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りさこたなせ
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1 取得効率や X 線損傷を考慮したデータ収集例京都大学大学院理学研究科藤橋雅宏

2 話題 X 線による結晶の損傷データの取得効率を高めるために

3 X 線による結晶のダメージ Photon fluxが大きいほど損傷は大きい集光度が高いビームは大きな損傷を与えるこのような事を表す概念として放射線に関わる単位 Gyがある 1 Gy( グレイ ): 電離放射線により物質 1 kg につき 1 J の仕事に相当するエネルギーが与えられるときの吸収線量 Henderson limit Henderson R. (1990) in Proc. R. Soc. London Ser. B 241, pp 6 8. 凍結結晶がどのぐらいの X 線照射に耐えられるかの目安 20 MGy とされていますが個人的には数 MGy が限界と思います

4 20 MGy の吸収線量とは? 引用元ヒトは 10Gy( 10Sv) 程度全身被爆を受けると 99% 以上死亡すると言われています Henderson limit は 20 MGy なので結晶はヒトよりも数十万倍以上の放射線量に耐えることになります

5 吸収線量の計算法 Raddose 3D の利用が便利

6 吸収線量の計算法 Raddose 3D

7 吸収線量の計算法 Raddose 3D 入力項目 Job Title 内容計算によってはそれなりに時間が必要計算終了時にお知らせしてくれる Crystal Type 結晶の形 : 通常は cuboid Crystal Dimensions 結晶の縦 / 横 / 高さ (cuboid の場合 ) Pixels per micron 計算 mesh( 値が大きいほど細かい ) ビームサイズの 1/10 の逆数が目安 (50μm のビームなら 50/10=5 の逆数で 0.2) Absorption coefficient Average または Raddose Average で十分だが Raddose だと複雑な設定が出来る

8 吸収線量の計算法 Raddose 3D 入力項目 Beam Type Flux Energy Rectangular Collimation 内容 Gaussian または Top Hat PF は Top Hat (collimator でビームをカットしている ) ビームラインの情報参照波長から計算 (12.4 = E(keV) x λ(å) nvcalc.htm ビームサイズ Wedge Exposure Time Total の回転角 Total のビーム照射時間

9 KEK 構造生物学研究センター結晶構造解析用ビームラインの利用 (PX) 一覧と使用の比較のリンクから Photon Flux などビームライン依存の条件はこの表の値を使う

10 吸収線量計算結果 Raddose 3D Dose isosurfaces drawn at 0.1 MGy, 20 MGy and 30 MGy. NE3A で 0.3 x 0.3 x 0.3 mm の結晶に並進無し減衰無しで波長 1Å の光を 1 度あたり 10 秒照射し 180 度のデータを収集 (total 1800 秒照射 ) Average Dose (Whole Crystal): MGy Average Dose (Exposed Region): MGy Max Dose : MGy Dose Contrast (Max/Threshold Av.): 3.19 Used Volume: 70%

11 吸収線量計算結果 Raddose 3D Dose isosurfaces drawn at 0.1 MGy, 20 MGy and 30 MGy.

12 吸収線量計算結果の活用 Raddose 3D 結晶の損傷は吸収線量に依存するので照射時間に比例強度 (attenuator の透過率 ) に比例 NE3A で 0.3 x 0.3 x 0.3 mm の結晶に並進無し減衰無しで波長 1Å の光を 1 度あたり 10 秒照射し 180 度のデータを収集 (total 1800 秒照射 ) Max Dose MGy 1 度あたり 1 秒なら Max Dose 5.1 Mgy ( おおむね適切 )

13 吸収線量計算結果の活用 Raddose 3D ビームに対して結晶が大きければ照射位置を分散できる BL1A で 0.02 x 0.02 x 0.3 mm の結晶に並進減衰無しで波長 1.1Å, 0.02 mm x 0.02 mm の光を 1 度あたり 1 秒照射し 180 度のデータを収集 Max Dose 34.2 MGy 結晶は長さ 300μm なので幅 20 μm の光の 15 倍の長さ結晶を並進すると = 約 2.3 MGy もう少し耐えられそうなので = 約 4.6 MGy 並進しながら 1 度あたり 2 秒でデータ収集すると 4.6MGy になる

14 Dose 計算において波長変更は要注意同じ Photon Flux でも波長によって吸収率が異なるシンクロトロンの輝度は波長によって異なる Photon Flux (10 10 /sec) Beam 強度と波長の関係 Wavelength (Å) 波長を変更したら Raddose で再計算が必要

15 いわゆる Default 条件の Dose Beamline Condition Max Dose BL-1A BL-5A BL-17A AR-NW12A AR-NE3A 1 枚あたり : 0.2º, 0.2 sec (1º あたり 1 sec) Total: 180º (900 枚 ), 3 min Transparency 10%, Wavelength 1.1 Å 1 枚あたり : 1º, 5 sec (1º あたり 5 sec) Total: 180º (180 枚 ), 15 min Wavelength 1 Å 1 枚あたり : 0.2º, 0.2 sec (1º あたり 1 sec) Total: 180º (900 枚 ), 3 min Transparency 10%, Wavelength 0.98 Å 1 枚あたり : 1º, 2 sec (1º あたり 2 sec) Total: 180º (180 枚 ), 6 min Wavelength 1 Å 1 枚あたり : 0.2º, 0.2 sec (1º あたり 1 sec) Total: 180º (900 枚 ), 3 min Wavelength 1 Å 3.4 MGy 1.7 MGy 3.5 MGy 1.4MGy 5.3 MGy Beamsize はの Typical beam size の値で計算

16 どのぐらいの Dose が適切か? 2 倍のDoseで損傷は2 倍になる 2 倍のDoseでI/σ(I) は 2 倍にしかならない限度を超えて強くX 線を照射するのは損? 実験目的に応じた照射量が必要炭素窒素酸素の大まかな位置を知りたいドメイン間の位置関係を知りたい少々の損傷は許容? 高分解能で精細な分子構造を知りたい酸化還元に影響されやすい置換基等損傷の影響は大きい可能性

17 Relative B による損傷の見積もり HKL2000 の処理画面 B-factor が徐々に上昇

18 Relative B による損傷の見積もり HKL2000 の Intensity 補正式 I 補正後 = I 補正前この式から B factor と損傷の関係を見積もる scale: scale 因子, B: B-factor, d: 分解能 scale 因子一定と仮定すると反射強度は基準 ( 補正後 ) と比べて ex p 2 1 減衰している

19 Relative B による損傷の見積もり Resolution B-Factor 10.0A 7.0A 4.5A 4.0A 3.8A 3.6A 3.5A 3.4A 3.3A 3.2A 3.1A 3.0A 2.9A 分解能 B factor に対する ex p 2 1 の値 ( 減衰の度合い )

20 Relative B による損傷の見積もり Relative B 分解能 2.8A 2.7A 2.6A 2.5A 2.4A 2.3A 2.2A 2.1A 2.0A 1.9A 1.8A 1.7A 1.6A

21 Relative B による損傷の見積もり Relative B 分解能 1.55A 1.50A 1.45A 1.40A 1.35A 1.30A 1.25A 1.20A 1.15A 1.10A 1.05A 1.00A 0.95A 高分解能では小さな Relative B でも大きく影響する

22 XDS で処理した場合の relative B factor XDS で積分した後 Pointless -> Aimless で Scaling する Aimless の Intensity 補正式 I 補正前 = I 補正後 Chl: scale 因子, Shl: 非等方性の補正に関わる因子, B: B-factor, d: 分解能 HKL2000 の Intensity 補正式 I 補正後 = ex p 2 1 I 補正前 scale: scale 因子, B: B-factor, d: 分解能 B factor の式は同じ形だが Aimless では補正後の I に対する補正項なので損傷を受けると B は負の値になる

23 X 線による結晶の損傷データの取得効率を高めるために

24 データの効率的な収集法についてビームラインに入る前の計画が重要データ収集が早くなり自動処理も可能になった今ビームラインで考え込むようでは効率的な実験とは言えない悩んでいる間にビームラインによっては3 分でデータが撮れてしまうビームラインで悩まないよう予め計画を立てておくことが必要結晶交換ロボットの利用数十秒で結晶交換からループセンタリングまで完了するマニュアル交換ではなかなかここまで効率化できない自動処理 (Premo) の活用撮ったデータの統計値を自動で見積もってくれる

25 データ収集の下準備条件設定結晶のセンタリング手作業の入る余地が大きいループのセンタリングは自動で可能ループ内の結晶が見えるかが効率に大きく寄与する露光時間ビームの減衰率 Total Dose を決めれば簡単な計算で求められる予め標準的な条件の計算をしておきそれを基に比例計算

26 データ収集の下準備条件設定 1 枚あたりの振動角 Pilatus/Eiger の場合 shutterless 撮影を行えば 1 枚あたり振動角を小さくしても total の読み取り時間は伸びないどの程度の Dose なら許容されるか 1º あたりの露光量を下げて redundancy を稼ぐ 0º 180º 360º 540º 720º 900º 0 MGy 1 MGy 2 MGy 3 MGy 4 MGy 5 MGy どこまでのデータなら使えるか?

27 低露光データの重ね合わせ ( 天体写真の場合 ) 1 枚撮り 37 枚重ね合わせ処理撮影者 HUQ さん, 名古屋近郊 ( 名古屋駅まで約 12km) のマンションベランダより重ね合わせにより明らかにきれいな写真になる回折データ収集でも薄焼きのmergeは有効???

28 Redundancy 向上の効果 Data Dataset 1 Merge 1-3 Merge 1-6 Merge 1-10 Dose/position (MGy) Resolution (Å) (Outer Shell (Å)) Redundancy I/sigma(I) (1.91) (2.13) (2.16) (2.00) R sym (%) 5.5 (83.7) 5.9 (131.5) 6.1 (176.5) 6.6 (244.8) R meas (%) 6.0 (90.7) 6.0 (135.0) 6.1 (178.8) 6.7 (246.7) CC(1/2) 99.9(77.1) 100.0(82.8) 100.0(85.7) 100.0(81.8) Data 取得条件細長い結晶を用いて並進しながらデータを取得 1 結晶から同じ条件で 10 回測定ただし開始角は 18º ずつ移動させる

29 データの効率的な収集法についてビームラインに入る前の下準備実験計画は重要結晶交換ロボットの利用人が介在しなくてもデータ収集条件が決まるなら全自動測定が極めて有効

30 まとめ結晶の損傷についてビームの強さと集光度に依存 Raddose 3D の利用が便利吸収線量の目安は数 MGy 程度実際の値は結晶や実験目的による効率的なデータ収集事前の実験計画下準備が極めて重要結晶交換ロボットの利用データ収集条件を完全に事前設定できるなら全自動測定も有効

実験解析方法実験は全て BL41XU で行った初めに波長 0.5A 1.0A の条件化で適切な露光時間をそれぞれ決定した ( 表 1) 続いて同一の結晶を用いてそれぞれの波長を用いてデータを収集しそのデータの統計値を比較した ( 表 2) データの解析は HKL2000/Scalepack と

実験解析方法実験は全て BL41XU で行った初めに波長 0.5A 1.0A の条件化で適切な露光時間をそれぞれ決定した ( 表 1) 続いて同一の結晶を用いてそれぞれの波長を用いてデータを収集しそのデータの統計値を比較した ( 表 2) データの解析は HKL2000/Scalepack と課題名生体超分子チトクロム酸化酵素の高分解能 X 線構造解析課題番号 2006B1683 利用ビームライン BL41XU 大阪大学蛋白質研究所所属博士後期過程 2 年菅倫寛目的および背景生物は好気的条件下では呼吸によってエネルギーを得ているミトコンドリア内では ATP の合成が 40% 以上という極めて高いエネルギー変換効率で行われているチトクロム酸化酵素はミトコンドリア内の呼吸鎖末端に位置する巨大膜蛋白質で