図 1: 操作法の概要 2. この製品の使用法 2. 1 実験開始前に サンプル材料 細胞培地またはセルフリーの培養上澄 アッセイ用の試薬は細胞にダ メージを与えないので 直接細胞培養プレートに加えることができます サンプルを直接試験しないときは LDH 活性の測定の前に 250 g の遠心で 細胞

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1 細胞傷害性検出キット plus (LDH) Cytotoxicity Detection Kit plus (LDH) 傷害を受けた細胞の細胞質から放出された 乳酸脱水素酵素 (LDH) 活性の測定に基づく 細胞死と細胞溶解のハイスループット比色定量法です Cat. No ウェルプレートで 400 回 / 384 ウェルプレートで 1600 回 Cat. No ウェルプレートで 2000 回 / 384 ウェルプレートで 8000 回 Ver 製品内容 試験回数 Cat. No は96ウェルプレートで400 回 384ウェルプレート で1600 回 Cat. No は96ウェルプレートで2000 回 384ウェルプレー トで8000 回 キット内容 内容 / 機能 ボトル ラベル A)Cat. No 回 B)Cat. No 回 1 青キャップ 触媒 A)1 ボトル 凍結乾燥 安定化 B)5 ボトル 凍結乾燥 安定化 ジアフォラーゼ /NAD +ミクスチャー 反応混合液用触媒 2 赤キャップ 色素溶液 A)1 ボトル 45 ml B)5 ボトル 各 45 ml ヨードテトラゾリウムクロライド (INT) と乳酸ナトリウム 色素反応混合液 3 白キャップ 溶解液 A)1 ボトル 3 ml B)5 ボトル 各 3 ml 細胞溶解用 調製済み 4 緑キャップ 停止液 A)1 ボトル 25 ml B)5 ボトル 各 25 ml LDH 反応停止用 調製済み 保存と安定性 キットは-15 ~-20 でラベルに示される期限まで安定です キット構成品の安定性 凍結乾燥品 ( ボトル1) は2 ~ 8 で安定です 再懸濁した触媒溶液 色素溶液 ( ボトル2) 溶解液( ボトル3) と停止 液 ( ボトル4) の安定性は以下の通りです : 2 ~ 8 で4 週間 15 ~ 20 で2 日間 長期保存(3ヶ月まで) は 凍結保存してください 3 回までの凍結融解は性能に顕著な影響を与えません しかしなが らボトル2の色素溶液に沈殿が見られたときには 37 で少なくと も1 時間 溶液を振とうします それでも残る沈殿は性能に影響し ません 製品の凍結により沈殿が生じますので 凍結融解を繰り返 すことは避けてください で組織培養グレードの96ウェルあるいは384ウェルのマイクロプレート アッセイ培地(1% の FCS あるいは1% のウシ血清アルブミンを含む培地など ) ヒトや動物血清は様々な量の LDH を含んでおり バックグランドの上昇の原因となります それゆえ アッセイの感度を増加させるためには 低濃度の血清か1% のウシ血清アルブミンの存在下で測定を行います LDH スタンダード溶液 (0.05 U/ml セクション2.1を参照) 相対的な細胞傷害性の率や吸光度ではなく U/ml での放出 LDH 活性を計算する場合には リファレンススタンダードとして適切な LDH 調製品を使用してください アッセイ培地と LDH スタンダードはキットに含まれませんが 他の必要なすべての試薬が含まれます アプリケーション細胞傷害性検出キット plus は 損傷を受けた細胞から放出された LDH 活性を測定することに基づき 細胞傷害性 / 溶解性を定量するための正確で迅速 簡便な比色定量法です 本キットは96ウェルや 384ウェルフォーマットのハイスループットな定量に最適です 細胞膜の損傷を起こした様々なin vitro 細胞システムに使用できます このアッセイはまた 増殖アッセイの最終で存在する細胞の総数を測定するためにも使用できます アプリケーションの例 : 食品 化粧品 医薬品企業での環境および医学的研究における化学品の潜在的な細胞傷害性の測定 メディエーターを介した細胞溶解性の測定 細胞傷害性 T リンパ球 (CTL) やナチュラルキラー (NK) 細胞 リンフォカイン活性化キラー (LAK) 細胞 単球により誘導された細胞傷害性の検出と定量 LDH 放出アッセイと [ 51 Cr] 放出アッセイは NK 細胞を含むマウスやヒトの様々なエフェクター 標的細胞システムにおける細胞介在性細胞傷害性のモニターに使用した時 良い相関を見せます 抗体介在性の細胞傷害(ADCC) と補体介在性細胞傷害性の測定 バイオリアクター中の細胞死の測定 培養培地中へ放出された細胞質 LDH 酵素活性を測定することで バイオリアクターでの培養間の細胞死を正確に評価します アッセイ時間標準的なアッセイ時間 :15 分間最長のアッセイ時間 : 低細胞数 (100 個 / ウェル以下 ) で30 分間まで 追加の器具と必要な試薬 37 インキュベーター マイクロプレート(ELISA) リーダー nm で測定ができること リファレンス波長を使用する場合は 600nm 以上のリファレンスフィルターを選んでください 顕微鏡 ヘモサイトメーター マルチチャンネルピペッター(100μl) 滅菌ピペットチップ 細胞介在性の溶解測定や細胞毒性を持つ成分の分析には 滅菌済み 78

2 図 1: 操作法の概要 2. この製品の使用法 2. 1 実験開始前に サンプル材料 細胞培地またはセルフリーの培養上澄 アッセイ用の試薬は細胞にダ メージを与えないので 直接細胞培養プレートに加えることができます サンプルを直接試験しないときは LDH 活性の測定の前に 250 g の遠心で 細胞を除去します 遠心後 セルフリーの培養上澄は2~8 で数日間 LDH 活性の損 失なく保存することができます ワーキング溶液の調製 内 容 再溶解 / 調製 保存と安定性 触媒 ( ボト凍結乾燥品を1 ml の再蒸留 2~8 で4 週間 ル1 青キ 水に溶解し 十分に混合し 15 ~ 20 で2 日間 ャップ ) ます -15~-25 で3ヶ月間は安定 反応混合 100テスト用 : 使用前に250μl 使用直前に調製します 反 液 の再懸濁したボトル 1 溶液に ml のボトル 2 溶液を加え混合します 400テスト用 : 使用前にボトル2 溶液の全量 (45 ml) に 1 ml の再懸濁したボトル 1 溶液を加え混合します ボトル 2の色素溶液に沈殿が見られたときには 37 で少なくとも 1 時間 溶液を振とうします それでも残る沈殿は性能に影響しません 製品の凍結により沈殿が生じますので 凍結融解を繰り返すことは避けてください 応混合液は保存できません コントロール細胞傷害性の割合を計算するために 各実験ステップで以下の3 種類のコントロールを加えてください : バックグランドコントロール: アッセイ培地中に含まれる LDH 活性を測定します このコントロールで得られる吸光度を 他のすべての吸光度から引き算します 低コントロール: 未処理の正常細胞から放出される LDH 活性を測定します ( 自発的な LDH 放出 ) 高コントロール: 細胞中の放出可能な LDH 活性を測定します ( 最大 LDH 放出 ) このコントロールを行うとき 最大 LDH 放出を正確に推測するために正しい時間でサンプルに溶解試薬を加えなければなりません コントロール細胞は細胞毒性を持つ成分に曝露されている間も増殖していますので 曝露のはじめにライシス溶液を加えたとき トータルの LDH を低く見積もることになります また 37 での LDH の半減期は約 9 時間なので 曝露のはじめにライシス溶液を加えたとき 高コントロール中の LDH 活性は大きく低下します それゆえ 高コントロールへの溶解試薬の添加は常に曝露期間の最後にします 以下の ( オプションの )2 種類のコントロールが有用です : 物質コントロール I: 試験基質に含まれる LDH 活性を測定します 細胞介在性細胞傷害性のアッセイにおいて このコントロールはエフェクター細胞から放出される LDH 活性に関する情報を提供します ( エフェクター細胞コントロール ) ( セクション3.3を参照 ) 物質コントロール II: 試験物質それ自身が LDH 活性測定に干渉するかどうかを測定しますこのコントロールを行うために : 光学的に透明な96ウェルプレート中の各コントロールサンプル ( 三重測定 ) に 試験物質を含む50μl のアッセイ培地を添加します 次に 50μl/ ウェルの LDH スタンダード溶液 (0.05 U/ml) を加えます 最後に 100μl/ ウェルの反応混合液を加えます 表 1: コントロールの概要ウェルのバックグ低コント高コント物質コン物質コン実験サン内容ランドコロールロールトロールトロールプルントロー I II ルセルフリ 100μl 50μl 50μl ー培養培地細胞 - 50μl 50μl μl 溶解バッ - - 5μl ファー 1 培地で希 μl 50μl 50μl 釈した試験物質あるいはエフェクター細胞 LDH スタ μl - ンダード溶液 1 細胞毒性物質への曝露の最後に添加します バックグランド 低および高コントロールは各実験で行います コントロールによる計算 A. 細胞傷害性のパーセントを測定するために 三重測定サンプルとコントロールの平均吸光度を計算し そこからバックグランドコントロールから得られた吸光度を引き算します 次に 次式で計算します : 79

3 実測値 - 低コントロール細胞傷害性 (%)= 100 高コントロール- 低コントロール B. 細胞介在性の細胞傷害性のパーセントを測定するために 三重測定サンプルとコントロールの平均吸光度を計算し そこからバックグランドコントロールから得られた吸光度を引き算します 次に 次式で得られた値を置き換えます : ( エフェクター : 標的細胞ミックス- エフェクター細胞コントロール )- 低コントロール細胞傷害性 (%)= 100 高コントロール- 低コントロール 2. 2 アッセイにおける至適な細胞濃度の測定 異なる細胞タイプは異なる量の LDH を含んでいます それゆえ それぞれの特殊な細胞タイプで常に初期実験を行い 適切な細胞濃度を決定します 一般的に この至適な細胞濃度は低コントロールと高コントロールの差異を最大にするようにし この濃度を以下の実験に使用します ほとんどの細胞株での至適細胞濃度は (0.25-1) 10 4 細胞 /100μl アッセイ (=(0.25-1) 10 5 細胞 /ml) です 操作法 (96ウェルプレート用) この操作法を384ウェルプレートに適合させるためには ステップ2-4の100μ l/ ウェルの代わりに25μ l/ ウェルを使用します ( ステップ2では25μ l のアッセイ培地を384ウェルプレートに加えます ) 操作法の概要は図 1をご覧ください ステップアクション 1 細胞をアッセイ培地で洗浄します アッセイ培地で細胞濃度を 個 / ウェルに調製します 2 96ウェルプレートの各ウェルに100μl のアッセイ培地を添加します 3 マルチチャンネルピペットを用いて細胞の2 倍希釈系列を準備します 各希釈物を6ウェルずつ用意します 注 : 希釈後は 各ウェルの最終容量は100μl でなければなりません バックグランドコントロールとして使用する細胞を含まないウェルを少なくとも3ウェル用意します 各細胞希釈物に対して: - 低コントロールを3ウェル ( 自発的な LDH 放出 ) - 高コントロールを3ウェル ( 最大 LDH 放出 ) 注 : 各コントロールの概要は セクション2.1をご覧ください 4 プレートをインキュベーター内でインキュベートします (37 5% CO 2 湿度 90%) 注 : ここでのインキュベーション時間は 最終のアッセイで使用するインキュベーション時間と同じでなければなりません 5 ステップ3で指示された高コントロール細胞希釈物に対して 5μ l の溶解液を加えます (384ウェルプレートには1.5μ l を加えます ) 更に15 分間インキュベートします 注 : 溶解中にプレートを振とうすることで 特に接着細胞や細胞塊でのプロセスが早まります 6 LDH 活性を測定するために 100μl の反応ミックス ( 用時調製 ) を96ウェルプレートの各ウェルに加え 多い細胞数の場合は5-10 分間 低い細胞数 (100 個 / ウェルまで ) の場合は30 分間まで室温でインキュベートします (384ウェルプレートの場合は25μl/ ウェルの反応ミックスを使用します ) 注 : このインキュベーションの間 プレートを遮光します ((A) の図 1をご覧ください ) 7 50μl の停止溶液を96ウェルプレートの各ウェルに添加します (384ウェルには12.5μl を使用します ) プレートを10 秒間振とうします ((B) の図 1をご覧ください ) 8 ELISA リーダーを使用して490あるいは492nm の吸光度 ( フィルターに応じて ) を測定します 注 : リファレンス波長は600nm 以上とします ((C) の図 1 をご覧ください ) 9 アッセイにおける至適な細胞濃度を決定します ( 高コントロールおよび低コントロールの差が最大となる濃度 ) 結果図 2:384および96ウェルプレート中での細胞数と 細胞傷害性検出キット plus で得られた492nm の吸光度との直線的相関関係 U 937 細胞を上記の通りにマイクロプレート中で希釈し 図に表示した細胞濃度を得ます その後の LDH 放出 ( コントロール ) を測定するために培地を加え 最大 LDH 放出活性 ( 溶解 ) を測定するために溶解試薬を加えます LDH の反応は15 分間行います グラフ A は384ウェルプレート グラフ B は96ウェルプレートで得られた値を示しています 384ウェルプレートでは100 個以下 / ウェル 96 ウェルプレートでは500 個以下 / ウェルの細胞からの LDH 放出を測定することができます インキュベーションを長くすることでより感度を増加させることができます 細胞数と高コントロールでの LDH シグナル強度 ( 溶解細胞からの最大 LDH 放出 ) には直線的相関関係があります 図 2A:384 ウェルプレート図 2B:96 ウェルプレート 2. 3 可溶性物質の細胞傷害性の測定操作法 (96ウェルプレート用) 注 : この操作法を384ウェルプレートで行う場合 ステップ1-3の細胞とアッセイ培地を1/4 量とします ( ステップ1において 25μl の細胞 / ウェルで開始し12.5μl の培地に再懸濁します ) 80

4 ステップアクション 1 予備実験( セクション2.2) で決定した細胞濃度まで細胞を増殖させます 96ウェルプレートのウェル中に50μl の細胞懸濁液を分注します 注 : 実験条件を三重測定するための十分な細胞を含むウェルと ステップ4に記載された2 種類のコントロールのためのウェルを準備します 2 細胞をアッセイ培地で洗浄します 3 実験の直前に アッセイ培地中で試験物質( メディエーター 細胞溶解 細胞傷害性薬剤 ) の希釈系列を調製するために 別のマイクロプレートを使用します 50μ l の試験物質の希釈系列を 50μ l の細胞を含むウェル ( ステップ1で調製したマイクロプレート ) に加えます 注 : すべての実験は三重測定を行います 4 同じプレート上で以下のコントロールの三重測定を行いますコントロール各ウェルに加えるものバックグランドコントロー 100μl のアッセイ培地のみル低コントロール 50μl の細胞懸濁液と50μl のアッセイ培地高コントロール 50μl の細胞懸濁液と50μl のアッセイ培地物質コントロール I 50μl の試験物質 ( 実験で用いる最高の濃度 ) と50μl のアッセイ培地物質コントロール II 50μl の試験物質 ( 実験で用いる最高の濃度 ) と50μl の LDH スタンダード溶液注 : 各コントロールの目的はセクション2.1を参照してください 5 細胞をインキュベーター内でインキュベートします (37 5% CO 2 湿度 90%) 注 : 実験により 適切なインキュベーション時間は2-24 時間です 6 高コントロールサンプル( ステップ4より ) を含む各ウェルに 5μ l の溶解液を加えます (384ウェルには 1.5μ l/ ウェル ) 更に15 分インキュベートします 注 : プレートの振とうは溶解のプロセスを促進します 7 LDH 活性を測定するために 100μl の反応混合液 ( 用時調製 ) を96ウェルプレートの各ウェルに加え 室温で30 分間までインキュベートします ( 図 1A 参照 )(384ウェルプレートには25μl 加えます ) 注 : インキュベーションの間 プレートを遮光します 8 50μ l の停止溶液を96ウェルプレートの各ウェルに加えます ( 図 1B 参照 )(384ウェルプレートには12.5μ l 加えます ) プレートを10 秒間振とうします 9 490nm か492nm( リーダーのフィルターによる ) でのサンプルの吸光度を測定するために ELISA リーダーを使用します ( 図 1(C) を参照 ) 注 : リファレンス波長は600nm 以上にします 10 各サンプルの細胞傷害性パーセントを計算します ( セクション2.1に従う ) 結果以下の結果 ( 図 3と4) は浮遊細胞株 (U 937) と接着細胞株 (WEHI 164) での実験を示しています 図 3:U 937 細胞株におけるアクチノマイシン D の細胞傷害活性の測定 U937 細胞を 96 ウェルプレートに 細胞 / ウェルの密度で新鮮な培地に播種しました 異なる濃度のアクチノマイシン D を培養細胞に加え 16 時間インキュベートしました 細胞傷害性を細胞傷害性検出キット PLUS (LDH) で測定しました 同じ処理をした別のセットのコントロールウェルで細胞増殖試薬 WST-1 を使用して細胞増殖を測定しました これらの結果は 両方のタイプのアッセイで同様の IC50 値を示しました 図 4: 接着 WEHI 164 細胞における TNF-αの細胞傷害性の測定 96ウェルプレートのウェル当り50000 個の WEHI 164 細胞を含む細胞培養物を新しい培地で洗浄し 1μg/ml のアクチノマイシン D で3 時間プレインキュベーションしました その後 様々な量の TNF- αをウェルに加え プレートを16 時間インキュベートしました 培養細胞への細胞傷害性を細胞傷害性検出キット PLUS (LDH) で測定しました 同じ処理をした別のセットのコントロールウェルで細胞増殖試薬 WST-1を使用して細胞増殖を測定しました これらの結果は 両方のタイプのアッセイで同様の IC50 値を示しました 2. 4 細胞増殖の測定注 : 細胞増殖を測定するために細胞傷害性検出キット PLUS (LDH) が使用できます 細胞を増殖させ 実験の終わりにキット内の細胞溶解試薬を加えることで 細胞を溶解します トータルの放出 LDH を反応ミックスで測定します このケースでは低コントロールも高コントロールも必要としません 操作法 (96ウェル用) 注 :384ウェルへの適用はセクション2.2と2.3をご覧ください ステップアクション 1 96ウェル組織培養プレートのウェル中に アッセイ培地に懸濁された細胞サンプル (100μl/ ウェル ) を分注します 望みの密度まで細胞を増殖させます 2 アッセイ培地で細胞を洗浄します 3 細胞を含む各ウェルに 細胞増殖に効果を持つか試したい物質を含むアッセイ培地を50μl 加えます 注 : すべての実験は三重測定で行います 81

5 4 同じプレートで以下のコントロールの三重測定を行いま す 注 : 各コントロールの概要はセクション2.1をご覧くだ さい コントロール 各ウェルに加えるもの バックグランドコントロール 100μl のアッセイ培地 物質コントロール I 50μl の試験物質 ( 実験で使 用される最大濃度 ) と50μl のアッセイ培地 物質コントロール II 50μl の試験物質 ( 実験で使 用される最大濃度 ) と50μl の LDH スタンダード溶液 5 使用する細胞と条件に適切な時間 細胞をインキュベー ター (37 5% CO 2 湿度 90%) 中でインキュベートし ます 6 5μl の溶解溶液を細胞を含む各ウェルに加えます プレートを更に15 分間インキュベートします 注 : 溶解の間にプレートを振とうすることで 特に接着 細胞や凝集しやすい細胞において プロセスの時間 を短縮できます 7 LDH 活性を測定するために 100μl の反応混合液 ( 用時 調製 ) をウェルに加え 15~25 で30 分間インキュベー トします ( 図 1. A 参照 ) 注 : このインキュベーションの間 プレートを遮光します 8 50μ l の停止溶液を各ウェルに加えます プレートを10 秒間振とうします ( 図 1. B 参照 ) 9 ELISA リーダーを使用して 490nm または492nm の吸 光度を測定します ( 図 1(C) を参照 ) 注 : リファレンス波長は600nm 以上にします 10 各サンプルの細胞傷害性パーセントを計算します ( セク ション2.1に従う ) 結果 図 2A と2B( セクション2.2) は 溶解細胞コントロール中の細胞数が LDH のシグナル強度に比例していることを示しています 2. 5 細胞介在性細胞傷害性の測定 実験のセットアップ (96ウェルプレートでのサンプル調製) すべての試験は三重測定します バックグランド 標的細胞 標的細胞 ブランク コントロール 低コントロール 高コントロール ス ( 比率 1) ス ( 比率 7) ( 混合比率 1 用 ) ( 混合比率 7 用 ) ス ( 比率 2) ス ( 比率 8) ( 混合比率 2 用 ) ( 混合比率 8 用 ) ス ( 比率 3) ス ( 比率 9) ( 混合比率 3 用 ) ( 混合比率 9 用 ) ス ( 比率 4) ス ( 比率 10) ( 混合比率 4 用 ) ( 混合比率 10 用 ) ス ( 比率 5) ス ( 比率 11) ( 混合比率 5 用 ) ( 混合比率 11 用 ) ス ( 比率 6) ス ( 比率 12) ( 混合比率 6 用 ) ( 混合比率 12 用 ) 操作法 (96 ウェル用 ) 注 :384 ウェルへの適用はセクション 2.2 と 2.3 をご覧ください ステップアクション 1 滅菌 96ウェル組織培養プレート中で エフェクター細胞 (NK 細胞 LAK 細胞 CTL) の希釈系列を適切な培地中で作成します ( 各希釈物の最終液量は50μl) 注 : すべてのサンプルは三重測定を行います 2 標的細胞をアッセイ培地で洗浄します 予備実験( セクション2.2) で決定した至適濃度の2 倍まで標的細胞を希釈します 3 エフェクター細胞の希釈物を含む各ウェルに 50μl の標的細胞懸濁液を加えます ( エフェクター - 標的細胞ミックス ) 注 : 実験のセットアップは 前の表をご参照ください 4 同じプレート上で 以下のコントロールの三重測定を行います 注 : 各コントロールの概要はセクション2.1をご覧ください コントロール各ウェルに加えるバックグランドコントロール 100μl のアッセイ培地 低コントロール 50μl の標的細胞と50μl のアッセイ培地高コントロール 50μl の標的細胞と50μl のアッセイ培地物質コントロール I 50μl のアッセイ培地と 50μl のエフェクター細胞物質コントロール II 50μl の試験物質 ( 実験で使用する最大濃度 ) と50μl の LDH スタンダード溶液 アッセイに用いた各エフェクター細胞濃度において自発的な LDH 放出を常に測定します 実験のセットアップは前の表をご覧ください 5 使用する細胞と条件に適切な時間 細胞をインキュベーター (37 5% CO 2 湿度 90%) 中でインキュベートします 6 5μ l の溶解溶液を細胞を含む各ウェルに加えます プレートを更に15 分間インキュベートします 注 : 溶解の間にプレートを振とうすることで 特に接着細胞や凝集しやすい細胞において プロセスの時間を短縮できます 7 LDH 活性を測定するために 100μl の反応混合液 ( 用時調製 ) をウェルに加え 15~25 で30 分間インキュベートします ( 図 1. A 参照 ) 注 : このインキュベーションの間 プレートを遮光します 8 50μl の停止溶液を各ウェルに加えます プレートを10 秒間振とうします ( 図 1. B 参照 ) 9 ELISA リーダーを使用して 490nm または492nm の吸光度を測定します ( 図 1.C を参照 ) 注 : リファレンス波長は600nm 以上にします 10 各サンプルの細胞傷害性パーセントを計算します ( セクション2.1) 82

6 3. トラブルシューティング 現 象 考えられる原因 推奨 発色反応が弱い細胞濃度が低すぎる 細胞濃度を再調製します 物質かアッセイ培地が LDH 活性を阻害している LDH 活性を阻害する化学成分用に 物質あるいは / およびアッセイ培地を テストするために物質コントロール II( セクション 2.1) を使用します ピルビン酸を含む培養培地を使用しないこと 低コントロール 細胞濃度が高すぎる 細胞濃度を再調製します の発色反応が強い 物質かアッセイ培地が LDH 活性を持っている LDH 活性を持つ化学成分用に 物質あるいは / およびアッセイ培地をテストするために物質コントロール I ( セクション2.1) を使用します アッセイに使用した細胞の劣悪な条件のため高い自然放出が起こっている 培養条件をチェックします たとえ短いインキュベーション時間でも ある種の細胞は無血清では生存できません 血清濃度を1-5% に増加します 発色反応は強いが吸光度は低い バックグランドが高いバックグランドが高いと計算により吸光度が低くなり ます 物質かアッセイ培地が LDH 活性を持っている LDH 活性を持つ化学成分用に 物質あるいは / および アッセイ培地をテストするために物質コントロール I ( セクション2.1) を使用します エフェクターコントロール細胞で高い発色反応を示す 不適切な分離や培養条件によるエフェクター細胞の劣悪な条件 細胞培養条件を改善します 密度勾配遠心により死細胞を生エフェクター細胞から分離します 4. この製品の追加情報 作用機序 細胞死は 古典的には原形質膜の損傷の定量化により評価されます 細胞死の精密な測定における 高感度で 定量性があり 信頼性があ る全自動的な方法への必要性が 細胞の生体活性の定量化に対する数 種類の標準的なアッセイの開発を導きました 乳酸脱水素酵素 (LDH) は全ての細胞に存在する 安定な原形質酵 素です これは原形質膜の損傷により 細胞培養上澄に速やかに放出 されます 細胞傷害性検出キット PLUS (LDH) の使用により LDH 活 性は培養上澄中で 1 回の時間ポイントで簡単に測定できます 適切 な停止液が細胞の透明性を高めるため このアッセイは多数の細胞が ウェル内に含まれるとしても 培養プレート中で直接 簡単に LDH を測定できます マイクロプレートリーダー (ELISA リーダー ) の使 用により 多数サンプルの同時測定が可能になります 反応を停止す ることによりアッセイ条件が明確に定義されます 試験は放射性同位 元素を使用しないため安全です 本キットの他の利点としては操作ス テップがより少なくすみ 移送や遠心 前標識のステップが要らない ので ハイスループットに最適であることです 試験原理 細胞上澄をセルフリーで採取し キットの反応混合液とインキュ ベートします LDH 活性は酵素テストで測定されます : 最初に 乳 酸からピルビン酸への LDH による変換により NAD +が NADH/H +に還元されます 次のステップで 触媒 ( ジアフォラーゼ ) が H/H +を NADH/H +からテトラゾリウム塩 INT に転移し フォルマザンに還元します ( 図 5) 図 5: 放出された LDH の測定 最初のステップで 放出された乳酸脱水素酵素 (LDH) が乳酸をピルビン酸に酸化することで NAD +を NADH + /H + に還元します 第 2の酵素反応で 酸素は触媒により NADH + /H +から黄色のテトラゾリウム塩 INT に転移されます 死細胞や細胞膜が損傷した細胞の量が増えると 培養上清中の LDH 活性が上昇します 上清中の酵素活性量の増加は 限られた時間内で形成されるフォルマザン量と強く相関します それゆえ このアッセイ間での発色量は溶解した細胞数と比例します 形成されたフォルマザン色素は水溶性で500nm 付近に幅広い吸収を持ちますが フォルマザン塩である INT はこの付近には顕著な吸収を示しません ( 図 6) 図 6: 細胞傷害性検出キット PLUS (LDH) のワーキング溶液の吸収スペクトラム キットの反応ミックスには RPMI 1640と1% BSA が加えられ 吸収スペクトラムは LDH の存在 (---) および不在 (.) 下で測定されました 感度使用する個々の細胞タイプに応じて ほとんどの実験では (0.2-2) 10 4 細胞 / ウェルで十分です 試験への干渉要因 内因性の LDH 活性が血清や試験物質に見られる場合があります ( セクション2.1を参照 ) 細胞介在性細胞傷害性アッセイでは 損傷を受けたエフェクター細胞から放出された LDH がアッセイ結果に干渉します ( セクション 2.1と3.3を参照 ) LDH やジアフォラーゼの酵素活性を阻害する物質はアッセイに干渉します 適切なコントロールを作成してください ( セクション2.1 参照 ) ピルビン酸は LDH 反応の阻害剤で ある種の培養培地 (DMEM Ham F12 Iscove など ) に含まれます 83

7 参考文献 1 Decker, T. & Lohmann-Matthes, M.-L. (1988). A quick and simple method for the quantitation of lactate dehydrogenase release in measurements of cellular cytotoxicity and tumor necrosis factor (TNF)activity. J. Immun. Meth. 15, Korzeniewski, C. & Callewaert, D. M. (1983). An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J. Immun. Meth. 64, Dubar, V. et al. (1993). In vitro acute effects of tobacco smoke on tumor necrosis factor alpha and interleukin-6 production by alveolar macrophages. Exp. Lung Res. 19, Kondo, T. et al. (1993). Particle spectrum in gluon jets produced in e + e- annihilations at sqrt s around 58 GeV. Toxic. in vitro 7, Murphy, E. J., Roberts, E. & Horrocks, L. A. (1993). Aluminum silicate toxicity in cell cultures. Neuroscience 55, Courjault, F. et al. (1993). Platinum complex-induced dysfunction of cultured renal proximal tubule cells. A comparative study of carboplatin and transplatin with cisplatin. Arch. Toxicol. 67, Shrivastava, R. et al. (1992). Comparison of in vivo acute lethal potency and in vitro cytotoxicity of 48 chemicals. Cell Biology and Toxicology 8, Gelderblom, W. C. A. et al. (1993). Structure-activity relationships of fumonisins in short-term carcinogenesis and cytotoxicity assays. Fd. Chem. Toxic. 31, Thomas, J. P., Geiger, P. G. & Girotti, A. W. (1993). Lethal damage to endothelial cells by oxidized low density lipoprotein: role of selenoperoxidases in cytoprotection against lipid hydroperoxide- and ironmediated reactions. Journal of Lipid Research 34, Sasaki T. et al. (1992)Toxic. in vitro 6, Goergen, J.-L., Marc, A. & Engasser, J.-M. (1993). Determination of cell lysis and death kinetics in continuous hybridoma cultures from the measurement of lactate dehydrogenase release. Cytotechnology 11, Legrand, C. et al. (1992). Lactate dehydrogenase (LDH)activity of the cultured eukaryotic cells as marker of the number of dead cells in the medium [corrected]. J. Biotechnol. 25, Racher, A. J., Looby, D. & Griffiths, J. B. (1990). Use of lactate dehydrogenase release to assess changes in culture viability. Cytotechnology 3, その他 14 Cook, J. A. & Mitchell, J. B. (1989). Viability measurements in mammalian cell systems. Anal. Biochem. 179, Yuhas, J. M., Toya, R. E. & Pazmino, N. H. (1974). Neuraminidase and cell viability: failure to detect cytotoxic effects with dye-exclusion techniques. J. Nat. Cancer Inst. 53, Parks, D. R. et al (1979). Antigen-specific identification and cloning of hybridomas with a fluorescence-activated cell sorter. Proc. Natl. Acad. Sci USA 76, Jones, K. H. & Senft, J. A. (1985). An improved method to determine cell viability by simultaneous staining with fluorescein diacetate-propidium iodide. J. Histochem. Cytochem. 33, Oldham, R. K. et al. (1977). Direct comparison of three isotopic release microtoxicity assays as measures of cell-mediated immunity to Gross virus-induced lymphomas in rats. J. Natl. Cancer Inst. 58, Leibold, W. & Bridge, S. (1979). 75Se-release: a short and long term assay system for cellular cytoxicity. Z. Immunitätsforschung (Immunobiology)155, Kolber, M. A. et al. (1988). Measurement of cytotoxicity by target cell release and retention of the fluorescent dye bis-carboxyethylcarboxyfluorescein (BCECF). J. Immunol. Meth. 108, Danks, A. M. et al. (1992). Cellular alterations produced by the experimental increase in intracellular calcium and the nature of protective effects from pretreatment with nimodipine. Molecular Brain Research 16, Szekeres, J., Pacsa, A. S. & Pejtsik, B. (1981). Measurement of lymphocyte cytotoxicity by assessing endogenous alkaline phosphatase activity of the target cells. J. Immun. Meth. 40, Masanet, J., Gomez-Lechon, M. J. & Castell, J. V. (1988)Toxic. in vitro 2, Martin, A. & Clynes, M. (1991). Acid phosphatase: endpoint for in vitro toxicity tests. In vitro Cell Dev. Biol. 27A,