陽性の場合 : 沈澱塊が流れないか 滞りまたは粗くくずれる ( ざらざらした感じで流れる ) 注 部分凝集や部分溶血を認めた場合は 凝集反応も同時に観察されるため 凝集の強さの右上に略号を記入する ( 例 2 mf PH ) D ) 試験管を逆さにして上清を除去する その後試験管を元に戻す 1 逆さ

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1 Ⅰ. 輸血検査 ( 用手法 ) の基本操作 1. 輸血検査の基本操作 A) 試験管への記名 ( 検体名 ( 検体番号 ) 試薬名 ) は 試薬 検体を入れる前に行う B) 試薬 検体分注時は 洗浄びんの先端 ピペットの先端を試験管内に入れない C) 試薬 検体は 1 滴が5μlになるように滴下する 試薬に付属のピペットは 切り口が水平になるように滴下する 検体分注用ディスポピペットは 約 45 度に傾けて滴下する D) ~5% 赤血球浮遊液の調整は 試験管に生理食塩液を約 1~1.5ml 分注し 赤血球沈層を 1 滴滴下する E) 試薬は室温に戻してから使用する F) 試験管への滴下は 試薬 検体が内壁に付かないように注意する 滴下後は確実に分注されているかを目視で確認する G) 試薬 検体を分注する順番は 色の薄い物を先に滴下する 1 ABOオモテ検査とD 抗原検査 : 抗 A 抗 B 抗 D Rhコントロール試薬を先に滴下する 2 ABOウラ検査 : 被検血清 ( 血漿 ) を先に滴下する 不規則抗体検査 : 被検血清を先に滴下する 4 赤血球解離試験 (DT 解離液 ) パネル血球試薬を先に滴下する ( 解離液はあと ) H) 抗ヒトグロブリン抗体を添加後は 直ちに混和し すみやかに遠心する 間接抗グロブリン試験判定では再遠心をしない I) 血球試薬は 泡立てないようおだやかに転倒混和し 試薬びんのドロッパーで吸い上げ 吐き出しをして均一に赤血球を浮遊させた後に滴下する J) 試薬の滴下後は 密栓前に試薬びんのドロッパーの中身を吐き出しておく K) 試薬と検体を試験管に滴下したら 直ちに充分混和する L) 恒温槽から試験管を取り出す際は 他の試験管に注意しつつタオル等で水滴を拭き取る M) 判定結果の記録は 先ず試験管に記名した検体名 試薬名等の確認を行い 判定のつど結果記入欄に記入する N) 遠心条件について 1 凝集反応判定時の遠心 遠心力は 9~1G( 回転数では 4rpm) 時間は 15 秒 もしくは 遠心力は 1~125 G( 回転数では 1rpm) 時間は 6 秒で遠心する 2 血球洗浄時 ( 用手法 ) の遠心 2. 反応の見方 遠心力は 9~1G( 回転数では 4rpm) 時間は 6 秒で遠心する < 溶血の有無 血球の量 > A ) 遠心後 直ちに上清の溶血の有無 血球の量を確認する 試験管を傾けた際 赤血球沈澱塊から 流れ出した先端が 試験管長の 2/ 程 度まで流れるまで ゆっくり傾け 一旦 その角度で保持 特 に赤血球沈殿塊か らの流れ始めの部 分を観察する 陰性は滑らかに流 れ出す B ) 試験管をゆっくり傾け 赤血球沈澱塊からほぐれた赤血球の流れ具合を観察 注 2 する < 凝集反応判定時 手にする試験管本数の目安 > 1 血液型 : 抗 A と抗 B A 1 と B 抗 D と Rh コントロール の各 2 本組 2 不規則抗体スクリーニング 交差適合試験 :2~ 本 凝集が認められたら 直ちに 1 本に持ちかえ慎重に観察する 不規則抗体同定 被凝集価判定 :1 本 C ) 引き続き 小さな振とうを与え試験管を優しく振り赤血球沈澱塊をほぐす D ) 再度試験管を傾け 赤血球の流れ方を観察する E ) 赤血球沈澱塊が管底から完全に再浮遊して 赤血球または凝集の一様な浮遊液が できるまで C) D) を繰り返す 背景の色調と部分凝集反応の有無にも注意する F ) 凝集の有無 反応強度および凝集の状態を観察する 注 判定のつど [ 表 -1] に基づいて結果を記録し 残しておく < 注釈 > 注 1 試験管を遠心機から振動を与えないように取り出し 試験管立てに並べる 溶血があればその程度を記録する 注 2 白い紙かビューアーの上で行う 天井の蛍光灯を見上げての判定は行わない 陰性の場合 : 赤血球が一筋の糸状に流れる 注 1

2 陽性の場合 : 沈澱塊が流れないか 滞りまたは粗くくずれる ( ざらざらした感じで流れる ) 注 部分凝集や部分溶血を認めた場合は 凝集反応も同時に観察されるため 凝集の強さの右上に略号を記入する ( 例 2 mf PH ) D ) 試験管を逆さにして上清を除去する その後試験管を元に戻す 1 逆さにした状態にして一旦止め できる限り上清を除去し 残らないようにする 2 感染の可能性のある上清を飛び散らせないため 試験管 Grde Score 凝集像 背景の特徴 個の大きな塊 透明 1 数個の大きな凝集塊 透明 2 8 中程度の大きさの凝集塊 透明 1 5 多数の小さな凝集塊 非凝集の赤血球を認める 1W 4 ごく小さな凝集 非凝集赤血球で赤く濁る Wor± 2 肉眼で観察できる非常に小さな凝集 非凝集赤血球で赤く濁る 凝集も溶血も認めない 赤く濁る mf 部分凝集 : 凝集と非凝集血球の混在 赤く濁る H 完全溶血 上清赤く透明 PH 部分溶血 : 一部分の溶血と凝集 上清赤味透明 mf: mixed field gglutintion H: Hemolysis PH:Prtil Hemolysis 上清をペーパータオルで除去する際は 吸水を同じ所でしない 複数本実施するときは 試験管口を接触させない ( コンタミ防止のため ) を大きく振って上清を除去しない 試験管を逆さにしたまま試験管口をペーパータオルに押しあて 残った上清を除去する 最終洗浄後には必ず行う 4 ペーパータオルを交換するなど コンタミネーションに注意する 5 途中 試験管を元の位置に戻し また逆さにすると血球. 血球洗浄方法 ; 用手法 ( 間接抗グロブリン試験の血球洗浄法 ) が流出するので注意する A ) 試験管を強く数回振り 血球を均一に浮遊させる 4. 検体の取り扱い A ) 検体の採取 1 プレイン採血管 ( 凝固血液 ) か EDTA 加採血管 ( 抗凝固血液 ) で 5~7ml 採血する 血球が渦をまいて舞い上がる程度の勢いで 生理食塩液を噴射し 血球の分布を均一にする B ) 洗浄びんの生理食塩液を噴射させ 試験管長の 8%(4/5 程度 ) まで生理食塩液を満たす 1 試験管口の中央部に生理食塩液を噴射する 2 洗浄びんの先端を試験管に入れない 飛沫が上がらないように注意する 4 試験管口を指で蓋をしない C ) 9~1G(4rpm)/1 分遠心する 赤血球系検査のための患者検体として 凝固血液 ( 血清 ) あるいはEDTA 血液 ( 血漿 ) のどちらも使用できる 血清検体を検査に用いている施設が血漿検体に切り替える場合 EDTA 加検体では弱反応性を示す臨床的に意義のある抗体が検出できることを確認する ( 赤血球型検査 ( 赤血球系検査 ) ガイドラインより ) 2 検体を採取するタイミングについては 輸血や妊娠など赤血球による免疫応答 (1 次あるいは2 次応答 ) の結果 抗体が産生される しかしながら 輸血あるいは妊娠による免疫から抗体産生までの期間についてはまったく予測できない このことを考慮に入れて 不規則抗体スクリーニングや交差試験用の検体は採血されなければならない 連日にわたって輸血を受けている患者では 少なくとも 日 (72 時間 ) ごとに検査用検体を採血する また 過去 ヶ月以内に輸血あるいは妊娠歴の

3 ある患者では 輸血予定日に先立つ 72 時間を目安に患者から検査用検体を採血する 検体の取り違いをチェックするために 血液型検査と交差適合試験に用いる検体は異なる時点で採血した検体を用いて検査をする ( 検体のダブルチェック ) 4 ABO 血液型は同一患者から異なる時点で採血された血液で 2 度検査して確定する ( 患者取り違えの防止 ) 5 検体ラベルの剥がれた検体 ラベルの二重貼り検体等 不審な点のある検体を検査に用いない 6 検体は溶血していてはならない 7 血清中のフィブリン塊の混入は 偽陽性や非特異反応を引き起こす原因となるので 必ず取り除く 8 原則として輸液ラインからの採血は避けるべきであるが やむをえず輸液ラインから採血する場合は ラインを生理食塩液でリンスし 5ml 程度 ( あるいは ライン容量倍量程度 ) の血液を廃棄した後に採血する B ) 検体の保存輸血後の副作用や合併症が生じた場合の原因究明 追跡調査と治療に役立てるため 血液型 不規則抗体検査 交差適合試験等の残余検体は 血球と血清 ( 血漿 ) に分離し 血球には生理食塩液 アルセバー液等を加え4 で1~2 週間 血清 ( 血漿 ) は-2 以下で2~ヵ月以上 ( 交差適合試験は6 カ月以上 ) 出来るだけ長期に凍結保存する 輸血用血液のセグメントは 4 で数週間保存しておくことが望ましい また 輸血後肝炎などの感染性輸血副作用発生に備え 輸血前の患者検体を保管する 分離剤の入った専用採血管で別採血し 開栓することなく遠心分離して -2 以下で凍結保存 ( 輸血後 2 年以上 ) することが望ましい 輸血前後の感染症検査に関する患者検体の保存については 輸血療法の実施に関する指針 の Ⅶ 実施体制の在り方 4. 患者検体の保存を参照する 自動血球洗浄遠心機 ( 間接抗グロブリン試験の赤血球洗浄等 ) B ) 冷蔵庫 冷凍庫 1 輸血用血液製剤は自記温度記録装置 警報装置を備えた専用の保冷庫 冷凍庫を自家発電装置に接続し保管しなければならない 2 試薬 検体保管用冷蔵庫 冷凍庫に血液製剤を保管してはならない 自記温度記録装置 警報装置の付いたものが望ましい C ) 恒温槽 (7~6 ) 抗体感作 解離試験 血清の不活化など D ) 判定用光学器具 ( 必要に応じて使用する ) 1 凝集反応判定用ビューアー ( 背景が乳白色で明るさが均一な間接透過光のビューアーが望ましい ) 2 拡大判定用光学機器 : 顕微鏡 ( 1~2の弱拡大)/ 拡大鏡 ( 凹面鏡 ) 6. 機器管理機器や設備は適正に稼動していることを常にチェックし 保守点検に努める 点検時には点検表に日時 内容 点検者名を明記するとともに 責任者の確認欄を設け記録し保管する A ) 遠心機 1 判定用遠心機 2 自動血球洗浄遠心機 B ) 保冷庫 保管庫 冷凍庫 1 温度管理 2 警報装置 放熱盤フィルター 4 恒温槽 5. 使用する主な機器類 A ) 遠心機 1 検体分離用遠心機 2 判定用遠心機 輸血検査専用のものが望ましい 7. 使用する主な器具類 A ) 小試験管 (1 75mm または 12 75mm) B ) 試験管立て ( ステンレス製 < 金網型 >) もしくは試験管台 ( ステンレス製 < 打抜き型 >)

4 C ) 検体分注用ディスポピペット ( スポイト<1 滴が約 5μl>) D ) 検体希釈用マイクロピペット ( 抗体価等検査用 ) 月 1 回のピペット検定を実施することが望ましい E ) 洗浄ビン ( ポリエチレン製 ) F ) 載せガラス ( スライドガラス ) G ) かくはん棒 ( 竹ぐし 爪楊枝など ) H ) タイマー 電池切れとなっていないか 正確に作動しているか確認後に使用する 8. 使用する主な試薬類 A ) 血液型検査に使用する試薬 1 ABO 血液型 (1) オモテ検査 1) 抗 A 血液型判定用抗体 ( 以下抗 A 試薬 ) 2) 抗 B 血液型判定用抗体 ( 以下抗 B 試薬 ) ) 抗 A&B 血液型判定用抗体 ( 以下抗 A&B 試薬 ) 4) 抗 A 1 レクチン 5) 抗 Hレクチン ( 必要に応じて準備 使用する ) (2) ウラ検査 1) 約 %A 1 血球試薬 2) 約 %B 血球試薬 ) 約 %O 血球試薬 ( 必要に応じて準備 使用する ) 2 Rh (D) 血液型 (1) 抗 D 血液型判定用抗体 ( 抗 D 試薬 ) (2) Rhコントロール試薬 ( 使用する抗 D 試薬とアルブミン濃度が同じもの ) B ) 不規則抗体スクリーニングおよび交差適合試験に使用する試薬 1 抗体スクリーニング用赤血球試薬 (Di 抗原陽性の血球を含む ) 2 抗体同定用パネル赤血球試薬 反応増強剤 (1) ウシアルブミン液 (2) ポリエチレングリコール液 (PEG) () 低イオン強度液 (LISS) 4 抗ヒトグロブリン抗体 (1) 抗 IgG (2) 広範囲 () 抗補体 5 酵素液 (1) ブロメリン液 (2) フィシン液 () パパイン液 6 IgG 感作赤血球試薬 ( クームスコントロール赤血球 ) 抗グロブリン試験実施時には 抗ヒトグロブリン抗体判定後陰性の場合 IgG 感作赤血球試薬を加え 2~の凝集があることを確認する もし凝集が認められない時は 抗グロブリン試験は無効となるため 再検査を行う 7 酵素コントロール ( 必要に応じて準備することが望ましい ) C ) 生理食塩液 (.9% 塩化ナトリウム液 ) 1 塩化ナトリウム9.gを蒸留水に溶解し1mlとする 2 生理食塩液の最適 phは 6.5~7.5(7.2) である 不適正なpH(pH8. 以上 ph6. 以下 ) では 抗体の解離や反応減弱などが起こり得る 生理食塩液は作り置きをしない 継ぎ足しはせずこまめに作りなおす 生理食塩液単独では緩衝作用がないため 空気中の炭酸ガスが溶け込み phが酸性側に傾く 生理

5 食塩液に緩衝液等を加え最適域内に ph を調整することが望ましい 9. 試薬管理 A ) 各試薬の添付文書は必ず熟読し 正しく使用する B ) 各試薬のロット番号 有効期限など記録し管理する C ) 用いる試薬 ( 抗血清や赤血球試薬 ) は被凝集価及び凝集力を定期的に測定し 記録しておく D ) 試薬は室温に戻してから使用する 長時間放置すると 力価や特異性を失う可能性があるので使用時以外は 冷蔵保存する E ) 試薬の細菌などの汚染に注意する ピペットの先端を直接手でさわらない F ) 試薬に濁り 変色 溶血を認めた場合は使用しない 1. 精度管理 A ) 内部精度管理を実施する 精度管理実施の記録を残しておく 精度管理実施前には 試薬の浮遊物や溶血の有無など目視確認をする B ) 外部精度管理 実技講習会に積極的に参加し手技の確認や技術の向上に努める

6 新人サポート研修会輸血検査 輸血検査の基本テクニック ~ 輸血検査の標準化に向けて ~ 血液型検査 輸血検査研究班 藤田保健衛生大学長谷川勝俊 血液型検査 ABO 血液型の検査は 抗 A および抗 B 試薬を用いて 患者血球の A および B 抗原の有無を調べるオモテ検査と 既知の A 1 および B 血球試薬を用いて 患者血清中の抗 A および抗 B 抗体の有無を調べるウラ検査を行わなければならない オモテ検査とウラ検査の結果が 一致している場合に血液型を確定することができる 一致しない場合にはその原因を精査する必要がある Rho(D) 抗原の検査は 抗 D 試薬を用いて Rho(D) 抗原の有無を検査する 血液型検査 ; 試験管法操作 1. 検体を遠心し 血清 ( 血漿 ) を分離する 2. 1 検体あたり 7 本試験管を準備する. 試験管に検体名 ( 検体番号 ) 各試薬名を記名する 4. 赤血球浮遊液用試験管に生理食塩液を 1~1.5ml 分注し 1 の検体より赤血球沈層を 1 滴滴下し ~5% 赤血球浮遊液を調整する 5. 抗 A 抗 B 抗 D Rh コントロール試薬を対応する試験管に各 1 滴滴下する 6. 検査用試験管 A 1 B に被検血清を各 2 滴滴下する 7. 4 で調整した ~5% 赤血球浮遊液を 5 の試験管に各 1 滴滴下する 8. A1 B 血球試薬を転倒混和し 赤血球を均一に浮遊させた後 6 の試験管に各 1 滴滴下する 9. よく混和後 9~1G(4rpm)/15 秒遠心する 1. 溶血 凝集の有無を観察し 判定結果を記録する 11. 血液型を判定する 血液型検査 ; 試験管法の注意点 同一患者の 2 重チェック 同一患者から 異なる時点での 2 検体で血液型検査を実施する 同一検体の 2 重チェック 同一検体で 異なる二人の検査者がそれぞれ独立に血液型検査を実施し 照合確認する 乳児の検査 ABH 抗原は未発達であるが存在する 血清中の抗 A 抗 B 抗体は 生後 4 カ月未満では検出できず オモテ ウラ不一致となる 乳児の判定は オモテ検査のみとなるため 慎重に行う ABO 血液型の判定基準 ( 試験管法 ) オモテ検査 ( 赤血球側 ) ウラ検査 ( 血清側 ) 抗 A 抗 B A1 血球 B 血球 () (-) (-) () (-) () () (-) (-) (-) () () () () (-) (-) () は凝集 (-) は非凝集を示す 血液型 A B O AB 判定のポイント 試験管法のオモテ検査で凝集の強さが 4 以外は 精査を行う オモテ検査で部分凝集 (mf) を疑う場合は スライド法を実施する ウラ検査の凝集の強さは患者により異なる 1 以下の場合は 精査を行う 判定はオモテ検査 ウラ検査が一致していることを原則とする オモテ検査 ウラ検査との結果に矛盾があれば 結果はそのまま記録として残し 不一致の原因が解決されるまで ABO 血液型の判定は保留とする 1

7 Rho(D) 血液型の判定基準 抗 D () (-) () Rhコントロール (-) (-) () 判定 D 陽性判定保留 1 判定保留 2 1 再度検査を行い 同じ結果ならば 引き続き D 陰性確認試験を行う ただし 受血者の場合は D 陰性として扱う 2 手技の再確認 偽陽性の可能性があるため精査を行う ABO 血液型判定を誤判する原因事務的なミス 検体の取り違い 台帳への記入ミスや入力ミス 口頭での依頼や報告 被検者 医師 看護師 担当技師の記憶違い 技術的なミス 検体の保管不備 ウラ検査の不履行 遠心機などの精度管理の不履行 判定時の弱い反応の見逃し 血球濃度の調整ミス 検体に誤判を引き起こす原因がある場合 D 陰性確認試験操作 1. 1 検体あたり 本試験管を準備する 2. 試験管に検体名 ( 検体番号 ) と抗 D Rh コントロ - ルと記名する. 赤血球浮遊液用試験管に生理食塩液を約 1~1.5ml 分注し 赤血球沈層を 1 滴滴下し ~5% 赤血球浮遊液を調整する 4. を生理食塩液で 1 回以上洗浄する 5. 洗浄後 ~5% 赤血球浮遊液に調整する 6. 抗 D Rh コントロール試薬を対応する試験管に各 1 滴滴下する 7. 5 で調整した ~5% 被検赤血球浮遊液を 6 の試験管に各 1 滴滴下する 8. よく混和後 9~1G(4rpm)/15 秒遠心する 9. 溶血 凝集の有無を観察する 1. 凝集が認められなければ 再度よく混和後 7 ~6 分加温する 11. 9~1G(4rpm)/15 秒遠心し 溶血 凝集の有無を観察する 12. 凝集を認めれば D 陽性とし 認められなければさらに生理食塩液にて ~4 回洗浄する 1. 洗浄した各試験管の赤血球沈渣に抗ヒトグロブリン抗体を各 2 滴滴下する 14. よく混和後 9~1G(4rpm)/15 秒遠心する 15. 溶血 凝集の有無を観察する 16. 凝集を認めれば prtil D もしくは wek D が疑われ精査が必要 認められなければ D 陰性 17. 陰性結果の試験管に IgG 感作赤血球試薬を各 1 滴滴下後 よく混和して 9~1G (4rpm)/15 秒遠心し 凝集することを確認する <D 陰性確認試験の注意点 > D 陰性確認試験を実施した上で D 陰性を確定する 必ず Rh コントロ - ルも同時に実施し 陰性であることを確認する Rh コントロ - ルが陽性となる原因 直接抗グロブリン試験陽性 寒冷凝集素 連銭形成 汎凝集反応 オモテ ウラ検査不一致の対処例 ( 再検査をする前の確認事項 ) 検体 試薬の滴下ミスはないか 検体 ( 血球 血清 ) の取り違えはないか ( 採血間違い 検査時の検体取り違い ) 検体に問題はないか ( 溶血 フィブリン塊 細菌汚染など ) 器具の汚染はないか 試薬 生理食塩液の劣化 汚染はないか 不適切な判定法でなかったか 記入ミスはないか 検体濃度の調整は適正であったか 反応温度 時間は適正であったか 遠心条件は適正であったか ウラ検査の溶血反応の見逃しはないか 記録 判定の誤りはないか < 再検査時の注意点 > 1 検体は採血管から再調整する 2 被検血球は生理食塩液にて洗浄後再調整する 試薬の期限 異常の有無を再点検する 4 確実に検体 試薬等を滴下する 5 ウラ検査に O 型血球試薬を追加して実施する 6 滴下量を確認する ( ロット番号の異なる血球試薬を用いて再検査する ) 7 検体を採り直す 以上を再度確認し 再検査を実施する 2

8 オモテ検査 ウラ検査不一致の原因 赤血球側の原因 1 被検血球の濃度調整の不良 2 抗体によって血球が感作されている時 新生児溶血性疾患 ( 母親由来の抗体 ) 自己免疫性溶血性疾患 ( 温式 冷式自己抗体 ) 異型輸血によるもの 4 異型造血幹細胞移植後 5 後天性の抗原異常 MDS 白血病 Hodgkin 病による抗原減弱 6 赤血球膜の変性 細菌 ウイルス感染症等により T 抗原が露出し すべてのヒト血清で凝集する ( 汎凝集反応 ) 7 ABO 抗原の減弱 ( 欠如 ) 亜型 8 キメラ モザイク 血清側の原因 1 低温反応性の不規則抗体を保有する場合 抗 M 抗 N 抗 Le 抗 Le b 抗 I 等 2 抗 A 抗 B 抗体価の減弱 ( 欠損 ) 低 ( 無 )γ グロブリン血症 新生児 高齢者 寒冷凝集素 4 連銭形成 ( 骨髄腫 肝硬変等 ) 5 母親由来の抗 A 抗 B 抗体 新生児 6 異型造血幹細胞移植後 7 高分子血漿増量剤 静注用造影剤の影響 8 型物質の異常増加による抗 A 抗 B 試薬の中和 卵巣嚢腫 胃癌 ( 印環細胞癌 ) 等 オモテ検査 ウラ検査が不一致であった場合 その原因を考慮の上適切な追加検査を実施する 部分凝集 (mf:mixed field gglutintion) キメラとモザイク 血液型不適合輸血や血液型不適合造血幹細胞移植などにおいては ABO 血液型検査のオモテ検査やRho(D) 血液型検査等で凝集赤血球と非凝集赤血球が混じて観察されることがある ABO オモテ検査における部分凝集 原因 1 輸血事故 異型適合血 (O 型血などの使用 ) などの異型輸血 2 疾患等による血液型抗原減弱 亜型 (A B cisa2b 等 ) キメラ モザイク等 4ABO 不一致での造血幹細胞移植後の生着過程 ABO オモテ検査における部分凝集 対処 1 患者情報を確認する 輸血歴のある場合は 輸血用血液製剤の血液型と輸血量 輸血施行日時を確認する 転送患者の場合は前医にも問い合わせる 輸血歴や造血幹細胞移植の無い場合は 各種亜型検査 ( 抗原減弱の否定はできない ) を行う 2 再度新たに採血した検体を用いて ABO オモテ ウラ検査を再検査する 不適合輸血の疑いがあれば 溶血の程度を調べる 血清検体の場合は溶血が認められることがある さらに輸血した血液バッグ 患者保存検体の ABO 血液型を再検査する 4 必要に応じて 各社試薬との反応性比較 レクチンとの反応性 被凝集価測定 転移酵素活性測定 型物質測定 他の血液型判定 ABO 混合血球の分離 フローサイトメトリー 家系調査 遺伝子検査等を実施後 その情報より適合する血液を選択する Rho(D) 抗原検査における部分凝集原因 1 異型輸血 輸血事故 (D 陰性患者にD 陽性血を輸血 ) 2 やむを得ずD 陽性血を輸血していることもあるので考慮する D 不一致での造血幹細胞移植後の生着過程 Rho(D) 抗原検査における部分凝集 対処 1 患者情報を確認する 輸血歴のある場合は 輸血用血液製剤の血液型と輸血量 輸血施行日時を確認する 転送患者の場合は前医にも問い合わせる 輸血歴や造血幹細胞移植の無い場合は 各種亜型検査 ( 抗原減弱の否定はできない ) を行う 2 再度新たに採血した検体を用いて D 抗原検査を再検査する 不適合輸血の疑いがあれば 溶血の程度を調べる 血清検体の場合は溶血が認められることがある さらに輸血した血液バッグ 患者保存検体の D 抗原を再検査する 4 必要に応じて 各社試薬との反応性比較 被凝集価測定 他の血液型判定 混合血球の分離 フローサイトメトリー 家系調査 遺伝子検査等を実施する

9 < 血球側の検査 種 類 抗 A 1 レクチンとの反応 抗 H レクチンとの反応 抗 A 抗 B に対する被凝集価測定 抗 A 抗 B の吸収試験 抗 A 抗 B の吸着解離試験 直接抗グロブリン試験 追加検査の種類と目的 目 的 A 1 型とそれ以外の A 亜型を鑑別する H 抗原の有無を調べ Bomby または pr-bomby でないかを確認する 抗 A または抗 B に対して明らかな凝集反応を認める A 2 A pr-bomby および異型輸血を疑う場合に行う 抗 A または抗 B に対して凝集を認めないか 反応の非常に弱い Am Ax Bm および Bel 等を疑う場合に A または B 抗原の有無を証明する 赤血球上に何らかの抗体が感作している状態では正しい結果が得られないため 抗体の感作状態を調べる 血液型検査 ; スライド法スライド法の特徴はmf( 部分凝集 ) がわかりやすいところにある 試験管法やカラム凝集法などで部分凝集が疑われる場合に有用となる スライド法にて特に背景色調を観察する 背景 : 清澄 ( 非凝集血球なし ) 濁り( 非凝集血球あり :mf) 検査の実施に際しては 試薬の添付文書に従う 血液型検査 ; スライド法操作 1. 赤血球浮遊液用試験管に 検体名 ( 検体番号 ) を記名する 2. スライド ( 凝集検査板 ) に 検体名 ( 検体番号 ) 各試薬名を記名する. 下記のように 赤血球浮遊液の濃度を調整する 約 4% 赤血球浮遊液は生理食塩液 滴 赤血球沈層 2 滴約 1% 赤血球浮遊液は生理食塩液 9 滴 赤血球沈層 1 滴 4. 抗 A 抗 B 試薬をそれぞれホールの端に各 1 滴滴下する 5. 4に触れないよう 逆のホール端にの赤血球浮遊液を各 1 滴滴下する 6. タイマーを予め2 分にセットする 7. 攪拌棒で抗 A 試薬と赤血球浮遊液 抗 B 試薬と赤血球浮遊液を同時に混和し 直ちにタイマーをスタートする 8. 引き続き スライドを手に取り揺り動かしながらホール内の試薬と血球の混和を続ける 9. 2 分後にスライドを回転させながら判定し 記録する <スライド法の注意点 > ペーパ- 法は 紙の吸収により混和不十分となり 赤血球と血清の比率が不適切のため推奨できない 冷房等の風が吹き出している直下で行わない 全血法では偽陽性 偽陰性を示すことがある 亜型など抗原量の少ない場合は 凝集開始時間が遅くなり凝集塊を作りにくくなる 通常 15 秒以内に凝集が始まる 亜型の精査に用いる場合は凝集時間を記録する 4

10 不規則抗体とは 不規則抗体検査 愛臨技新人サポート研修会 名古屋第二赤十字病院高原幸恵 ABO 血液型の抗 A 抗 B 抗体以外の血液型抗原に対する抗体 免疫抗体 - 輸血や妊娠などの同種免疫を受けることで産生される 自然抗体 - 同種免疫によらず産生される 不規則抗体検査の目的 臨床的に意義のある抗体を事前に検出し 輸血の安全性や適合血を確保する 母児血液型不適合妊娠による新生児溶血性疾患の予測と対応に重要な意義を持つ 不規則抗体の血液型特異性と輸血用血液の選択赤血球型検査ガイドライン 臨床的に意義のある抗体 Rh Duffy Kidd 抗原陰性血を Diego 選択 S s Kell M(7 で反応 ) Le b(lebh) Xg JMH Knops Cost 臨床的意義のない抗体 Chid/Rodgers 抗原陰性血選択の必要なし まれに臨床的意義のある抗体 A 1 P 1 M N Le Le b Le b( 一部 ) 抗グロブリン法による交差適合試験 特異性 症例により臨床的意義の異なる抗体その他の高頻度抗原または低頻度抗原に対する抗体 輸血認定医 輸血認定技師または専門機関に相談 臨床的に意義のある不規則抗体 不規則抗体検査の流れ 輸血による溶血性副作用や 母児血液型不適合妊娠による新生児溶血性疾患などの原因となる抗体 不規則抗体スクリーニング 陽性になったら 多くは 7 間接抗グロブリン法で陽性となる 不規則抗体同定 抗体の特異性を明らかにする スクリーニング検査において 間接抗グロブリン法は必須! 臨床的意義を考慮し適合血選択の判断 1

11 不規則抗体スクリーニング 不規則抗体検査 抗体スクリーニング血球試薬 ( 主要な血液型抗原を含む O 型ヒト赤血球 2~4 本が組み合わされている ) と被検血清 ( 血漿 ) を反応させ 血清 ( 血漿 ) 中の不規則抗体の有無を調べる * 自己対照を含める必要はない ( 赤血球型検査ガイドライン ) 不規則抗体同定検査 同定用パネル血球試薬 (1~2 本 1 組 ) と被検血清 ( 血漿 ) を反応させ 反応性の違いから不規則抗体を同定し特異性を明らかにする * 自己対照を立てる 不規則抗体検査に用いる血球試薬 主な赤血球抗原が陽性 C c D E e Di Di b Fy Fy b Jk Jk b S s M N P 1 Le Le b など 量的効果を認める抗原がホモ接合 Rh Kidd Duffy MNSs など Di を含む血球を使用する 不規則抗体主な検査方法 試験管法 生理食塩液法 酵素法 ( 一段法 二段法 ) 酵素 : ブロメリン フィシン パパインなど 間接抗グロブリン法反応促進剤 : ウシアルブミン液ポリエチレングリコール (PEG) 低イオン強度溶液 (LISS) など カラム凝集法 ( ゲル ガラスビーズ ) 酵素法 間接抗グロブリン法 不規則抗体スクリーニング検査法の選択 臨床的に意義のある抗体をできるだけ多く検出する 7 : 間接抗グロブリン法 ( 必須 ) 酵素法 臨床的に意義のない抗体をできるだけ検出しない室温 : 生理食塩液法を実施しない マイクロプレート法 ( 赤血球膜固相法 ) 間接抗グロブリン法 酵素法 酵素法の留意点 酵素により血球表面からシアル酸を除去し 赤血球のゼータ電位を低下させる 血球が互いに近づき凝集しやすくなり一部の不規則抗体の検出感度を上げる 酵素 : ブロメリンフィシンパパインなど 一段法と二段法がある 酵素処理血球で反応性が増強される抗体抗 Rh 抗 Le 抗 Le b 抗 P 1 抗 Kidd 抗 I 抗体など 酵素処理によって破壊または減弱される抗原がある M N S s Fy Fy b Xg など 一段法の場合 血清中の蛋白分解酵素阻害物質の多い検体では酵素が失活し 偽陰性または反応が弱くなることがある 不規則抗体スクリーニングに用いる際は 単独ではなく間接抗グロブリン法と組み合わせて使用する 2

12 間接抗グロブリン法 臨床的意義のある不規則抗体を検出する上で もっとも信頼できる方法とされている 不規則抗体スクリーニング検査には間接抗グロブリンを含める 反応促進剤を使用することで反応時間を短縮することができる 反応促進剤を使用しない場合は 45 分以上 (45 分 ~9 分 ) の反応時間が必要である 被検血清 血球試薬 7 加温 生理食塩水で洗浄 (~4 回 ) 遠心判定 間接抗グロブリン法 反応促進剤なしアルブミン LISS( 低イオン強度溶液 ) PEG( ポリエチレングリコール ) など 使用方法は添付文書に従う 抗グロブリン試薬 * 結果 陰性の場合クームスコントロール血球 (IgG 感作血球 ) を加え遠心判定 凝集を確認 間接クームス法の留意点 反応増強剤は試薬の添付文書に従って使用する 再度の遠心判定はしない 陰性の場合はクームスコントロール血球 (IgG 感作 血球 ) を使用し 特に血球の洗浄効果を必ず確認する PEG( ポリエチレングリコール ) を使用する場合は用いる抗グロブリン試薬は抗 IgG が望ましい 抗原表の見方 不規則抗体検査に使用する血球試薬の血液型抗原を記載してある表 一例 : 抗原陽性 ( 存在 ) : 抗原陰性 ( 欠如 ) 網掛け部分蛋白分解酵素によって抗原性が破壊または減弱する抗原 低頻度抗原陽性または高頻度抗原陰性など特別な抗原を示す 検査結果記録欄まず検査方法名を記入してから 判定ごとに記録 抗原表の留意点 抗原の強弱 ( S または W ) が記載されていなくても 抗原性に個体差があるため反応性に差が出ることがある (P 1 I Bgなど ) 性別 (M F) を表記してある意味は Xg 陽性 ( Xg はX 染色体にある ) では M 男性 :Xg /Y F 女性 :Xg /Xg あるいは Xg / Xg となるため反応性に差が出る 抗原表の留意点 抗原名が記載されていなくても すべての血球が陽性の抗原 ( 高頻度抗原 : Di b Jr JMHなど ) すべての血球が陰性の抗原 ( 低頻度抗原 :Wr など ) がある 経時的に抗原性が減弱しやすい抗原があり 有効期限内であっても反応性が低下し 陰性となる場合がある ( P 1 Lewis Duffyなど )

13 消去法 すべての方法で陽性反応が認められない場合 その血球が持っている抗原に対する抗体は持っていないと考え 抗原表上の陽性抗原を消去していく 量的効果 (dosge effect) 量的効果を持つ抗原に対する抗体ではホモ接合血球と強く反応し ヘテロ接合血球と弱く反応するもしくは反応しないことがある 量的効果に留意する 量的効果が見られる抗体 Rh 系抗体 抗 Kidd 抗 Duffy 抗 MNSs 抗体など 量的効果 (dosge effect) Kidd 血液型の場合 ホモ接合 ヘテロ接合 ホモ接合 Jk(b-) Jk(b) Jk(-b) 新消去法 陰性反応を示したパネル赤血球について 抗原表の各血液型抗原 上に 印 または / 印を記入する 印 : 量的効果のある血液型のホモ接合体の抗原および量的効果のない抗原 > Jk 抗原量 b b b b b b b < Jk b 抗原量 b bb b b b b b / 印 : 量的効果のある血液型のヘテロ接合体の抗原 印が 1 つ以上あれば その抗原に対する抗体の存在を暫定的に否定し 抗原表上段に記載してある抗原名に 印を付記する 印が 1 つもなく / 印のみの抗原に対する抗体については判定を保留し 抗原名には何も付記せずに残す Cell No. すべての方法で陽性反応が認められない場合 その血球が持っている抗原に対する抗体は持っていないと考え 抗原表上の陽性抗原を消去していく 1 2 D C E c e Jk Jk b Br 2 IAT 不規則抗体同定検査 同定用パネル血球を用いて同定検査を実施 スクリーニング検査で Di 陽性血球に反応があった場合には同定検査に Di 血球を追加する 基本的にはスクリーニングで陽性となった方法を中心に検査 自己対照をたてる Br: ブロメリン法 IAT: 間接抗グロブリン法 C.C.: クームスコントロール 4

14 不規則抗体同定検査 患者情報の確認 ( 年齢 性別 輸血歴 妊娠歴 疾患名 既往歴 移植歴 投与薬剤など ) 方法による反応性の違いや反応強度の強弱にも注意 抗体は一つとは限らない複数存在する場合もある 患者血液型 (ABO D 以外 ) の判定 患者血液型の判定 通常は自分自身が持っている抗原に対しては抗体を産生しない注意 : 最近 ( 過去 ヶ月以内 ) 輸血を受けている場合 自己抗原は確定できない 追加検査 追加パネル赤血球による検査 血液型物質による中和試験 血清の反応陽性陰性総計 Fisher の確率計算 抗原 () 抗原 (-) 総計 A B AB 陽性 C D CD 陰性 AC BD N 総計 E () E (-) 総計 6 自己抗体の吸収 抗体の解離試験 酵素処理血球の利用 患者血液型の判定 血清量の増量 血清の酸性化など A: 抗原 () 血球と陽性反応を示した数 B: 抗原 (-) 血球と陽性反応を示した数 C: 抗原 () 血球と陰性反応を示した数 D: 抗原 (-) 血球と陰性反応を示した数 N: パネル血球の総数 (AB)! (CD)! (AC)! (BD)! p= N! A! B! C! D! p=.5 5

15 愛知県臨床検査技師会新人サポート研修 例会輸血検査の標準化にむけて 交差適合試験 交差適合試験とは 輸血前に行う適合性試験です 平成 21 年 6 月 14 日 ( 日 ) 目的 1.ABO の血液型不適合を 検出できる * 交差適合試験は ABO 血液型が同型のものを用いて検査 2.7 で反応する臨床的に意義のある不規則抗体を 見落とさない 種類 主試験 患者血清と供血者血球 副試験 供血者血清と患者血球 * 主試験は 必ず実施すること * 臨床的意義のある不規則抗体により主試験が不適合な血液は 輸血は不可 検査法 生食法 ABO の血液型不適合が防げる ブロメリン法 低力価の Rh 血液型抗体を見逃さない 間接抗グロブリン法 7 で反応する臨床的意義のある不規則抗体を一番多く検出できる 検体 試薬 1 出来るだけ新鮮な ( 採血後 72 時間以内 ) 検体で検査を実施 2 血液型検査に用いたものとは異なる検体で検査を実施 使う検体の血液型確認がされていること 4 検体は 検査後も保管しておくこと 5 間接抗グロブリン法に用いる試薬 アルブミン Liss PEG のいずれか 1

16 検査の進め方 1 検体の血液型確認 2 検体を遠心分離 試験管の並べ方 試験管の準備 4 試験管にNo. と方法を記入し並べる 5 浮遊液用試験管に生食を入れる 6 セグメントを切り 赤血球を入れる 7 血清を入れる間接抗グロブリン法生食 ブロメリン法 8 反応増強剤を入れ 加温 9 遠心判定 生食法 生食 ブロメリン法用 間接抗グロブリン法用 12 回洗浄する 1 抗ヒトグロブリン抗体を入れる 1 ブロメリンを入れ 加温 11 遠心判定 ブロメリン法 赤血球浮遊液用 遠心判定 IgG 感作赤血球を入れる 15 ブロメリンコントロールを入れる 16 遠心判定 1 2 自己対照 18 遠心判定 * 間接抗グロブリン法の反応増強剤の種類により反応温度が異なるので 15~16 と 12~14 の順番が逆になることもある 陽性時の対応 : 生食法 陽性時の対応 : ブロメリン法 1 検体違い : 再採血し再検査 2 血液型違い : 供血者 患者の血液型を確認 室温で反応する不規則抗体の存在不規則抗体検査を実施 必要に応じて抗原陰性血で再検査 4 寒冷凝集素 ( 自己対照陽性 ):7 5 分加温後判定 凝集が消失すれば OK 5 連戦形成 ( 自己対照陽性 ): 生食置換法 * を実施 6 冷式自己抗体 ( 自己対照陽性 ):7 5 分加温後判定 凝集が消失すれば OK * 生食置換法 血清に血球を入れ 5 分放置 遠心後上清を除去し変わりに生食を 2 滴滴下 遠心判定 1 不規則抗体の存在不規則抗体検査を実施し 抗原陰性血で再検 2 ブロメリン非特異凝集 ( 自己対照陽性 ) 自己対照と同等の凝集がある 他の方法で凝集 溶血がない 直接抗グロブリン試験陰性 ブロメリン法以外の検査を実施し 判定 寒冷凝集素 ( 自己対照陽性 ):7 5 分加温後判定 凝集が消失すれば OK 4 冷式自己抗体 ( 自己対照陽性 ):7 5 分加温後判定 凝集が消失すれば OK 陽性時の対応 : 間接抗グロブリン法 Ⅰ 1 不規則抗体の存在不規則抗体検査を実施し 抗原陰性血で再検 2 不規則抗体陰性低頻度抗原に対する抗体を示唆 冷式自己抗体 ( 自己対照陽性 ):7 5 分加温後判定 凝集が消失すれば OK 4 供血者血球が直接抗グロブリン試験陽性 供血者血球の直接抗グロブリン試験を実施 陽性時の対応 : 間接抗グロブリン法 Ⅱ 5 自己対照も陽性 自己対照の直接 間接抗グロブリン試験を実施 [ 共に陽性 ] 自己抗体を吸収後 同種抗体の有無を確認 同種抗体陽性 抗原陰性血で対応 同種抗体陰性 様子をみながら 輸血を実施 2

17 交差適合試験とは 輸血前の最後の砦です ただし 交差適合試験にも限界がある 限界 1 Rh 血液型の誤判定 不適合は防止不可 2 血液型抗原による免疫は防止不可 遅発性溶血性副作用を防止出来ないことがある 4 白血球 血小板 血漿蛋白などの抗体は検出不可 5 適切な検査法でなければ抗体検出不可 ( 現法で全てが網羅されるわけではない ) 6 操作ミス 検体 試薬の入れ忘れは防げない 緊急時 : ショック時の輸血 血液型が確定していなかったら RCC-LR O 型濃厚血小板 FFP AB 型 血液型が確定していたら 勿論同型を! コンピュータークロスマッチ コンピューターを用いて交差適合試験を省略して ABO 血液型 不規則抗体が無いことなどの適合性を確認する方法 [ 条件 ] 1 結果の不一致や製剤の選択が間違っている時には警告が出ること 2 患者の血液型が 2 回以上異なる検体で確認されていること 製剤の血液型が再確認されていること 輸血検査は 検査だけではない