薬用資源学実習～bioinformatics入門; webを使っての

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たつぞういりぐら
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1 薬用資源学実習 ~bioinformatics 入門 ; web を使ってのデータベースアクセス ~ 課題今回の実習で用いている遺伝子; -グルクロニダーゼプロモーター; 35S プロモーター; TR2 について配列系統樹立体構造論文遺伝子発現量等を調べる beta-glucuronidase について ( 全般配列系統樹 ) - グルクロニダーゼ (beta-glucuronidase) について京大にあるゲノムネットというデータベースで調べてみよう 1. [Google] Google を開いてゲノムネットと検索しゲノムネットのページを開く 2. [GenomeNet] ゲノムネットの Top page にある検索フォームに glucuronidase と打ち込んで検索する 3. [DBGET Search Result] ゲノムネットには glucuronidase に関係のあるエントリーが複数あることが分かるページ中頃の KEGG ORTHOLOGY を見ると beta と alpha がある実験で用いたのは beta の方 beta-glucuronidase のリンク "K01195" をクリックすると beta-glucuronidase についてまとめてあるページが開く 4. [ KEGG ORTHOLOGY:K01195] このページで beta-glucuronidase について分かることは Entry: ゲノムネットでは K01195 という ID が振られている Name: 遺伝子名は uida という Definition: このグループの名前 EC 番号はである Pathway: どの代謝系に関与しているかということこの酵素は複数の代謝に関与していることがわかるリンクをクリックすると画像で確認できる Others DBs: 他の分類データベース Genes:KEGG に収録されているゲノムが解読された生物の beta-glucuronidase 細菌ではしばしば同じ種で別の株 ( 例えば大腸菌の実験室株 K12 と病原性株の O157 のような関係 ) が登録されている

2 以下の表は Genes に出てきた生物の一部をまとめたものであるここでの略記種名補足 HSA Homo sapiens ヒト PTR Pan troglodytes チンパンジー MCC Macaca mulatta アカゲザル CFA Canis familiaris イヌ BTA Bos taurus ウシ SSC Sus scrofa ブタ MDO Monodelphis domestica フクロネズミ OAA Ornithorhynchus anatinus カモノハシ GGA Gallus gallus ニワトリ DRE Danio rerio ゼブラフィッシュ SPU Strongylocentrotus purpuratus ムラサキウニ DME Drosophila melanogaster キイロショウジョウバエ DPO Drosophila pseudoobscura ウスグロショウジョウバエ TCA Tribolium castaneum コクヌストモドキ CEL Caenorhabditis elegans 線虫 NVE Nematostella vectensis イソギンチャク FGR Fusarium graminearum 赤カビ病菌 ANI Aspergillus nidulans 偽巣性コウジ菌 AOR Aspergillus oryzae ニホンコウジカビ ANG Aspergillus niger クロコウジカビ ECO Escherichia coli 大腸菌 ECJ Escherichia coli 大腸菌 ECE Escherichia coli O157 腸管出血性大腸菌 O157 ECC Escherichia coli 尿路病原性大腸菌 ECP Escherichia coli 尿路病原性大腸菌 ECI Escherichia coli 尿路病原性大腸菌 ECV Escherichia coli 鳥病原性大腸菌 ECL Escherichia coli 大腸菌 SFL Shigella flexneri フレクスナー赤痢菌 SFV Shigella flexneri フレクスナー赤痢菌 SSN Shigella sonnei ソンネ菌 ( 赤痢菌の一種 ) SBC Shigella boydii 赤痢菌の一種 HSO Haemophilus somnus ウシ病原菌 SDE Saccharophagus degradans 海洋細菌 SIT Ruegeria sp. 細菌プランクトン SHA Staphylococcus haemolyticus B 群レンサ球菌 SPH Streptococcus pyogenes B 群レンサ球菌

3 SAG Streptococcus agalactiae B 群レンサ球菌 SAN Streptococcus agalactiae B 群レンサ球菌 SAK Streptococcus agalactiae B 群レンサ球菌 SSU Streptococcus suis 05ZYH33 豚レンサ球菌 SSV Streptococcus suis 98HAH33 豚レンサ球菌 LBR Lactobacillus brevis ラブレ菌 ( 乳酸菌 ) CPE Clostridium perfringens ウェルシュ菌 CEF Corynebacterium efficiens コリネ菌 ( アミノ酸産生菌 ) AAU Arthrobacter aurescens アースロバクター PAC Propionibacterium acnes アクネ菌 ( プロピオン酸菌 ) ABA Acidobacteria bacterium アシドバクテリア SUS Solibacter usitatus アシドバクテリア FJO Flavobacterium johnsoniae フラボバクテリウム ( 滑走性細菌 ) TMA Thermotoga maritima 好熱菌 TPT Thermotoga petrophila 好熱菌 SSO Sulfolobus solfataricus 好熱古細菌 etc beta-glucuronidase はヒトを含めた高等動物や真性細菌古細菌にもありかなり普遍的に存在するが植物には無いことがわかる今回の実験ではタバコにおいて 2 種類のプロモーター (35S,TR2) がどのように発現するかを調べるのに大腸菌の beta-glucuronidase を用いたこれはタバコに beta-glucuronidase が無いからで例えばヒトにおいて同じ実験を行うなら調べたいプロモーターをヒトが持っていない酵素と繋いで実験する必要がある 5. 大腸菌 (E. coli) は ECO と略されている Genes の show all をクリックし中ほどにある b1617 をクリックする 6. [KEGG E.coli:b1617] アミノ酸配列 (AA seq) や核酸配列 (NT seq) が掲載されているこれは薬用資源学実習書 p. 52 に書いてある配列と同じなので実験で使った beta-glucuronidase は大腸菌由来のものであることが確認できる 7. この E. coli の配列を基にして beta-glucuronidase の系統樹を書いてみよう系統樹とは遺伝子がどのくらい似ているかをツリー構造で示したもので分子生物学ではよく使う 8. 遺伝子が近いか遠いかを調べるには通常アミノ酸配列を用いる核酸配列は ACGT の 4 種類しかないので偶然同じになることがあるがアミノ酸は 20 種類あるので偶然では同じになりにくくさらに例えばアラニンとバリンが似ているといったように機能に類縁性があるので遺伝子の似ている似ていないを評価しやすいからである 9. AA Seq にある DB search をクリックする BLAST のページを開く

4 BLAST とは配列の似ている遺伝子を探すソフトで核酸配列にも適用することができる 10. [Sequence Similarity Search - BLAST] どの配列データベースに当てるか選ぶ今回はそのまま KEGG のデータベースに対して検索することにしてそのまま Compute をクリックする 11. [BLASTP Search Result] BLAST result の画面になり問い合わせ配列つまり E. coli の beta-glucuronidase に似ている配列が似ている順にリストになって出てくる 12. リストの中身を見てみると大半は beta-glucuronidase と説明されているがいくつかの遺伝子は beta-galactosidase となっているデータベースの情報には間違いがあることもあり注意が必要だがこの場合は beta-glucuronidase (EC: ) が beta-galactosidase (EC: ) と遠く似ていることを反映している 13. GenomeNet の BLAST は工夫されていてこれらの似ている遺伝子群からアラインメントと系統樹を作成することができる画面一番上の select operation と書いてあるプルダウンメニューから CLUSTALW を選び Exec をクリックする ClustalW はアラインメント作成ソフトである 14. [CLUSTALW Result] 画面の最初の方はログが書かれているだけなので下の方へスクロールする 15. 中頃からアラインメントが出てくるアラインメントとは同じアミノ酸を同じ位置になるように並べた図のことで遺伝子の中で保存されている領域と保存されていない領域を判断するのに使う 16. 系統樹を書くには画面一番下の select tree menu から書かせたい系統樹の方法を選ぶここでは rooted phylogenetic tree (UPGMA) を選び Exec をクリックする 17. [rooted phylogenetic tree (UPGMA)] 結果の図を見ることができる元の配列 (eco; E. coli) に最も近い配列は rir の配列だということが分かる rir はアグロバクテリウムの一種であるがアグロバクテリウムは大腸菌と同じ原核生物であり配列が似ていることにも納得が行く次に近い配列の ssj は赤痢菌であるがこちらもやはり原核生物他に近いものとして ecy や ecw の配列がみられるがこれらは E. coli の一種である E. coli 同士なので配列が似ているのはやはり自然であると言えるこのように通常は種の系統樹と遺伝子の系統樹は一致するこの系統樹は画像を右クリックして保存することができる 18. 少し戻って beta-glucuronidase の分類について見てみよう 19. [KEGG E.coli:b1617]

5 EC による分類へ移動してみよう Orthology にある EC 番号 (EC: ) をクリックしよう 20. [KEGG ENZYME ] 先程のまとめ画面と重複もあるがここでは beta-glucuronidase の酵素としての性質が中心にまとめられている例えば Reaction ( 反応式 ) Substrate ( 基質 ) Product ( 生成物 ) 等が書かれている 21. ( 余裕のある人用その1) 植物に本当に beta-glucuronidase が無いのか確かめてみようこの大腸菌の beta-glucuronidase の配列を植物でゲノムが詳細に解読されている Arabidopsis ( 和名 : シロイヌナズナ ) に対して BLAST で検索してみる Arabidopsis の BLAST を掛けるホームページは Google で "Arabidopsis BLAST" と検索する 22. ( 余裕のある人用その2) beta-glucuronidase の配列を基に細胞内局在を予測してみよう細胞内局在を予測するソフトの一つに Wolf PSORT がある Google で " Wolf PSORT " と検索し Wolf PSORT のホームページに行き配列を検索してみよう beta-glucuronidase について ( 立体構造 ) 次は立体構造について調べてみよう立体構造のデータベースにはどんなものがあるだろうか? 1. [Google] Google を開いて立体構造データベースと検索 2. [PDBj] 日本蛋白質構造データバンク Protein Data Bank Japan (PDBj) というホームページが Hit したここでサービス一覧から検索をクリックした後 PDB 検索 (PDBj Mine) をクリックする 3. [PDBj Mine トップページ ] 簡易検索のフォームに "beta-glucuronidase" と入力し検索をクリックする 4. 何件かの登録がある一番上の 1BHG をクリックしてみよう 5. [PDBj Mine 概要ページ : 1BHG] このページでこの登録について分かることは PDB では 1BHG という ID が振られている 4 量体になっているヒト (Homo sapiens) の beta-glucuronidase である論文は 1997 年に Nat. Struct. Biol という雑誌で報告されている画像が見られる (viewer を設定すれば自分で動かして見ることもできる )

6 beta-glucuronidase について ( 遺伝子発現 ) ヒトに beta-glucuronidase があることが分かったので次はどの細胞で発現しているのか調べてみよう 1. [Google] Google で検索してゲノムネットのページを開く 2. [GenomeNet] Search を統合データベースから遺伝子に変更して "glucuronidase" を検索する 3. [Search Result] KEGG ORTHOLOGY の beta-glucuronidase (ko:k01195) をクリックする 4. [ko:k01195] ヒトでの遺伝子発現が知りたいので Genes 欄のヒト (HSA: 2990) をクリックする 5. [H.sapiens 2990] Other DBs の中ほど NCBI-GeneID:2990 をクリックする UniGene は NCBI が行っているデータベースである 6. [Gene] 一番上には遺伝子の基本情報とエキソンイントロン構造の図がある一番下の Additional Links に UniGene へのリンクがあるので見てみよう (Hs ) 7. [UniGene] 中ごろの GENE EXPRESSION の中に EST Profile というリンクがあるのでとんでみよう 8. [EST Profile Hs ] NCBI が作成している UniGene というデータベースの中で EST の取得された組織が分かるようになっているこの EST の ( つまり遺伝子発現の ) 組織特異性を見ると殆どの組織で満遍なく発現していることが分かる beta-glucuronidase について ( 論文 ) 論文はアメリカの NCBI という団体が作成している Pub Med というデータベースを用いて検索するとよい 1. [Google]

7 Google で NCBI を検索して開く 2. [NCBI] 検索対象を All Databases から Pub Med に変更する検索フォームに beta-glucuronidase と入力し Search をクリックする 3.beta-glucuronidase に関する論文が約 18,000 件も出てくるここでは最新のものから順に並べられている今度は論文のタイトルに beta-glucuronidase が含まれている論文だけを検索してみようフォームに beta-glucuronidase[title] という風に [Title] という単語を加える Search をクリックして検索する 4. 2,000 件以上もあり beta-glucuronidase に関して多くの研究がなされていることが分かるヒトの遺伝子がいつ単離されたのか調べてみよう検索キーワードに human と cloning を加え beta-glucuronidase[title] AND human AND cloning と入力する数件の論文があるがその中からヒトの beta-glucuronidase の単離についての論文を探す今回は 1990 年 Miller RD らによる論文および 1987 年 Oshima A らによる論文が該当する 6. リスト中のタイトルをクリックすると要約 (Abstract) を読むことができる 35S promoter について ( 論文 ) PubMed で論文を検索するのは非常に重要なことなのでもう少し慣れておこう実習では 35S promoter は全ての組織で発現していたこのことについて書いてある論文を検索してみよう 1. [NCBI] 検索対象を Pub Med にして検索フォームに 35S promoter と入力して検索する 2. 2,000 件以上の論文が Hit した多すぎてよく分からないので 35S promoter[title] AND tissue specificity と検索してみよう 3. カリフラワーモザイクウイルス 35S プロモーターの活性に必要な DNA 配列の identification という論文だけが残った要約を見てみよう 4. 要約の最後に "The 35S promoter showed no tissue-specificity of expression" つまりこの 35S プロモーターは発現の組織特異性を示さなかったとある図書館に行ってこの論文を読めばさらに詳しいことが分かるまたこの要約の中ほどには転写開始点から上流 105bp

8 の領域が遺伝子発現に必要であることが記載されている 35S promoter について ( 配列 ) 35S promoter はカリフラワーモザイクウイルスの 35S rrna のプロモーターで配列が短い組織特異性が無い強い遺伝子発現を導くなどの理由で植物系の研究では多用される今度は NCBI から配列を調べてみよう 1. [Google] Google で NCBI を検索して開く 2. [NCBI] 検索対象を Nucleotide に変更検索フォームに 35S promoter と入力し検索する 3. 約 1200 個もの遺伝子が Hit したこれではよく分からないそこで右の Top Organisms で More をクリックし Cauliflower mosaic virus を選択する 4. 以上のように候補を絞り込んだうえで目的とする配列を探す TR2 promoter について ( 配列 ) TR2 promoter は土壌細菌の Agrobacterium tumefaciens の持つ Ti plasmid 上の TR-DNA 領域にある 2 'gene (mannopine synthase) の promoter である 1. [NCBI] まず単純に NCBI で検索対象を Nucleotide にして TR2 promoter と検索してみよう 2. Hit 件数が多くないので全てのタイトルを見てみるが残念ながらこの検索語では目的の情報が出てこない 3. [NCBI] そこで今度は TR2' promoter と検索してみよう 4. この検索語でもうまくいかなかった 5. [Google] そこで新たなキーワードを探すため Google で TR2-promoter lens と検索してみよう 6. [Search result] 検索結果の一件目の EP B1 Wound-inducible Expression In Plants - The

9 Lens というページを見てみると Claims 1. の最後の方に TR2' promoter of the mannopine synthase gene という表現がある TR2 promoter が mannopine synthase の promoter であることを思い出して "mannopine synthase" と promoter でさっきの NCBI から検索してみよう 7. [NCBI] NCBI で検索対象を Nucleotide にして "mannopine synthase" promoter を検索する 8. 1 番目が知りたかった TR2' promoter の配列のようである ID をクリックして中を確かめることここまで上手くできただろうか次は腕試し今行ったことを利用して自分の興味のあるものについて調べてみようゲノムネットや NCBI を基点にするのが分かりやすいだろう ( 例 ) 狂牛病の原因となっているプリオン (prion) 遺伝子名機能発現する組織正常なものと異常なものの立体構造肝臓の健常度の指標となっている gamma-gtp (EC: ) GOT (EC: ) 遺伝子機能発現特異性ヒトの ABO 血液型 (ABO blood) を決める遺伝子遺伝子名酵素反応 ABO の遺伝子はどこが異なるか ( アラインメント ) 他の哺乳類の血液型との関連 ( 系統樹 ) 重症急性呼吸器症候群 (SARS; Severe Acute Respiratory Syndrome) コロナウイルス (corona virus) 何株のゲノムが決まっているかゲノムの長さ遺伝子数 ( ポリプロテインというのを聞いた事が無い人は Google で調べてみよう ) 古い論文の本文ワトソンとクリックが 1953 年に発表した DNA 二重らせんについての論文 ( 本物は A4 用紙 1 枚に簡単な英語で書かれている論文なので読んだことが無い人は是非読んでみよう web で取れなかった人も取れた人も図書館で本物を見てみるといいかもしれない )

10 クリスマスツリーで知られるモミノキ (Abies firma) について論文は存在するか配列は? 他にもデータベースは沢山存在する有名なものはリンク集のようなもの (Google で生物ツール集などと検索するとリンク集が出てくる ) からいけるだろうし特定のユーザーが用いるようなちょっとしたものは個々の論文に記載されているまたデータベースの紹介だけの特集号を設けている論文誌もある ( 参考 : NAR のデータベース特集号 (2005 年 )) 研究と平行してこれらのデータベースより自分の研究に関係のある情報を収集するということは研究を進める上で大切なことである参考書改訂第二版バイオデータベースとウェブツールの手とり足とり活用法今回の web 実習のようなことが色々なデータベースについて非常に分かりやすく記述されている東大生命系 3 年生のコンピュータ実習資料 Web サイトの資料なのでアクセスしやすい一度参照してみよう

国際塩基配列データベース n DNA のデータベース GenBank ( アメリカ :Na,onal Center for Biotechnology Informa,on, NCBI が運営 ) EMBL ( ヨーロッパ : 欧州生命情報学研究所が運営 ) DDBJ ( 日本 : 国立遺伝研内の日

生物情報工学 BioInforma*cs 3 遺伝子データベース 16/06/09 1 国際塩基配列データベース n DNA のデータベース GenBank ( アメリカ :Na,onal Center for Biotechnology Informa,on, NCBI が運営 ) EMBL ( ヨーロッパ : 欧州生命情報学研究所が運営 ) DDBJ ( 日本 : 国立遺伝研内の日本 DNA データバンクが運営

薬用資源学実習 ～bioinformatics入門; webを使っての

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