 µm 高くなりやすい 400 100 Immobilon-P SQ 0.2 µm 200 µm 1300 270 14 * 内部表面積 (m 3 )/ 外部面積 (m 3 ) **mg BSA/cm 2
転写 ~ メンブレンの孔径 ~ 吸着力の低い低分子タンパク質は0.2mmのメンブレンを使用することで吸着力を補うことができる A 0.45mm B 0.2mm C 0.2mm C 0.2mm A 0.45mm B 0.2mm 15
16 免疫検出
検出 ~ 検出方法 ~ 化学発光検出発色検出蛍光検出 主流な検出法 検出感度が複数 感度が低い ( 化学発光のおよそ 1/10) シグナルが安定 定量的 17
検出 ~ 抗体濃度 ~ 抗体希釈により 全体的なバックグラウンドが低減するサンプル量を減らすことにより エキストラバンドが低減する ヒト血清からのトランスフェリンの検出 1:1/1000 2:1/5000 3:1/25000 4:1/125000 5:1/625000 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 18 一次抗体の希釈 1/10,000 1/50,000 1/50,000 二次抗体の希釈 1/50,000 1/10,000 1/50,000
検出 ~ 抗体濃度と検出試薬 ~ 高感度試薬を用いて抗体濃度を調節することでより高感度のシグナルを得ることができる of ERK1 kinase in rat liver lysates. 低感度試薬高感度試薬高感度試薬 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 : 15μl 2 : 7μl 3 : 3.5μl 一次抗体の希釈 1/10,000 1/10,000 1/200,000 二次抗体の希釈 1/50,000 1/50,000 1/200,000 19
検出 ~ 適正な検出条件の選択 ~ 検出感度はサンプル量と抗体の親和性により変化 1 次抗体濃度 1:1000 1:5000 1:10,000 20
ブロッキング ~ オーバーブロッキング ~ 5%NFDM 0.5% NFDM 0.1% NFDM 0.05% NFDM NFDM 濃度の希釈によってオーバーブロッキングを防ぐことが可能 21
ブロッキング ~ 非タンパク質のブロッキング剤 ~ 蛍光検出 リン酸化タンパク質の検出 自家蛍光を抑制 リン酸化タンパク質によるバックグラウンドを抑制 5% NFDM Bløk-FL 5% NFDM Bløk-PO 22
23 トラブルシューティング
転写 ~ 低分子タンパク質の転写 ~ 0.2 µm の転写メンブレンを使用 転写バッファーに10-20% のメタノールを添加 転写バッファーからSDS を除く 転写時間の短縮 メタノール SDS 転写時間メンブレン 低分子タンパク質 ペプチド 高分子タンパク質 0.22 um 0.45 um 24
転写 ~ 高分子タンパク質の転写 ~ ゲルの平衡化時間を長く 転写バッファーのメタノール濃度を下げる 低電圧で長く転写をする メタノール SDS 転写時間メンブレン 低分子タンパク質 ペプチド 高分子タンパク質 0.22 um 0.45 um 25
検出 ~ 抗体濃度の調製 ~ 問題 1 次抗体濃度 2 次抗体濃度 バックグラウンドが高い バンドが薄い 検出できない リバースウェスタン ( 目的バンドは白く 他は黒い状態 ) 26
27 SNAP i.d. 吸引式免疫反応システム
SNAP i.d. ~ 反応 ~ 従来の振盪器を用いた 分子拡散による反応 SNAP i.d. を用いた 吸引ろ過による反応 膜表面に比べて 膜内部の反応効率 洗浄効果が低下する 溶液が膜を通過するため 膜内部でも高い反応効率 洗浄効果を維持 28
従来法と SNAP i.d. のウェスタンブロッティングの所要時間比較 1 次抗体の添加とインキュベーションブロッキング 洗浄 2 次抗体の添加とインキュベーション 洗浄 ~1 時間 1 時間 ~O/N ~15 分 >1 時間 ~15 分 従来の免疫検出 20 秒 10 分 1 分 10 分 1 分 SNAP i.d. 4-20 hrs vs 22 min 吸引ろ過を使用することで所要時間が 30 分以内に! 29
従来法 vs SNAP i.d. ~ 試薬のレシピ ~ SNAP i.d. を効果的に使用するためには条件の最適化が必要 Step 従来法 SNAP i.d. ブロッキング 5% NFDM 0.5% NFDM 一次抗体濃度 1x 3~5x 洗浄 (3x) 1x 1x 二次抗体濃度 1x 3~5x 洗浄 (3x) 1x 1x 30
従来法 vs SNAP i.d.~ 洗浄効率 ~ 31
SNAP i.d. TM Works for Proteins of Different Molecular Weights 220 目的タンパク質の分子量 (kda) 200 100 50 10 60 Akt 38 p38 Src 44 42 Nestin 180 EGFR 100 90 Hexon 70 rin 60 53 58 Hsp70 Albumin Vimentin P53 42 Erk1/2 34 38 Actin 36 SOX-2 Synaptophysin GAPDH 18 Cyclophilin A 66 32 低 タンパク質の発現量 高
Summary ウェスタンブロッティング転写 メタノールと SDS の濃度確認 ゲルの平衡化 小さい分子の捕捉には0.2mm SNAP i.d. での免疫反応 22 分でブロッキングから 2 次抗体の反応まで 反応条件の迅速確認に最適 条件を最適化することで ウェスタンをより有効な研究ツールに ブロッキング 検出 1 次抗体 2 次抗体の濃度の調製 最適試薬選択 抗体反応を妨害しないブロッキング試薬 速いねん 吸ったら ウェスタンは 最適な感度の検出試薬を選定 33
ご清聴ありがとうございました www.millipore.com/western All information presented today can be found at this site 34