Really Lie? (Dr. Olson, University of Washington School of Medicine) Human Genetic Diversity: Reconstructing the Past (Dr. Stoneking, Max Planck Insti

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はないちぞの
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th Annual ASHI Meeting ASHI 27th Annual Meeting HLA Hyatt Regency San Francisco 10 13 17 American Society for Histocompatibility and Immunogenetics 27th Annual Meeting Kamon 25 10 9 11 ABI day Dr.

1 th Annual ASHI Meeting ASHI 27th Annual Meeting HLA Hyatt Regency San Francisco American Society for Histocompatibility and Immunogenetics 27th Annual Meeting Kamon ABI day Dr. Goulmy Dr. Class HLA Dr. Brautobal Dr... Albart Dr. Doxsiadis Dr. W. F. Bodmer Dr. S Marsh Hyatt Overview Hyatt Regency San Francisco 13 ABHI (American Board Histocompatibility and Immunogenetics) Laboratory Welcome Reception Director s Examination, ABHI CHT / CHS (Certified Histocompatibility Technologists / Certified Histocompatibility Specialists) Examinations, ASHI Committee Meeting, Accreditation Inspectors Workshop, Registration, 14 Beyond Sequencing of the Human Genome: Where do the New Opportunities for Medical Advances o KAMON

2 Really Lie? (Dr. Olson, University of Washington School of Medicine) Human Genetic Diversity: Reconstructing the Past (Dr. Stoneking, Max Planck Institute for Evolutionary Anthropology, Germany) HLA Class I Symposium 1 GVHD GVHD Michigan Cancer Plenary Session 1 EMERGING TECHNOLOGYS Center James Ferrara 1. Gene Expression Profiling of Allograft Rejection Symposium 2 Minor Histocompatibility Antigens using cdna Microarrays Allogeneic Stem Cell 2. Moleculare Mechanisms and Diagnosisof Allograft Transplantation Rejection GVL effects GVHD Basic Science Session Engraftment and Tolerance SCT cdna Microarray mini Transplantation TH2 CD4 TC1 CD8 T cell Receptor alpha MHC class II DP Clinical beta CD8alpha IL-2R Science Session New Insights on Factors affecting Bone Marrow/ Stem Cell Transplantation NKG5/granulysin Granulysin HLA mismatch KIR pathway Basic GVHD Science Session New Technology In Major KIR Histocompatibility Complex(MHC) Stidies; Flow SSO KIR HLA (A new Reverse SSOHLA DNA typing method using fluorescently Labeled Microspheres and Flow KIR Analyzer) Clinical Science Session Molecular Applications in Clinical Testing; RSCA (Reference Strand-Mediated Conformation Analysis) 15 Stem Cell Transplantation Plenary Session 2 Hematopoietic Stem Cell Transplantation Effie Petersdorf Eliane Gluckman Stella Davies o KAMON

3 16 Plenary Session 3: Xenotransplantation Basic MHC and Science Session Disease Association-I Clinical Science Session Plenary Session 4: AutoImmunity: HLA Association in Autoimmune Disease-Gene Involved and Their Possible Functions HLA Dr. Thorsby 17 Plenary session 5 NK Cells NK Cell Dr. Parham Dr. Lanier Dr. Velardi Donor-vs-Recipient NK alloreaction GVL GVHD GVHD Basic Science Seaaion Immunologic Factors in Transplantation and Disease, Clinical Science Session MHC and DiseaseAssociations-II, Symposium 3 Classical NK Recognision, Symposium 4 Non-Classical Class Abbott Diagnostics, GenoVision, Inc., One Lambda, Inc. 28Th Annual Meeting: October 19-23, 2002 Opryland Hotel Nashvill, Tennessee Humoral Immunity of Allografts 29Th Annual Meeting: October 28-November1, 2003 Fontainebleau Hilton Resort and Towers Miami Beach, Florida ASHI ASHI I and NK Recognition Workshop; Engraftment Testing ASHI ASHI Contributor s Abbott Diagnostics, Biotest Diagnostics Corporation, Dynal Biotech, Inc.UK, GenoVision, INC.,Gentra Systems, Inc., Lifecordes Corporation, Pel-Freez Educational Clinical System Grants o KAMON

4 Non-classical MHC MHC I MHC MHC HLA-E, -F, -G, CD1, MR1, MIC, Zn-a2-glycoprotein, TL MH (1q21-q22) CD1 CD1 CD1d Non-classical MHC CD1d GPI MHC TCR NKT MHC CD1d mrna HLA MHC CD1d MHC science b2m MHC MHC (1q25) MHC MR1 MHC I CD1 b2m semiallograft HLA-G HLA Ib (HLA-E, -F) HLA-G -E NK HLA Ia HLA I o KAMON

5 1.8Mb I HLA <HLA-F-MICE> HLA HLA I MIC HLA I (MICA, MICB, MICC, MICD, HLA-A -B -C -DRB1 -DQB1 MICE, MICF, MICG) MICA MICB MICE non-classical MHC multiple MHC HLA non-classical MHC HLA MHC GVHD (graft-versus-host disease) HLA HLA (minor 2 MHC histocompatibility antigen; mha) HLA HLA MHC T TCR HLA TCR TCR 4 HLA TCR-MHC- T MHC (SLE) I HLA (IDDM) (RA) (HLA-DP, -DQ,-DR) HLA DR MAPK/p37 MAPK/Erk (IL-1b) DP DQ MAPK/p37 SNP (IL-10/12) HLA HLA non-hla IDDM T GAD65 ( 3 MHC ) JOHN HANSEN (Fred Hutchinson Cancer Res. Ctr.) (molecular mimicry) Paul Terasaki (Terasaki HLA non-hla Foundation Lab.) HLA o KAMON

6 I,, 5 MHC, IV, V I,, I HLA HLA MHC I HLA TNFA BAT1 TNFA ATP6G IKBL BAT1 HLA HLA HLA 100 I HLA HLA HLA HLA HLA HLA MHC HLA SSOP DNA PCR HLA Long Read Tower TM System MALDI-TOF/MS DNA MHC genome duplication DNA HLA MHC TAP LMP DNA HSP70 15 HLA-B 1 1q q p kb PCR DNA DNA MHC MHC TAP LMP HSP70 MHC HLA I 1999 HLA HLA o KAMON

7 MHC MHC SNP A24,B54,DR4 DNA HLA 1.9 Mb 2530 kb ( : 110 kb : 200 kb : 550 HLA-F LTB 50 : 300 kb : 80 kb : 890 kb) HCG 7 HCG kb 437kb HLA I MIC 379 kb 1999 MHC MHC birth and death 253 SNP 1.5 kb SNP I RING3, TAP2 2.9kb 1.3 kb SNP 83 PCR 3549 BAC MHC I HLA 1.6 Mb BAC 4 MHC 660 kb HLA MIC 14 HLA-B 95 kb MHC MHC 1.5% DRB3 MHC HCV C 400 DRB3 38 HIV DRB3*1601 DRB3*14011 MHC MHC DRB1 MHC B MHC MHC MHC B MHC o KAMON

8 学会リポート特集 10 th JSHI ランチョンセミナーリポート HLA SBT の方向性検査室で出来る SBT (VGI SBT システムについて ) 東海大学医学部分子生命科学系遺伝情報部門成瀬妙子はじめに HLA 対立遺伝子の塩基配列多型を直接検出可能な検査法として Sequencing Based Typing (SBT) 法が登場してから 7 年が経過しました 1994 年我々は幸運にも米国で開かれた第一回の SBT テクニカルセミナーに参加させて頂く機会に恵まれたことがきっかけでこうして SBT に関わるお仕事をさせて頂いておりますこの間にも様々な改良が加えられまた新たなシーケンサーの開発新技術の導入さらには試薬キットや解析ソフトの充実といった面に支えられ SBT によるタイピングの精度は大きく向上しましたこうした進歩に合わせいよいよ SBT においてもその方向性を選択する時期が到来していると考えますすなわち目的用途に合わせて異なるシステムの SBT を選択あるいは使い分けることが HLA SBT の精度向上につながると考えられるのです当教室においても従来より使用しております ABI 社製に加え昨年度より VISIBLE GENETICS 社 ( 以下 VGI) の SBT システムを導入し研究の効率化を図っております去る 11 月 2 日日本組織適合性学会において開催されたベリタスランチョンセミナーでは我々の SBT システム活用法をご紹介させて頂くことが出来ましたので本稿ではその際にお話しした内容を中心にまとめてみました SBT とはなにか SBT とは塩基配列決定法を基本とした HLA タイピング法です本法が他方と画期的に異なる点は個々の対立遺伝子について塩基配列の違いを直接検出可能ということです従って職人芸的なフィルターの洗浄操作もプローブや制限酵素の非特異的反応を考慮する必要もなくまた HLA に関する連鎖不平衡や遺伝子頻度などの知識やタイピングの経験が浅い人でも比較的誤判定の少ないよい結果が得られますしかしながら従来は SBT の S に重点を置かなければ正しい結果が得られませんでしたつまりシークエンス結果を判定ソフトに読み込ませたり目読での判定を行うにはバックグラウンドの低い均一な塩基配列波形を得なければならずそのためにはサンプル DNA の純度濃度を均一にし PCR 終了後やシークエンス反応終了後にはサンプル精製の作業を丁寧に行わなくてはなりませんまた機種によっては塩基配列を読み取るための泳動に 7 時間を要しコストの面でも決して安価ではありません従って SBT とは誰もが認める究極の高精度タイピング法でありながらすぐには導入できないのが現状です VGI を用いて手軽に SBT さて筆者らはもっと手軽に SBT を行うために VGI SBT システムを導入し以来超高精度タイピング法として活用していますがその最も大きな理由は以下の通りです 1. 迅速簡便サンプル DNA を PCR で増幅後シークエンス反応の鋳型として用いますシークエンス反応の終了後は即座にサンプルを泳動できこの間の精製はまったく不要ですさらに泳動の結果を左右するゲルはカートリッジから注入して数分で出来上がり泳動は 30 分で終了しますこうした操作は他法での DNA タイピングとほとんど同じ感覚で行え特別な手技は不要です 2. 少数検体向き一回の泳動でクラス II では 2 検体クラス I では 1 検体がタイピング出来ますこれは他社から見れば同時に最大の欠点でもありますが再検査や確認用など少数の検体を扱う場合には最適です 1 検体のために大きなゲルを調整することも不要ですから省コストにつながりますまた機械もコンパクトなので場所の確保に困りませんし使用電圧は 100V なので高圧電源の設置も不要省エネでしかもいつでも器機の移動が可能です 3. 解析ソフトの操作性実は VGI システムの一番大きな魅力は判定ソフトの操作性のよさにあります本システムは面倒な塩基配列生データの編集を自動で行うためいわゆる研究領域のシークエンシングに精通していない人でも手軽に塩基配列情報を得られますまたこの生データにほとんど手を加えることなくライブラリーとの照合対立遺伝子候補の絞り込みが可能で判定に要する時間を大幅に短縮できます No KAMON

生データを基に割り出された候補対立遺伝子の組み合わせは一致度の高い順からすべてリストアップされ塩基配列波形データ候補遺伝子との不一致部分などと共に同一解析画面上に表されます ( 図 1) 例えば塩基配列部分は多型を示す配列部位をオレンジで示しているのでその部分の波形を重点的にチェックし逆に非多型配列部分は波形の乱れを修正せずとも候補遺伝子が得られます実はこのことが

9 生データを基に割り出された候補対立遺伝子の組み合わせは一致度の高い順からすべてリストアップされ塩基配列波形データ候補遺伝子との不一致部分などと共に同一解析画面上に表されます ( 図 1) 例えば塩基配列部分は多型を示す配列部位をオレンジで示しているのでその部分の波形を重点的にチェックし逆に非多型配列部分は波形の乱れを修正せずとも候補遺伝子が得られます実はこのことが本ソフトの優れた点であり我々は画面を見ながら識別に必要な塩基配列部分のみに焦点を当て消去法による解析を行うことで非常にスピーディーにタイピングを行っています検査室でできる SBT こうして御紹介した条件は HLA タイピングをルーチンワークとする検査室などで少数検体について手軽に SBT を行うには最適ですまた一部のサンプルのみをさらに詳細に解析する場合や候補遺伝子の絞り込みが必要な場合には有用と考えられますこれまで大掛かりな SBT システムが導入不可能だった検査室などで今後本システムが活用されることを期待しています図 No KAMON

10 学会リポート特集 10 th JSHI ランチョンセミナーリポートフォレンジック社セミナー SBT 試薬の最新版 Forensic 社製 SBT 試薬 AlleleSEQR 東海大学医学部分子生命科学河田寿子蛍光シークエンサーの開発によりシークエンスは難しい技術ではなくなりましたまたシークエンスを利用した HLA タイピング法も開発され試薬機器解析ソフトを使用した HLA SBT (sequencing based typing) 法として確立されておりますプロトコールどおりにすすめてゆけば初心者でも簡単に HLA 遺伝子型の決定ができるシステムになっていますこの SBT 法を迅速におこなうためには解析に使用するシークエンスデータが解析ソフトの認識しやすい美しいデータであることが重要ですそして蛍光試薬を使用した解析には操作するときにいくつかの注意すべき点があります今回検討を行ったフォレンジック社製 AlleleSEQR SBT kit は操作が簡単で蛍光試薬検出におこりやすい障害を取り除くような試薬プロトコールを用い解析しやすいシークエンスデータを得られる方法であると考えられますので紹介していきたいと思いますシークエンスのポイント HLA 解析のみならずシークエンス解析を行うためには決まった操作の流れがあります目的遺伝子の増幅増幅確認の電気泳動 PCR 産物の精製サイクルシークエンスの PCR エタノール沈澱蛍光シークエンサーによる電気泳動解析順番に並べてみましたがこの中にシークエンスデータに大きな影響を与えるステップが 3 箇所ありますそれは 1) 目的遺伝子の増幅 2)PCR 産物の精製 3) エタノ - ル沈澱ですなぜなら市販されているシークエンスキットは蛍光 PCR 用の試薬のみ供給されておりその他の必要な操作に関する試薬は別に用意しなければならず内容などをそれぞれ検討する必要があります従来の SBT kit も目的遺伝子増幅用のプライマーミックス蛍光 PCR 用の試薬は入っていますがやはり精製エタ沈用の試薬は含まれていません No KAMON

11 それゆえどのような操作試薬を選択するかによってシークエンスデータの検出結果や操作性が変化します AlleleSEQR SBT kit は目的遺伝子増幅から蛍光 PCR 産物のエタノ - ル沈澱までの必要な試薬プロトコールが用意されており購入してすぐにエタノール沈澱までが完了し試薬などを新たに用意する必要がありませんまた使用蛍光色素も蛍光強度にばらつきが少ないものであるためヘテロ接合体の検出が容易であるという特徴を持っています 1) 目的遺伝子の増幅ここから実際の操作について説明していきますこの最初の PCR 増幅が成功しないと SBT は先に進むことができません一番重要なのが抽出された DNA サンプルが pure でコンタミを含まず正確な濃度がわかっていて量が十分あることですしかしそのようなサンプルはどのタイピング法を用いても結果は得られるものでありますそれでは PCR がかからないサンプルとはどのようなものでしょうか最初の PCR がうまくいかない理由としては 1 DNA の抽出がうまくいっていない 2 DNA の濃度が薄いということが多いようです表 1 に当研究室で使用した 3 つの SBT kit の比較が書いてあります AlleleSEQR に特徴的なのは PCR に使用するサンプル量が少なくて済むということですクラス Ⅰ タイピングは解析領域が exon2 と exon3 なので増幅の長さが約 1kb そして必要な DNA サンプル量は一番少ない 60ng となっています他社の 2kb のものと比較して 1kb のものは増幅領域が短いために PCR がかかりやすいといった感触を得ていますそしてクラス Ⅱ タイピングでは増幅試薬を 1 種類で行うため前もって SSP 法を行う必要がなくそのため非常に少ないサンプル量で解析ができるということですまたクラス Ⅰ クラス Ⅱ 共に電気泳動による確認を行いませんここで操作が 1 つ簡略化されています ( 表 1) 少ないサンプル量は DNA 中の PCR 反応阻害物質の混入をおさえ増幅しやすいという利点もあります試薬反応量は決まっているので濃度が薄くてもサンプル量を増やすことはできません少量で確実に増幅するものであれば濃度の問題を解消することができます 2)PCR 産物の精製第一次 PCR により目的遺伝子を増幅したら第二次 PCR すなわちシークエンシングプライマーと蛍光 ddntp を用いたサイクルシークエンシングですがそのままの状態では PCR がかかりません最初に使用したプライマーと dntp が反応を阻害するからですチュ-ブの中にプライマーが複数だと複数のシークエンスを検出してしまいますし過剰な dntp は蛍光試薬中の dntp の取込みを減少させてしまう可能性があります PCR 産物の精製法は 2 種類ありますカラムを使用するものと酵素反応を利用するものです AlleleSEQR は酵素法を採用しており kit の中に Exo/SAP 試薬が入っています最初の PCR 反応チューブに直接試薬を分注しサーマルサイクラーで分の酵素反応分での酵素の失活合計 30 分で終了です Exonuclease が 1 本鎖 DNA(Primer) を分解し SAP(Shrimp Alkaline Phosphatase) が dntp を分解し PCR 産物の精製が完了します最初のPCRチューブに試薬を分注するだけなのでこの方法は操作が楽で検体の取り違えや操作ミスによるサンプルのロスが少なくなりますし特別用意する物もありません 3) エタノール沈澱蛍光 PCR が終了したら PCR 産物のエタノール沈澱を行いますがここが最も重要なステップです試薬をいれて遠心するだけなのですがシークエンスデータを美しくだすためにはここを慎重に行わなければなりませんなぜなら PCR 産物をたくさん沈澱させるような方法をとると過剰な未反応の蛍光色素がノイズとなって解析を阻害しますし沈澱させないような方法をとると短い方のシークエンスの蛍光シグナルが低くなりヘテロ接合体の識別が難しくなります AlleleSEQR SBT kit が使用している方法は ET Terminator 反応ですこの ET Terminator 反応のエタノール沈澱を行うときは kit に入っている EDTA 試薬を使用します EDTA が未反応の蛍光色素を取り除きやすくしシークエンスのノイズを減らす働きをします EDTA は蛍光試薬と結合しやすくシークエンスの際に蛍光シグナル値が低くなる結果が得られております我々の研究室では最初の DNA サンプルを TE Buffer で溶解してあるものを使用した場合水で希釈したサンプルの蛍光強度と比較すると約 1 /3 のシグナル値が検出されますですから我々はシークエンスのためのサンプルは TE Buffer では希釈しないようにしています別の試薬のプロトコールでは TE Buffer の EDTA 濃度を変えているところもあるようですしかしここではそれを逆に未反応蛍光を除去するために使用しています最初に EDTA で蛍光を除去しながらリンス時にエタノールの濃度をあげてさらに反応した産物をおとすというわけです少しくらい蛍光を除いても感度の良いわずかな蛍光 PCR 産物で検出をおこなうということでしょうか No KAMON

シークエンスデータとタイピング実際の解析データを 2 種類示しました今年の QC ワークショップで使用した DNA サンプルの従来の SBT kit と AlleleSEQR を使用したものの HLA-B のシークエンスデータです上が Forward 下が Reverse 方向の exon2 のシークエンスです HLA 解析ソフトで処理されていますので Reverse 側は

12 シークエンスデータとタイピング実際の解析データを 2 種類示しました今年の QC ワークショップで使用した DNA サンプルの従来の SBT kit と AlleleSEQR を使用したものの HLA-B のシークエンスデータです上が Forward 下が Reverse 方向の exon2 のシークエンスです HLA 解析ソフトで処理されていますので Reverse 側は Forward 側と同じ方向から読んでいる形になっています最初に図 1 で示した Dye terminator での解析ですが黒い矢印の部分がヘテロ解析部分です HLA 解析ソフトはヘテロ部分のピークの重なりが 40% 以上のものをヘテロとして解析するように設定されていますですから左から 2 本目の矢印のように半分以下のピークであるときはヘテロと認識されませんこの場合反対鎖の相当塩基部分にヘテロのピークが観察される場合自分で修正してヘテロと解析します左から 3 本目と 6 本目の矢印は一見ヘテロのようなピークにみえながら反対鎖にはヘテロの結果がでていないノイズピークであると判定しますこのように機械で判定したものの正解を人間の目で確認しながら解析していくわけですシークエンスデータは出ているのになぜ解析ソフトにかからないのか? それはこのノイズピークが原因なのです次に図 2 で示した AlelleSEQR での解析です上が Forward 下が Reverse の exon2 の解析で先ほどシークエンスデータと全く同位置を示していますこの解析データを図 1 SBT ClassⅠ-B kit Dye terminator 解析画面 No KAMON

みるとヘテロと間違えてしまうようなノイズピ - クがみられずきれいなバンドパターンが得られていますまたへテロのピークの高さがほぼ同じかまたは半分以上重なっていることが確認されます全体の高さとしては低いけれども 2 本のピークは確実に重なっているこれは解析ソフトが確実にヘテロと認識するものですし修正作業においてもヘテロピークは黒くつぶれて目立ちますので確認しやすく

13 みるとヘテロと間違えてしまうようなノイズピ - クがみられずきれいなバンドパターンが得られていますまたへテロのピークの高さがほぼ同じかまたは半分以上重なっていることが確認されます全体の高さとしては低いけれども 2 本のピークは確実に重なっているこれは解析ソフトが確実にヘテロと認識するものですし修正作業においてもヘテロピークは黒くつぶれて目立ちますので確認しやすく解析が早く終了します今回の結果でもクラス I は exon2, 3 での解析なので絞り込めないものも一部ありましたが結果は同じで解析ソフトでの作業は AlleleSEQR 試薬の方が早く終了するという結果になりました SBT はシークエンスを使用したタイピング法でありますので HLA の知識も必要ですがシークエンスの知識も必要ですですが HLA タイピングを SBT で行う技術者のほとんどはシークエンスの経験のない方が多いのではないでしょうかシークエンス技術と HLA タイピングの解釈この 2 つがあって正確な HLA SBT が完成されると思いますのでワークショップなどでどんどん問題をディスカッションしましょう実はシークエンスは仕事をしている人に聞いた方が早く問題解決するんですよ図 2 AlleleSEQR ClassⅠ-B Typing kit ET terminator 解析画面 No KAMON

14 学会リポート特集 10 th JSHI ランチョンセミナーリポート LABType SSO を使用した HLA タイピング HLA 遺伝子型タイピングで PCR-rSSO 法をメソッドとする場合プローブの支持体に何を用いるかが操作性や解像度に影響を与えてきたエライザ用マイクロプレートを用いれば操作全般の自動化が可能で迅速性に優れ大量処理が可能となるしメンブランを用いれば多くのプローブを貼り付けられ解像度の高い結果が得られるしかしながらこれらの特徴を同時に充たすことは困難であった今回 One Lambda 社から提供される LABMAS ( Lambda Array Beads Multi-Analyte System ) というシステムはこれらの特徴を充たすことは勿論のこと想像を越えた可能性を秘めているようだこのシステムのプラットホームとなる機器が Luminex 社 ( テキサス州オースチン ) が開発した LABScan100 システムである原理はフローサイトメトリーと同じであるが細胞膜上のレセプターを染め分けて測定する従来のフローサイトメトリーとは異なる直径 5.5μm のポリスチレンビーズを赤とオレンジ 2 種類の蛍光色素で段階的に 100 種類に色分けして測定仕分ける装置である LABType SSO ではこの色分けされたビーズごとに異なるプローブを結合させ混合してひとつの反応液? とする言い換えるとひとつの反応で最大 100 プローブ同時アッセイが可能であるこれにビオチン標識プライマーで増幅した PCR 産物を混合ハイブリダイズし未結合の PCR 産物を洗浄後ストレプトアヴィヂンでラベリングし各ビーズの発する蛍光シグナルを測定する装置では 100 種類のビーズの蛍光シグナル (Classification) とプローブとハイブリダイズした PCR 産物の蛍光シグナル (Reporter) をそれぞれ別の波長で同時に測定する各色のビーズは均等に混合されているがバラツキは避けられないため最も少ないビーズを 100 カウントしたところで測定は終了するそして得られた蛍光シグナルの平均値を専用の判定ソフトにインポートしその反応パターンからタイピング結果を導くことになる操作時間は 50 検体の場合 PCR が 1 時間 20 分 SSO の操作が 1 時間 15 分測定が 25 分判定が 30 分合計 3 時間 30 分ほどである装置のウォームアップはこの間に行える処理可能数は 96 ウェルマイクロプレートで測定するためプレート遠心のことなども考え偶数枚で行うとすると 1 日 4 枚慣れれば 8 枚くらいはひとりで処理できるのではないだろうか 8 枚処理で 768 検体であるメンブランを使用するレギュラー SSO で 60 プローブ位の系ではどんなに効率よくおこなっても 700 検体処理するには 3~4 週間はかかるであろうただし 768 検体の判定は相当キツイと考えられる製品のラインナップは HLA クラス Ⅰ の A B C HLA クラス Ⅱ の DRB DRB1 DQB1 ということだがクラス Ⅰ クラス Ⅱ で PCR の条件 SSO の操作などは全く同一に設計されている一部はまだ製品化されておらず本セミナーでは HLA-B と DRB1 が紹介された HLA-B が 68 プローブ DRB1 が 46 プローブである検体は日本人に通常みられる HLA 遺伝子型のホモタイプと同一グループ内ヘテロであるこれらは血清学的タイピングではもとより DNA タイピングでも判定を誤りやすいタイプであるところでこの米国産のタイピングシステムは多種多様な米国人に対応した 6,000 通り以上ある NMDP コードに変換された結果がでてくる我々日本人に NMDP コードは膨大過ぎるので日常見られる日本人特有の HLA 型が問題無く導かれるかが興味のあるところである表 1 は HLA-B の結果で表 2 は DRB1 の結果が示されているオリジナルアサインの右横に本キットの結果を 3 通りまで示しそれ以上の組み合わせが存在する場合は Adjustment の項目に > を付してあるまた cut-off 値を調整した場合はそのプローブ番号とで示してある先ほど述べたとおり結果は NMDP コードに変換されてくるので一見わかりにくいが斜体太字で示した結果がオリジナルアサインにヒットしている組み合わせとなる個々の NMDP コードについてはここでは省略する HLA-B では 16 検体のみの検討ということですべてのプローブについて反応性のチェックができていないが全てオリジナルアサインと同一の結果を得ている DRB1 でもほとんど問題なく結果が得られているが DR15 と 16 の一部のアリルで Ambiguity な組み合わせになるため DR15 の方が 2 桁までの結果にとどまる DR4 グループでは現在のプローブの組み合わせでは日本人に多い DRB1*0403 と 0406 の区別ができないまた No KAMON

15 DRB1*0405 がらみも弱いしかし 2 桁にとどめれば何ら問題はないだろうその他 DRB1 の Cell No.40 のプローブ 59 に偽陰性が 1 例生じたが判定に支障はないようださてここまでの説明でこのシステムの凄さがご理解いただけたであろうか操作性迅速性大量検体処理高解像度という相反する条件をどれも現実のものとしている今回取り上げている LABType SSO は HLA タイピングキットであるが実は LABScreen という HLA 抗体検出キットもある LABScreen は B Cell Line から得た抽出抗原をビーズに結合したものであり HLA 抗体のスクリーニングは勿論特異性の同定も可能であるこれまで同一のシステムでタイピングと抗体検査ができるとは想像もしていなかったまたこの 100 色のビーズは 1,000 色位までに拡大可能だそうであるさらに開発担当者は SSP 法との組み合わせで何かを考えているようである表 1.LABType SSO HLA-B の結果 HLA Group Cell No. Conclusion of LAB Type SSO ( NMDP code ) Original Aassignment HLA-B-1 HLA-B-2 HLA-B-3 Adjustment ( Probe No. ) B5 B35 B22 B40 6. * *51 *51 *51 *51AUX *51 *5306 > 4. * *5201 *5201 *5201 * * *5201 *5201 *5201 * *5101 *5201 *51 *5201 *51012 *5201 *5201 *5302 > 8. *5101 *5901 *51 *5901 *51012 *5901 *5112 * , *5102 *35 *51021 *35 *51021 *35ABN *51022 *35ABN > 3. *35 - *35 *35 *35 *3536 *35 *3529 > 14. *35 *1518 *35 *15BHJ *35 *3536 *3529 *15BHJ > 10. *39 *1518 *39 *15BHJ *3905 *15BHJ *39 * *5401 *5502 *54AB *55AA *5401 *55 *54AB *55AA *6701 *5502 *6701 *55AA *6701 * ,67,33 5. * *40AEK *40AEK *40AEK *40 *40AEK * *4002 *4801 *40HDW *4801 *40DVD *4801 *40 *4801 > *4006 *07 *07EH *40HDW *07EH *40DVD *07EH *40 > 11. *07 - *07 *07 *07 *07022 *07 *0726 > No KAMON

16 表 2.LABType SSO HLA-DRB1 の結果 HLA Group Cell No. Conclusion of LAB Type SSO ( NMDP code ) Original Aassignment DRB1-1 DRB1-2 DRB1-3 Adjustment ( Probe No. ) DR1, 10 DR2 DR8 DR5 DR6 DR4 (Homo) DR4 (Hetero) DR7, 9 1. * *01KJ *01KJ *01KJ * * *1001 * *1001 *0101 *1001 *01KJ 4. * *1501 *1501 *1501 *1503 *1501 *15FH > 5. * *1502 *1502 *1502 *1508 *1502 *15012 > 6. * *16021*16021 *16021 * ,37 7. *1502 *1501 *1502 *1501 *1502 * *1501 *1602 *16021 *1502 *16021 * ,37 9. *1502 *1602 *16021 *1502 *16021 * * *0802 *0802 *0802 *08AS *0802 *0804 > 11. * *08CNB *08CNB *08CNB *0814 *08CNB *0819 > 12. *0803 *0802 *0802 *08CNB *0802 *0814 *08CNB *0804 > 13. *1101 *0401 *04 *11 *0435 * *1501 *1101 *1502 *11 *11 * * *12GW *12GW *12GW *1205 *12GW *1207 > 16. * *1202 *1202 *1202 * *1201 *1202 *12GW *1202 *1202 * * *13AMF *13AMF *13AMF *1335 *13AMF *1322 > 19. * *1302 *1302 *1302 *13GHN *1302 *13JEX > 20. *1301 *1302 *1302 *13AMF *1302 * * *14DPJ *14DPJ *14DPJ *1432 *14DPJ *1426 > 22. *1501 *1405 *1501 *14EK *1503 *14EK *15012 *14EK 23. *1502 *1407 *1502 *1407 *1407 * *1405 *1401 *14DPJ *14DPJ *14DPJ *14EK *14DPJ *1426 > 25. *1407 *1401 *1407 *14DPJ *1407 *1432 *1407 *1426 > 26. *1403 *1406 *1403 *1406 *1402 *1412 *0107 * *1501 *1403 *1403 *15022 *1403 *1502 *1403 * * *1406 * *1412 *09012 *09012 * , *0803 *1307 *1347 *0818 *13071 *08CNB *1313 *0824 > 31. * *03NNN *03NNN *03NNN *03VG *03NNN *0316 > 32. * *04 *04 *04 *0434 *04 *04 > 37. * *04GKA *04GKA *04GKA *0424 *04GKA *0430 > 34. * *04KM *04KM *04KM *04KNT 35. * *04 *04 *04 *0432 *04 *04KNT > 36. * *04 *04 *04 *0432 *04 *04KNT > 33. * *04 *04 *04 *0432 *04 *04KNT > 38. * *04 *04 *04 *0107 *04 *04072 > 39. *0405 *0410 *04GKA *04KM *04GKA *04KNT > *0405 *0401 *04 *04GKA *04 * fn 41. *0403 *0406 *04 *04 *04 *0432 *04 *04KNT 42. *0403 *0407 *04 *04 *04 *0432 *04 *04KNT > *0405 *0406 *04 *04KM *0107 *04KM *04072 *04KM > *0405 *0403 *04 *04KM *0107 *04KM *04072 *04KM > 45. *0410 *0406 *04 *04KM *0432 *04KM *04KM * *0410 *0403 *04 *04KM *0432 *04KM *04KM * , * *07MV *07MV *07MV *0703 *07MV *07012 > 48. * *09012 * , * *09012 * , *0701 *0901 *07MV * , No KAMON

17 KAMON GC TATA TATA DNA RNA 1958 DNA central dogma 1000 F. 3 1 initiation site RNA termination HIV human Immunodeficiency Virus RNA RNA DNA RNA 1000 reverse transcription RNA DNA RNA DNA RNA transcription RNA 5 -AAUAAA-3 translation A DNA RNA RNA CAAT CAAT o KAMON

18 mrna Kb RNA RNA RNA 5 A RNA RNA GT RNA GU 3 RNA RNA 5 -AG consensus sequence GT-AG GT-AG rule exon intron 5 16Kb donor splice site 5 3 RNA mature acceptor mrna splice site 3 splicing 16Kb RNA premature mrna 2.2Kb mrna o KAMON

spliceosome RNA DNA RNA RNA mrna mrna ribosome DNA DNA RNA RNA DNA RNA translation mrna DNA A G C U 4 4 20 KAMON 4

19 spliceosome RNA DNA RNA RNA mrna mrna ribosome DNA DNA RNA RNA DNA RNA translation mrna DNA A G C U KAMON 4 codon 20 3 UAA UAG UGA trna RNA RNA trna trna trna mrna trna trna trna mrna glycosylation o KAMON

20 KAMON HLA(8) 21 MHC MHC HLA MHC MHC MHC MHC MHC MHC BoLA class DRB3 HLA allele PCR-RFLP PCR-SSO allele allele new allele 21 BoLA MHC allele MHC o KAMON

21 mbox. kyoto-inet. or. jp hla-labo. org 360 1/3 20 NIMA HLA 6 3 HLA NIMA 2 HLA GVHD HLA 2, / NAT o KAMON

22 NIMA non-inherited maternal antigens IPA inherited paternal antigens HLA IPA NIMA NIMA NIMA NIMA HLA GVHD NIMA HLA HLA identical sibling 1/4 NIMA 1/4 availability o KAMON

23 IT o KAMON

MHC 2013; 20 ( 2 QC QC DNA-QC 3. QCWS 集会参加および参加証明書発行 QCWS QCWS QCWS 解析方法 DNA-QC Luminex SSO SSO SSP SBT QC FlowPRA Lab Screen WAK Flow ICFA 4 HL

MHC 2013; 20 ( 2 QC QC DNA-QC 3. QCWS 集会参加および参加証明書発行 QCWS QCWS QCWS 解析方法 DNA-QC Luminex SSO SSO SSP SBT QC FlowPRA Lab Screen WAK Flow ICFA 4 HL Major Histocompatibility Complex 2013; 20 (: 13 16 QCWS # 1. ワークショップの経過 24 1 QCWS HP QCWS 24 2 57 DNA-QC 53 QC 38 1 20 QCWS DNA-QC QC 4 QCWS 4 4 4 16 QCWS 5 21 57 DNA-QC 53 QC 37 5 6 7 HP 8 25 HP 2. QCWS