イオン化法

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1 分子のイオン化法 日立製作所中央研究所 平林集 1

2 はじめに 分子のイオン化法は 質量分析分野を中心に発達 以下では 気相 液相 固相サンプルに対し 各々代表的なイオン化法を駆け足で紹介 イオン化法 : 昔から知られるイオン化現象を利用 効果があれば実用化 エネルギー領域は 数 ev が主 2

3 目次 1. はじめに 2. 質量分析法の応用 3. 気相分子のイオン化 4. 液相分子の噴霧イオン化 5. 固相分子の脱離イオン化 3

4 タンパク質解析用の質量分析装置 4

5 質量分析計とは 質量分析計 試料 イオン源 質量分析部 検出部 情報処理 5

6 質量分析法におけるイオン生成 衝突誘起解離 (CID) を用いた M/M 分析 衝突 イオン 前駆体イオン ( 特定のイオン ) 窒素 アルゴン フラグメントイオン 6

7 質量分析法におけるイオン生成 気体分析 不揮発性物質 生体物質の分析 ポイント : 分子量関連イオンの高効率生成 イオン化 破壊的なイオン化 電子イオン化 電界イオン化表面イオン化光イオン化化学イオン化噴霧イオン化脱離イオン化 7

8 2. 質量分析法の応用 8

9 GC/M や LC/M による分析 GC( ガスクロマトグラフ ) LC( 液体クロマトグラフ ) を結合 混合サンプル 分離 (GC, LC,,) 質量分析計 (M) インターフェース : イオン源 m/z が重なるイオンを識別 イオン強度の定量性を確保 9

10 LC/M を用いた農薬の一斉分析 混合サンプル 液体クロマトグラフ LC 質量分析計 M 液体クロマトグラフ イオン源 質量分析計 10

11 LC/M を用いた農薬の一斉分析 マスクロマトグラム ( 特定のm/zにおけるイオン強度の時間変化 ) イオ Ion Intensity (x10**6) ン強度 a) 酸性農薬 0.5/I ハ イアル 1 注入 1 TD 1 - スタンタ ート スキャン b) 酸性農薬 0.5/I ハ イアル 1 注入 1 TD 1 - スタンタ ート スキャン 233 c) 酸性農薬 0.5/I ハ イアル 1 注入 1 TD 1 - スタンタ ート スキャン d) 酸性農薬 0.5/I ハ イアル 1 注入 1 TD 1 - スタンタ ート スキャン e) 酸性農薬 0.5/I ハ イアル 1 注入 1 TD 1 - スタンタ ート スキャン 370 f) 酸性農薬 0.5/I ハ イアル 1 注入 1 TD 1 - スタンタ ート スキャン 199 g) 酸性農薬 0.5/I ハ イアル 1 注入 1 TD 1 - スタンタ ート スキャン 213 h) 酸性農薬 0.5/I ハ イアル 1 注入 1 TD 1 - スタンタ ート スキャン 239 i) 酸性農薬 0.5/I ハ イアル 1 注入 1 TD 1 - スタンタ ート スキャン 229 j) 酸性農薬 0.5/I ハ イアル 1 注入 1 TD 1 - スタンタ ート スキャン 307 k) 酸性農薬 0.5/I ハ イアル 1 注入 1 TD 1 - スタンタ ート スキャン 326 l) 酸性農薬 0.5/I ハ イアル 1 注入 1 TD 1 - スタンタ ート スキャン Retention Time (min) 保持時間 ( 分 ) Retention Time(min) BUNEKI KAGAKU 50 (2001)

12 ピーク面積12 LC/M を用いた農薬の一斉分析 標準物質による検量線 ( ピーク面積より 実サンプル量を決定 ) Cx 試料量 (pg)

13 信号強度 LC/M を用いた農薬の一斉分析全イオ度ン強 HN Dymron (M.W. 268) CH3HCONHCCH30.2 ppb CH3151 LC/M を用いた農薬の一斉分析 保持時間 (min) 保持時間 ( 分 ) 40 13

14 LC/M を用いた農薬の一斉分析 Ion Intensity (a. u.) Ion Intensity (a. u.) m/z Dymron? 0 衝突誘起解離 (CID) M/Mスペクトル m/z m/z Dymron の標準試料 m/z Dymron の標準試料 M/M 14

15 タンパク質の網羅的解析 ( プロテオーム解析 ) 核 DNA mrna リポソーム アミノ酸 アミノ酸が配列したもの タンパク質 遺伝子情報 タンパク質 15

16 D L L L D G TAN K 相対イオン強度(%タンパク質の網羅的解析 ( プロテオーム解析 ) アミノ酸配列 : A V D D F L L L D G T A N K G D L L L F ) m/z M/M スヘ クトル 16 F

17 全イオン電流タンパク質の網羅的解析 ( プロテオーム解析 ) 保持時間 ( 分 ) M スヘ クトル M/M スヘ クトル 同定タンハ ク質 タンハ ク質サンプル ナノ LC M DB 照合 17

18 3. 気相分子のイオン化 18

19 Ⅰ. 電子イオン化法 (EI) フィラメント 電子ビーム 磁石 引き出し電極 静電レンズ P ~ 10-4 Pa リペラー電極 B E e - M 試料ガス 磁石 イオン放出穴 19

20 Ⅰ. 電子イオン化法 (EI) イオンは 分子量関連イオンまたはフラグメントイオン M + e - M + + 2e - ( 電子エネルギー ~70eV) ( 大抵の物質はイオン化エネルギーが 10eV 程度 ) M + F 1+, F 2+, F 3 +,, ( フラグメント化 ) 分子量が1000 以下の揮発性有機化合物の分析に有効 ( 炭化水素 油脂 アルカロイド ステロイド 農薬 ダイオキシン 香料 芳香剤など ) 豊富なフラグメントイオン情報により 物質の特定に有利 20

21 Ⅰ. 電子イオン化法 (EI) ダイアジノン (M.W. 304) の質量スペクトル M + 大抵は 正イオンが検出 質量スペクトル DB 利用可能 21

22 Ⅱ. 化学イオン化法 (CI) CI イオン源は EI イオン源で気体圧力を約 10 倍上昇させたもの イオン源で イオンと分子との衝突回数が増加 分子量関連イオン生成に有利 1 反応イオンの生成 ( イソブタンの例 ) C 4 H 10 + e - C 4 H 9+ + H + 2e - 2 化学イオン化 ( イオン分子反応 ) C 4 H 9+ + M [M+H] + + C 4 H 8 22

23 Ⅱ. 化学イオン化法 (CI) 代表的なイオン分子反応 1. プロトン移動反応 : プロトン親和力が支配 [M 1 +H] + + M 2 [M 2 +H] + + M 1 2. 電荷移動反応 : イオン化エネルギーが支配 He + + O 2 O 2+ + He 23

24 Ⅱ. 化学イオン化法 (CI) ダイアジノン (M.W. 304) の質量スペクトル EI M + CI [M+H] + 日立テクニカルデータシート No

25 Ⅱ. 化学イオン化法 (CI) 負イオン検出にも有利 1. 電子捕獲 ( 付着 ) 反応 : 電子親和力 (EA) の高い物質に有効 ( 電子の多数回衝突 低エネルギー電子の発生 ) e - + M M - ( 電子エネルギー <1eV) 2. アニオン付加反応 ( ハロゲン化合物ガスによる F -, Cl -, Br -, I -, 等の反応イオン発生 ) Cl - + M [M+Cl] - 25

26 Ⅲ. 大気圧化学イオン化法 (APCI) CI は イオン源圧力が高いほど イオン化 ( 反応 ) 効率が高い イオン源を真空中から大気中に移動 ( 大気圧 CI: 圧力 10 6 倍 ) 反応イオン生成には コロナ放電を利用 ( 電子ヒ ーム利用困難 ) 放電電極 ( 針 ) 差動排気部 ( 中間圧力部 ) 約 4kV 試料ガス M 電子エネルギーが比較的低く 試料を破壊しない コロナ放電プラズマ ( 弱電離プラズマ ) 真空ポンプ真空ポンプ 26

27 Ⅲ. 大気圧化学イオン化法 (APCI) 放電プラズマは全体で中性だが 正負イオンは分離される APCIでは 放電電極への印加電圧の極性に応じて 分析イオンの極性を変更することができる 放電電極 ( 針 ) +HV e - M 放電電極 ( 針 ) -HV [M+H] + [M-H] - M - M 正イオンモード 負イオンモード 27

28 信号強Ⅲ. 大気圧化学イオン化法 (APCI) 黒色火薬 度64 イオン電流 (A) m/z 時間 ( 秒 ) 危険物の実時間モニター 青線 :m/z = 96 赤線 :m/z = 98 28

29 難揮発性物質のイオン化 加熱による気化? 熱分解し 分子量関連イオンが生成しない 気体化せずに直接イオン化する? 1. 噴霧イオン化現象の利用 2. 脱離イオン化現象の利用 29

30 4. 液相分子の噴霧イオン化 30

31 Ⅰ. エレクトロスプレーイオン化法 (EI) イオン強Ⅰ. エレクトロスプレーイオン化法 (EI) チトクロムC(M.W ) 100 n=16 n=15 80 n=17 [M + nh] 60 n+ n=18 n=14 度プロトン付加分子が生成 高極性物質の場合は多価イオン生成 n=13 n= m/z 31

32 Ⅰ. エレクトロスプレーイオン化法 (EI) テイラーコーン 大気 M 細管 ( キャピラリー ) 帯電液滴 1. 高電界により液体コーンが形成 2. 先端から帯電液滴が静電力により生成 32

33 イオン印加電圧全Ⅰ. エレクトロスプレーイオン化法 (EI) 不安定 使用範囲 量EI 放電 200V 不安定 33

34 Ⅰ. エレクトロスプレーイオン化法 (EI) テイラーコーン 帯電液滴 安定なテイラーコーン 直径の揃った帯電液滴 d = g ~ 1ミクロン ( ε ) 3 εε Q / K 0 34

35 Ⅰ. エレクトロスプレーイオン化法 (EI) レイリー限界 溶媒の蒸発 イオン間静電反発力と液体表面張力が同等に 液滴は不安定化 複数の液滴に分裂 噴霧 帯電液滴 ( 約 1μm) 気化 帯電液滴 ( 約 10nm) 35

36 Ⅰ. エレクトロスプレーイオン化法 (EI) Rayleigh の不安定条件 クーロン反発力が液体の表面張力と同等になると 液滴は分裂する (Rayleigh 分裂 ) 4 1 πε 0 e 2 d N 2 2 = 2 πγ d 36

37 Ⅰ. エレクトロスプレーイオン化法 (EI) d=3μm 462μs d=1.9μm Rayleigh 分裂は不均等 72μs d=1.7μm d=0.2μm + d=0.02μm + Anal. Chem. 65 (1993) 972A. 37

38 Ⅰ. エレクトロスプレーイオン化法 (EI) 電荷残留 帯電液滴からのイオン生成 イオン蒸発 表面電界 ~1V/nm 38

39 droplet + + x δ 帯電液滴から溶媒和イオン蒸発 Ⅰ. エレクトロスプレーイオン化法 (EI) Ⅰ. エレクトロスプレーイオン化法 (EI) ( ) ( ) + Δ + = Δ δ πε πε πε d Ne G x e x d Ne G s x エネルギー障壁 ΔG:ΔG x の最大値

40 Ⅰ. エレクトロスプレーイオン化法 (EI) + + droplet + x + δ ΔG = 2 e πε N 2d 1 Δ G ΔG 0 の場合にイオン蒸発が発生 N d 2 の関係が成立 E~10 9 V/m の場合に イオン蒸発を確認 帯電液滴から溶媒和イオン蒸発 40

41 Ⅰ. エレクトロスプレーイオン化法 (EI) 液体コーン ( テイラーコーン ) 安定なテイラーコーン形成が重要 液体の電気伝導度 表面張力 流量により決定 純水 ( 低い電気伝導度 高い表面張力 ) の噴霧は困難 通常 液体に酢酸や蟻酸を 0.1-1% だけ添加 41

42 Ⅰ. エレクトロスプレーイオン化法 (EI) 開発初期の EI: 流量 =1~10μL/ 分 蒸発 蒸発 ナノ EI: 流量 1μL/ 分 蒸発効果抑制 安定な液体コーン形成 42

43 Ⅱ. ソニックスプレーイオン化法 (I) 試料溶液 ガス流 高速ガス流を用いた噴霧により イオン生成 生成イオン量はガス流速に依存し 音速時に最大 43

44 Ⅱ. ソニックスプレーイオン化法 (I) 10ns-flash shadowgraph 液体 ガス 剪断力による液滴の生成 ガス 44

45 イオン強Ⅱ. ソニックスプレーイオン化法 (I) 音速 度 ガス流量 (L/min) Abundance (%) トリエチレングリコール ( 不揮発性液体 ) Droplet Diameter ( μm) 噴霧により生成される液滴のサイズは音速時に最小 Anal. Chem. 66 (1994)

46 Ⅱ. ソニックスプレーイオン化法 (I) Droplet surface 0.1μm ガス流 帯電液滴 46

47 電荷1.8 x 10-6 数Ⅱ. ソニックスプレーイオン化法 (I) μ = 1.1 x 10-5 (m 2 /Vs) 4.8 x 10-6 移動度 ( 印加電圧 ) Int. J. Mass pectrom. Ion Proc. 175 (1998) 帯電液滴の直径 (μm) 47

48 Ⅲ. ガス噴霧支援エレクトロスプレーイオン化法 ガス噴霧支援エレクトロスプレー噴霧ガス液体コーン ( テイラーコーン ) ガス 大気 金属キャピラリー 液滴 1. ガス噴霧により 帯電液滴の気化を促進 2. 噴霧ガスには 窒素ガスを使用 3. 液体流量 :1~1000μL/ 分 48

49 Ⅲ. ガス噴霧支援エレクトロスプレーイオン化法 ガス 細管 ( キャピラリー ) 移動度の差により帯電液滴を排除 帯電液滴 大気 差動排気部 M 49

50 Ⅲ. ガス噴霧支援エレクトロスプレーイオン化法 ガス 差動排気部 イオン取り込み細孔 ( 径 0.4mm) カウンターガス オクタポールイオンガイド 質量分析部 窒素ガス RP (500L/ 分 ) TMP (300L/ 分 ) 50

51 Ⅲ. ガス噴霧支援エレクトロスプレーイオン化法 P o P 1 l = 0.67D P 0 高圧側 l P 1 細孔 ( 内径 D) 超音速噴流 マッハディスク 断熱膨張 冷却によるクラスター化 51

52 5. 固相分子の脱離イオン化 52

53 Ⅰ. レーザー脱離イオン化法 パルスレーザー光照射による固体表面のスパッター現象を利用 レーザー光 イオン サンプル サンプルプレート 53

54 Ⅰ. レーザー脱離イオン化 銅板にピコ秒 (35ps) の Nd:YAG レーザー (λ1.06μm) を照射 イオン生成に数 100ps 必要 表面の銅が局所的に溶解 気化 電子 ( 密度 ~10 26 m -3 数 10eV) が表面から放出 EIによりイオン化 Appl. Phys. Lett. 77 (2000)

55 Ⅰ. レーザー脱離イオン化 金属表面に有機物を塗布し レーザー光を照射しても 分子量関連イオンが生成されない 多種類のフラグメントイオンが観測されるが 解析困難 そこで 試料にグリセリンなどの難揮発性物質 ( マトリックス ) を混合 さらに 金属微粒子をマトリックスに混入 分子量 34,000 のタンパク質の分析に成功 K. Tanaka, et. al., Proceedings of the econd Japan-China Joint ymposium on Mass pectrometry, Osaka, 1987, p

56 Ⅱ. マトリックス支援レーザー脱離イオン化法 (MALDI) 5~20 μl 乾燥 結晶化 サンプルプレート サンプルプレート 56

57 Ⅱ. マトリックス支援レーザー脱離イオン化法 (MALDI) レーザー光 マトリックス分子 マトリックスの急激な温度上昇による気化 及び イオン化 - 過剰エネルギーはマトリックスが吸収 ターゲットプレート 57

58 Ⅱ. マトリックス支援レーザー脱離イオン化法 (MALDI) 脱離の初期 帯電したマトリックスクラスター [M+H] + レーザー光 [m-h] - マトリックス分子 [m-h] - [M+H] + [m-h] - ターゲットプレート 58

59 Ⅱ. マトリックス支援レーザー脱離イオン化法 (MALDI) 1. 脱離の初期 : 統計的な帯電 結晶中のイオンが 帯電クラスターに 帯電クラスターからマトリックス分子が気化 2. 高温 高圧プルームでの反応 気相イオン分子反応 ( プロトン移動 電荷交換 ) 59

60 Ⅱ. マトリックス支援レーザー脱離イオン化法 (MALDI) 1. レーザー (UV, IR) 2. マトリックスの選択 レーザー光波長での吸収係数が高い 試料分子が電荷を帯びる環境を提供 3. 大過剰マトリックスに試料を混合 結晶化 3. レーザー光強度 ( 数 10~100J/m2) マトリックス DHBA (2, 5- dihydroxybenzoic acid) HABA (2-(4- hydroxyphenylazo) benzoic acid) A (inapinic acid) 代表的なマトリックス CHCA (α-cyano-4- hydroxycinnamic acid) 主な対象物質 合成高分子 低分子有機化合物 糖類 合成高分子 低分子有機化合物 タンパク質 ペプチドペプチド 60

61 Ⅱ. マトリックス支援レーザー脱離イオン化法 (MALDI) 飛行時間型質量分析計 (TOFM) との結合では イオンがエネルギー的 空間的に収束される ことが 感度や分解能に重要 ところが レーザー光照射直後は イオンのエネルギー幅が広い 待つ 61

62 Ⅱ. マトリックス支援レーザー脱離イオン化法 (MALDI) ~1μs レーザー光照射 プルーム ( 高温高圧プラズマ ) 冷却 ビーム レーザー光照射から 1μs 程度遅らせ イオンビームを発生させる Delayed Extraction 62

63 Ⅱ. マトリックス支援レーザー脱離イオン化法 (MALDI) Delayed Extraction 法 : レーザー光照射後 1μs 程待つ レンズ ミラー レーザー サンプルプレート デフレクター V 1 ~1μs TOF V 2 V 1 V 2 Anal. Chem. 67 (1995)

64 まとめ 気相分子のイオン化法 EI: 電子との衝突によるイオン化 CI, APCI: 反応イオンの生成と気相イオン分子反応 液相分子の噴霧イオン化法 EI: 安定な液体コーンからの帯電液滴の静電的な放出 I: 音速ガス流の剪断力による帯電液滴の生成 噴霧カ ス支援 EI: 静電力と剪断力による帯電液滴の生成 固相分子の脱離イオン化法 LD: レーザー光照射によるスパッター ( 溶解 気化 EI) MALDI: マトリックス中イオンによる統計的帯電と CI 64