新規アフィニティータグ アフィニティータグシステムは ペプチドタグとそれに対する抗体を用いて目的タンパク質を検出する技術です 既に実用化されているアフィニティータグとして DYKDDDDK 6 His c-myc HA V5 等が知られていますが 特異性 親和性 アプリケーションそしてランニングコス
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- いっけい しもね
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2 新規アフィニティータグ アフィニティータグシステムは ペプチドタグとそれに対する抗体を用いて目的タンパク質を検出する技術です 既に実用化されているアフィニティータグとして DYKDDDDK 6 His c-myc HA V5 等が知られていますが 特異性 親和性 アプリケーションそしてランニングコストといった点でそれぞれに長所と短所があるため 実験に応じて使い分ける必要がありました PA tagおよび TARGET tagは これらいずれの点においても非常に高い性能を持つ 日本発の新規アフィニティータグシステムです PA tagまたは TARGET tagを導入することで タンパク質精製 免疫細胞化学染色 フローサイトメトリー ELISAといった様々な実験での使用が可能です さらに PA tagおよび TARGET tagは 中性条件下 (ph6.0~8.0) でタグペプチドと抗体を解離できるというユニークな特長を持っており タンパク質精製実験におけるランニングコストの低減も可能です 本書では PA tagおよび TARGET tagの特長と 各種実験における使用方法 ポイントについて紹介します 目次 専用 website PA tag TARGET tag の概要 実験例 特長 1 タンパク質精製 6 既存のアフィニティータグとの比較表 1 ウエスタンブロット 9 PA tag System 2 免疫細胞化学染色 10 TARGET tag System 3 フローサイトメトリー 11 プラスミドベクターの設計について 4 表面プラズモン共鳴法 12 宿主の選択について 5 アフィニティータグラインアップ 13
3 強い結合力 = 低いKD(M) 抗 PA tag 抗体 -PA tag : KD (M)= ¹⁰ 抗 TARGET tag 抗体 -TARGET tag : KD (M)= ⁸ これらの結合力を利用して目的タンパク質を効率的に精製 検出することができます PA PA tag TARGET tagの概要 タグ タの特高い特異性抗 PA tag 抗体 抗 TARGET tag 抗体は高い特異性で抗原ペプチドに結合します PA tag TARGET tagの使用により従来のタグよりも目的タンパク質の精製純度 検出特異性を向上することができます TARGET tag 融合タンパク質を精製した例 TARGET tag もしくは DYKDDDDK tagを C 末端に融合した ProteinXをそれぞれの抗体ビーズで培養上清中から精製した例です 詳細はP.7 図 4をご覧ください Lane M: マーカー Lane 1: インプット Lane 2: フロースルー Lane 3: ペプチド溶出 Lane 4: ペプチド溶出後ビーズの酸溶出 (0.1M Glycine-HCl) 矢頭 : 目的タンパク質 低いランニングコスト動物細胞を用いてタンパク質を精製する場合 タンパク質回収のランニングコストが大きな問題となります His tag 融合タンパク質をニッケルカラム等で精製する場合 ランニングコストは低減できますが 培養上清など血清存在下では 精製量 純度が著しく低下します 抗 PA tag 抗体と抗 TARGET tag 抗体は中性条件下で抗体ビーズを再生できるため (40 回 60 回 ) ランニングコストを低く抑えることができます 既存のアフィニティータグとの性能比較表 アフィニティータグ PA TARGET 6xHis FLAG c-myc HA GST 配列 GVAMPGA EDDVV (YPGQ)₅V HHHHHH DYKDDDDK EQKLISEEDL YPYDVPDYA - 残基数 分子量 (kda) 等電点 (pi) リガンド レジン ( 抗体結合ビーズ ) 再利用法 モノクローナル抗体結合力 (KD(M)) モノクローナル抗体クローン No.( 免疫動物 ) 抗 PA tag 抗体 3M MgCl₂, MES (ph6.0) 4.9x10-¹⁰ NZ-1(Rat) 抗 TARGET tag 抗体 40% Propylene glycol, 1 TBS (ph7.5) 1.0x10 - ⁸ P20.1 (Mouse) 抗 His tag 抗体 Ni, Co, Zn, Cu 0.5M Imididazole (ph7.4) Ni-NTA: 1.0x10-⁵~⁶ HIS. H8 (Mouse) 抗 FLAG tag 抗体 Tris-HCl, Glycine Buffer (ph2~3.5) 抗 c-myc tag 抗体 Tris-HCl, Glycine Buffer (ph2~3.5) 抗 HA tag 抗体 Tris-HCl, Glycine Buffer (ph2~3.5) 2.8x10-⁸ 2.2x10-⁹ 2.8x10-⁹ M2(Mouse) 9E10(Mouse)3F10(Mouse) HA-7(Rat) 抗 GST tag 抗体 Glutathione Glutathione, Tris-HCl, Glycine Buffer (ph2~3.5) Glutathione: 1.0x10-⁵~⁶ 5A7 (Mouse) アフィニティー 組換えタンパク質精製コスト ペプチド溶出 Imidazole Glutathione 動物細胞外 ( 培地 ) タンパク質との非特異結合 動物細胞内タンパク質との非特異結合 本比較表は当社独自調査によるものです サンプル 検出方法および手法によって特異性が変化いたしますので 各アフィニティータグの性能を保証するものではございません 和光純薬工業では多数のアフィニティータグ関連製品を取り揃えています ラインアップは P.13 をご覧ください 詳しくはアフィニティータグシリーズパンフレットをご参照ください 1
4 PA タグ TARGET タグの特長PA tag System エピトープ配列 GVAMPGAEDDVV 抗体クローン No. NZ-1 ( ラットモノクローナル抗体 ) 使用実績タンパク質精製 免疫細胞染色 表面プラズモン共鳴法 ウエスタンブロット フローサイトメトリー ELISA ChIP 参考文献 1) Fujii, Y. et al., Protein Exp. Purif., 95, (2014). 2) Kato, Y. et al., Biochem. Biophys. Commun., 433, (2013). 3) Kaneko, MK. et al., Monoclon. Antib. Immunodiagn. Immunother., 32, (2013). 4) Liu, X. et al., Cancer Med., 2, (2013). 5) Ogasawara, S. et al., Monoclon. Antib. Immunodiagn. Immunother., 32, (2013). 6) Kato Kaneko, M. et al., Cancer Sci., 105, (2014). PA tag ラインアップ モノクローナル抗体 HRP 標識抗体 Anti PA tag, Monoclonal Antibody (NZ-1) Anti PA tag, Monoclonal Antibody (NZ-1) Peroxidase conjugated サブクラスクローン No. ラット IgG2a NZ-1 サブクラスクローン No. ラット IgG2a NZ-1 適応規格コード No. 容量希望納入価格 ( 円 ) IP, WB, FC, ICC 免疫化学用 μg 30, mg 98,000 適応規格コード No. 容量希望納入価格 ( 円 ) WB 免疫化学用 μl 45, ml 150,000 抗体結合アガロースビーズ Anti PA tag Antibody Beads ラット IgG2a NZ-1 サブクラスクローン No. 規格 コードNo. 容量 希望納入価格 ( 円 ) ml (Net 1ml) 65,000 免疫化学用 ml (Net 5ml) 250, ml (Net 25ml) 照会 タグペプチド 備考 規格 コードNo. 容量 希望納入価格 ( 円 ) mg 20,000 PA tag Peptide 含量 (HPLC) 95% 以上 遺伝子研究用 mg 80,000 洗浄溶液 備考規格コードNo. 容量希望納入価格 ( 円 ) PA tag Washing Solution フィルター滅菌済み遺伝子研究用 ml 12,000 Transient ベクター 選別マーカー 規格 コードNo. 容量 希望納入価格 ( 円 ) 大腸菌 動物細胞 pcag-ble PA tag-c Bleomycin 遺伝子研究用 μg 65,000 pcag-ble PA tag-n Signal Plus Bleomycin 遺伝子研究用 μg 65,000 pcag-bsd PA tag-c Blasticidin S 遺伝子研究用 μg 65,000 pcag-bsd PA tag-n Signal Plus Blasticidin S 遺伝子研究用 μg 65,000 pcag-hyg PA tag-c Hygromycin B 遺伝子研究用 μg 65,000 pcag-hyg PA tag-n Signal Plus Hygromycin B 遺伝子研究用 μg 65,000 pcag-neo PA tag-c Kanamycin G418 遺伝子研究用 μg 65,000 pcag-neo PA tag-n Signal Plus Kanamycin G418 遺伝子研究用 μg 65,000 pcag PA tag-n Signal Plus N 末タイプ : 細胞外分泌シグナル挿入済 pcag PA tag-c C 末タイプ SRα Promoter SRα Promoter SV40 PolyA MCS PA tag Secretory Signal Hygromycin B R SV40 PolyA PA tag MCS Hygromycin B R CAG Promoter 6,015bp puc ori CAG Promoter 5,958bp puc ori 2
5 エピトープ配列 (YPGQ)₅V 抗体クローン No. P20.1 ( マウスモノクローナル抗体 ) 使用実績タンパク質精製 ウエスタンブロット 表面プラズモン共鳴法 参考文献 1) Tabata, S. et al., J. Proteomics, 73 (9), (2010), 2) Nagae, M. et al., Acta Crystallogr. D., 64, (2008), 3) Nogi, T. et al,. Nature, 467, (2010), 4) Nishimasu, H. et al., Nature Struct. Mol. Biol., 18, (2011) TARGET tag ラインアップ 長TARGET tag System PA タグ TARGET タグの特モノクローナル抗体 Anti TARGET tag, Monoclonal Antibody (P20.1) サブクラスクローン No. マウス IgG1 P20.1 適応規格コードNo. 容量希望納入価格 ( 円 ) μl 30,000 IP, WB 免疫化学用 ml 98,000 HRP 標識抗体 抗体結合アガロースビーズ タグペプチド 洗浄溶液 Transient ベクター Episomal ベクター Anti TARGET tag, Monoclonal Antibody (P20.1) Peroxidase conjugated Anti TARGET tag Antibody Beads サブクラスクローン No. マウス IgG1 P20.1 マウス IgG1 P20.1 サブクラスクローン No. 適応規格コード No. 容量希望納入価格 ( 円 ) WB 免疫化学用 μl 45, ml 150,000 備考規格コード No. 容量希望納入価格 ( 円 ) TARGET tag Peptide 含量 (HPLC) 95% 以上遺伝子研究用 規格コード No. 容量希望納入価格 ( 円 ) 免疫化学用 ml (Net 1ml) 65, ml (Net 5ml) 250, ml (Net 25ml) 照会 mg 20, mg 80,000 備考規格コード No. 容量希望納入価格 ( 円 ) TARGET tag Washing Solution フィルター滅菌済み遺伝子研究用 ml 12,000 大腸菌 選別マーカー 動物細胞 規格コード No. 容量希望納入価格 ( 円 ) pcag-ble TARGET tag-c Bleomycin 遺伝子研究用 μg 65,000 pcag-ble TARGET tag-n Bleomycin 遺伝子研究用 μg 65,000 pcag-bsd TARGET tag-c Blasticidin S 遺伝子研究用 μg 65,000 pcag-bsd TARGET tag-n Blasticidin S 遺伝子研究用 μg 65,000 pcag-hyg TARGET tag-c Hygromycin B 遺伝子研究用 μg 65,000 pcag-hyg TARGET tag-n Hygromycin B 遺伝子研究用 μg 65,000 pcag-neo TARGET tag-c Kanamycin G418 遺伝子研究用 μg 65,000 pcag-neo TARGET tag-n Kanamycin G418 遺伝子研究用 μg 65,000 大腸菌 選別マーカー 動物細胞 規格コード No. 容量希望納入価格 ( 円 ) pebmulti-ble TARGET tag-c Bleomycin 遺伝子研究用 μg 65,000 pebmulti-ble TARGET tag-n Bleomycin 遺伝子研究用 μg 65,000 pebmulti-bsd TARGET tag-c Blasticidin S 遺伝子研究用 μg 65,000 pebmulti-bsd TARGET tag-n Blasticidin S 遺伝子研究用 μg 65,000 pebmulti-hyg TARGET tag-c Hygromycin B 遺伝子研究用 μg 65,000 pebmulti-hyg TARGET tag-n Hygromycin B 遺伝子研究用 μg 65,000 pebmulti-neo TARGET tag-c Kanamycin G418 遺伝子研究用 μg 65,000 pebmulti-neo TARGET tag-n Kanamycin G418 遺伝子研究用 μg 65,000 pebmulti-puro TARGET tag-c Ampicillin Puromycin 遺伝子研究用 μg 65,000 pebmulti-puro TARGET tag-n Ampicillin Puromycin 遺伝子研究用 μg 65,000 TARGET tag Transient ベクター TARGET tag Episomal ベクター C 末タイプ SV40 PolyA TARGET tag MCS SRα Promoter N 末タイプ Hygromycin B R SV40 PolyA MCS TARGET tag SRα Promoter Hygromycin B R C 末タイプ Hygromycin B R SRα Promoter puc ori TK Promoter EBNA1 N 末タイプ Hygromycin B R SRα Promoter puc ori TK Promoter EBNA1 CAG Promoter 6,014bp puc ori CAG Promoter 6,012bp puc ori SV40 PolyA TARGET tag MCS 11,097bp CAG Promoter orip SV40 PolyA MCS TARGET tag 11,089bp CAG Promoter orip 3
6 PA タグ TARGET タグの特長発現プラスミドの設計について エピトープタグの挿入位置 PA tag と TARGET tag は N 末端 C 末端いずれにも挿入することができます ( 図 1) N 末端または C 末端へのタグの挿入には PA tag もしくは TARGET tag の発現ベクターもご用意しています また PA tag は タンパク質のループ領域でよく見られる Ⅱ 型の β ターン構造を形成することが判明しており タンパク質のループ領域内に直接挿入してタンパク質精製に応用された実績もあります 目的タンパク質の構造や機能によりタグペプチドを N 末端や C 末端に融合したくない場合 PA tag のループ領域への融合をご検討ください M S F W M S F W Lane M: マーカー Lane S: 培養上清 Lane F: フロースルー Lane W: 洗浄画分 Lane 1~10: ペプチド溶出画分矢頭 : 目的タンパク質 Protein X (PA tag N 末融合型 ) Protein X (PA tag C 末融合型 ) ペプチド溶出 : 0.1 mg/ml PA tag ペプチド データ提供 : 大阪大学蛋白質研究所附属蛋白質解析先端研究センター分子創製学研究室高木淳一先生 東北大学大学院医学系研究科地域イノベーション分野藤井勇樹先生 図 1. HEK293T の培養上清から PA tag を用いてアフィニティー精製を行った例 Protein X (PA tag N 末融合型 ) および Protein X (PA tag C 末融合型 ) を HEK293T 細胞の培養上清からアフィニティー精製した例です トランスフェクション後 48~72 時間後の培養上清 420 ml に抗 PA タグ抗体ビーズ 8 ml (Net 4 ml) を加え 2 時間 2-4 でインキュベートします 抗体ビーズの 4 倍量の TBS (20 mm Tris-HCl 150 mm NaCl) で 5 回洗浄し その後抗体ビーズと等量の PA tag ペプチド (0.1 mg/ml) を 10 回添加して溶出しています PA tag の挿入位置に依存することなく目的タンパク質を高純度かつ効率的に精製できています 目的タンパク質を細胞外に分泌させる PA tag シリーズの pcag PA tag-n Signal Plus はマルチクローニングサイトの 5 末端側に細胞外分泌シグナルをコードする遺伝子を組み込んでいるため 目的タンパク質を培地中に分泌させることが可能です 安定発現株を樹立する TARGET tag シリーズでは Episomal 型ベクター pebmulti ベクターをご用意しています pebmulti ベクターを用いることにより目的タンパク質を長期的に発現する細胞を容易に樹立することが可能です pebmultiベクターとは? TARGET tagシリーズには 一過性発現用の pcagベクターに加え Episomal 型安定発現用のpEBMulti ベクターもご用意しています pebmultiベクターは霊長類 ( ヒト サル ) やイヌなどの導入細胞内でホストゲノム DNAへの組込みなしに 安定的に複製 維持され 目的遺伝子を長期間発現させることが可能なベクターです 目的タンパク質を高発現する安定発現株樹立及び複数の遺伝子導入が容易になりますので ご検討ください pebmulti EBNA1 タンパク質 orip を介した染色体とベクターの結合 染色体 目的遺伝子 図 2. pebmultiベクターを用いた簡易的安定発現株の樹立細胞内に取り込まれた pebmultiベクターは EBNA1タンパク質を介して配列内の oripと染色体を結合させます 染色体と結合したベクターは細胞分裂時に染色体と共に複製され娘細胞へ分配されます これにより 遺伝子をゲノムへ組込むことなく簡易的に細胞を安定発現株状態にできます 4
7 動物細胞 PA tagまたは TARGET tagの発現ベクターを使用することにより 動物細胞 (HEK293, HEK293T, CHOなど ) でPA tagまたは TARGET tag 融合タンパク質を発現できます PA tagは ヒトポドプラニンの PLAG 領域内の配列を使用しているため HEK293 COS-1 COS-7といったポドプラニンを発現する細胞株で作製したライセートを用いて抗 PAタグ抗体でウエスタンブロットを行った場合 わずかに 37 kda 付近に内在性のポドプラニンのバンドが現れます ポドプラニンは膜タンパク質であり分泌や切断が起こらないため 目的タンパク質を分泌させて精製する場合には全く問題ありません また ポドプラニンはライセート中において抗 PA tag 抗体によりキャプチャーされないことから 細胞膜タンパク質や細胞内タンパク質も精製できます 抗 PA tag 抗体は 霊長類以外のポドプラニンは認識しないため げっ歯類由来の細胞株においては問題なく使用できます PA タグ TARGET タグの特長宿主の選択について 大腸菌 昆虫細胞 大腸菌や昆虫細胞など動物細胞以外の宿主を用いたタンパク質発現系においても PA tag TARGET tag を使用することが可能です ただし 弊社から販売しているベクターは動物細胞でのタンパク質発現用に設計しているため 大腸菌や昆虫細胞をご使用の場合には 専用のベクターにタグ配列を組み込んでいただく必要があります 使用実績のある細胞種 TARGET tag : HEK293 (Human embryonic kidney) HEK293T CHO(Chinese hamster ovary) E. coli BL21 (DE3) 昆虫細胞 (SF+, Sf9, Sf21, High Five) PA tag : HEK293 HEK293T CHO U-2 OS (Human osteosarcoma) E. coli BL21 (DE3) 昆虫細胞 (SF+, Sf9, Sf21, High Five) 抗 PA tag 抗体ビーズによる精製 抗 TARGET tag 抗体ビーズによる精製 図 3. 大腸菌を用いた発現系で PA tag システム TARGET tag システムを使用した例 大腸菌で発現させた PA tag TARGET tag 融合タンパク質を精製し 質量分析により解析した例です 大腸菌を用いたタンパク質発現系においても PA tag TARGET tag でタンパク質を高純度で精製することが可能です データ提供 : 大阪大学蛋白質研究所附属蛋白質解析先端研究センター分子創製学研究室高木淳一先生 東北大学大学院医学系研究科地域イノベーション分野藤井勇樹先生 5
8 実験例Ⅰ6 実験例 Ⅰ タンパク質精製 動物細胞発現系でタンパク質を精製する場合 目的タンパク質の精製量と純度が大きな問題になります PA tag と TARGET tag は 既存のアフィニティータグに比べて特異性と親和性が高いことから ワンステップで目的タンパク質を高純度に大量精製することが可能です (Fujii et al., 2014; Tabata et al., 2010) さらに 免疫沈降後の抗体ビーズが中性条件下 (ph6.0~8.0) で再生できるため 抗体ビーズを繰り返し使用することができ 免疫沈降によるタンパク質精製のランニングコストを大幅に低減できます ここでは 動物細胞発現系を用いたタンパク質精製方法 抗体ビーズの再生方法など 実験のポイントについて紹介します 実験方法 細胞膜タンパク質 細胞内タンパク質の精製 ❶ 目的遺伝子をトランスフェクションした培養細胞を 37 5 %CO₂ 条件下で約 24~72 時間培養する ❷ シャーレを氷上に移し 細胞の培地をアスピレーターで吸引する ❸ 冷えた PBS をシャーレに添加する ❹ アスピレーターで PBS を吸引する ❸-❹ の操作を 3~5 回行う ❺ セルスクレイパーもしくは 0.5 mm EDTA を含む PBS を用いて細胞をチューブに回収する ❻1,000 rpm で 5 分間遠心し PBS を除去する ❼ タンパク質抽出バッファーを添加し ピペッティングやタッピングで混和して 5 分 ~30 分氷上で静置する ❽15,000 rpm で 15 分間遠心し 上清 ( 細胞ライセート ) を回収する ❾ 細胞ライセートの 1/50~1/100 量 (net) の抗体結合ビーズを加え 4 で 2 時間ゆっくりと混和しながらインキュベートする ❿ タンパク質抽出バッファーを用いて抗体結合ビーズを 3~5 回洗浄する ⓫TBS に希釈したタグペプチド溶液 (0.1 mg/ml) を抗体結合ビーズの等量添加し 溶出されたタンパク質を回収する この操作を 10 回繰り返すことにより 9 割以上のタンパク質を回収できる 分泌タンパク質の精製 ❶ 目的遺伝子をトランスフェクションした培養細胞を 37 5 %CO₂ 条件下で約 72 時間培養する ❷ 培養上清をチューブに回収する ❸8,000 rpm で 20 分間遠心する ❹1 M Tris-HCl (ph8.0) を終濃度 10 mm となるように培地に添加して中和させる ❺ 孔径約 0.45μm のフィルターに培養培地を通し 夾雑物を除去する ❻ 培養上清の 1/50~1/100 量の抗体結合ビーズを加え 4 で 2 時間ゆっくりと混和する ❼ 目的タンパク質をキャプチャーさせた抗体結合ビーズをタンパク質上清ごとオープンカラムへ移す この時 抗体結合ビーズの取りこぼしがないように数回フロースルー液でチューブを洗う ❽ 抗体ビーズの 4 倍量の TBS 溶液を加え 抗体結合ビーズを洗浄する この操作を 3 5 回繰り返す ❾TBS に希釈したタグペプチド溶液 (0.1 mg/ml) を抗体ビーズの等量添加し 溶出されたタンパク質を回収する この操作を 10 回繰り返すことにより 9 割以上のタンパク質を回収できる タグ配列を除去する TEVプロテアーゼ 認識配列 :Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln- -Gly(Glnと Glyの間を切断 ) Turbo3Cプロテアーゼ 認識配列 :Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln- -Gly-Pro(Glnと Glyの間を切断 ) コード No. 規格容量希望納入価格 ( 円 ) TEV Protease, recombinant 遺伝子研究用 2,500 units 35, Turbo3C Protease, recombinant, Solution 遺伝子研究用 1 mg 45,000
9 図 4. 培養上清から TARGET tag 融合タンパク質を精製した例 TARGET tag もしくは DYKDDDDK tagをc 末端に融合した ProteinXをそれぞれの抗体結合ビーズで培養上清中から精製した例です 培養 7 日目の培養上清 10 mlを回収し そこに抗体結合ビーズ 0.1 ml (net 0.05ml) を加えて 4 で2 時間インキュベートしました その後 0.2 mg/mlのタグペプチドを添加し 4 で30 分間反応させて溶出しています さらに ペプチド溶出後の抗体結合ビーズに 0.1 M Glycine-HCl (ph 2.7) を添加し 室温で 5 分間反応させて残存タンパク質を確認しました 各サンプルを SDS-PAGEで分離し 銀染色を行いました 従来タグと比較して ペプチド溶出による目的タンパク質画分に含まれるバックグラウンドを低減させることができ 高純度のタンパク質が得られました PA tag と TARGET tag は 専用の洗浄溶液を用いることにより 中性条件下 (ph6.0~8.0) で 免疫沈降後の抗体からタグペプチドを除去して抗体結合ビーズを再生することが可能です 通常 抗体結合ビーズの再生には酸性バッファー (ph ) が用いられますが 酸性バッファーは抗体にダメージを与えるため 再生の繰り返しによりタンパク質精製効率が低下します PA tag と TARGET tag の結合ビーズは 中性条件下でそれぞれ 60 回 40 回再生でき タンパク質精製効率が低下しないことを確認しています ただし 洗浄溶液で完全に抗体からタグペプチドを除去できない場合もありますので 異なるタンパク質を精製する場合にはコンタミネーションに注意してください 抗体結合ビーズの再生方法 ❶ 抗体ビーズの量に対し 10 倍量の洗浄溶液を加え 室温で 10 分間ゆっくりと混和する ❷ 洗浄溶液を交換しながらこの操作を 3 回繰り返す ❸TBS でよく洗浄する 実験のポイント Lane M: マーカー Lane 1: インプット Lane 2: フロースルー Lane 3: ペプチド溶出 Lane 4: ペプチド溶出後ビーズの酸溶出 (0.1M Glycine-HCl) 矢頭 : 目的タンパク質 TARGET tag 融合タンパク質をキャプチャーした抗体結合ビーズの洗浄 TARGET tag は抗体とタグペプチドの解離速度が速いため 目的タンパク質をキャプチャーした抗体結合ビーズを洗浄する際はバッファーをゆっくりと添加してください バッファーを激しく添加した場合 タンパク質の収量が低下する可能性があります PA tag 融合タンパク質の溶出 PA tag は抗体とタグペプチドの解離速度が遅いため タグペプチドを用いて競合溶出を行う際は毎回タグペプチド溶液を染み込ませた状態で 5 分間以上インキュベートすることが必要です フラクションごとにインキュベーションせずに連続的に溶出を行った場合 低濃度の目的タンパク質が広範囲にわたって溶出されることがあります 実験例Ⅰ抗体結合ビーズの再生 7
10 実験例Ⅰ8 バックグラウンドの低減方法 PA tag では 高濃度の NaCl (0.15~1.0 M) を含む TBS 溶液で前洗浄を行うことにより夾雑物を除去することが可能です kda Wash Protein Z (c-pa tag) 図 5. 高濃度の NaCl を含む TBS 溶液での前洗浄によりバックグラウンドを低減した例 X 線結晶構造解析のサンプル調製 Elution M I P M NaCl 0.5M NaCl 1.0M NaCl X 線結晶構造解析を行う場合 高純度のタンパク質を大量に精製する必要があります 通常 タンパク質の純度を上げるためには複数のカラム手法を組み合わせる必要があります また 必要量のタンパク質を得るために精製を繰り返さなければなりません ワンステップで目的タンパク質を高い純度で大量に精製することが可能な PA tag と TARGET tag は X 線結晶構造解析のサンプル調整に有効なツールです 図 6. TARGET tag システムを用いて X 線結晶構造解析用のサンプル調整が行われた例 1Spondin 1 Nagae, M. et al., Acta Crystallogr. D., 64, (2008) 2Sema6A-Plexin A2 複合体 (TARGET tag システムは Plexin A2 の精製に使用 ) Nogi, T. et al,. Nature, 467, (2010) 3ENPP1 Kato K et al., Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun., 68, (2012) Kato K et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 109 (42), (2012) 4ENPP2 Nishimasu, H. et al., Nature Struct. Mol. Biol., 18, (2011) Kato K et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 109 (42), (2012) M: Marker I: input 100ng 分 P: 精製前サンプル 1: wash 画分 1 2: wash 画分 2 3: wash 画分 3 4: wash 画分 4 5: wash 画分 5 6: wash 画分 6 7: wash 画分 7 8: wash 画分 8 9: wash 画分 9 10: 酸溶出分画 1 11: 酸溶出分画 2 12: 酸溶出分画 3 13: 酸溶出分画 4 14: 酸溶出分画 5 1) 20ml の昆虫細胞の細胞溶解液に 1.0mg/l になるように精製した Protein Z-PA を添加後 抗 PA タグ抗体ビーズ 200μl(net 100μl) を添加し 4 3hr 撹拌しました 2) 塩濃度が異なる TBS 溶液 ( 各 0.15M, 0.5M, 1.0M NaCl) をそれぞれ調整し ビーズの 50 倍量を用いて洗浄操作 (9 回 ) を行いました 3) 回収した各ビーズに 0.1M Glycine-HCl (ph2.7) を 0.5ml 添加し 室温で 5min 穏やかに振とうし 溶出を行いました 4) 遠心分離後 上清を回収し 1M Tris-HCl (ph9.0) で中和処理を行いました 3),4) を 5 回繰り返しました 5) 各サンプルを用いて SDS-PAGE 後に銀染色を行い 塩濃度の違いによる夾雑タンパク質除去結果を比較しました 高濃度の NaCl を含む TBS 溶液で前洗浄を行うことにより バックグラウンドを低減できました 1Spondin 2Semaphorin6A-PlexinA2 複合体 3ENPP1 4ENPP2 データ提供 : 大阪大学蛋白質研究所附属蛋白質解析先端研究センター分子創製学研究室高木淳一先生 東北大学大学院医学系研究科地域イノベーション分野藤井勇樹先生
11 実験例 Ⅱ ウエスタンブロット PA tag TARGET tag は ウエスタンブロットにも使用可能です PA tag TARGET tag 共に高い親和性を有しているため 目的タンパク質を高感度で検出することができます また 特異性も高いため バックグラウンドを低減することが可能です ここでは PA tag および TARGET tag を用いたウエスタンブロット法について紹介します 実験例 ❶ 適量のサンプルに SDS-PAGE サンプルバッファーを加え 95 で 5 分間煮沸する ❷SDS-PAGE 用ポリアクリルアミドゲルにサンプルをアプライし 泳動する ❸SDS-PAGE で分離したタンパク質を SDS-PAGE 用ポリアクリルアミドゲルからメンブレンに転写する ❹5 % スキムミルクを含む TBS-T (ph8.0) を用いてブロッキングを行う ブロッキング溶液でメンブレンを浸し 室温で 15 分間振盪する ❺TBS-T (ph8.0) に交換して 5 分間振盪し 洗浄を行う この操作を 4 回繰り返す ❻HRP 標識抗体を 1μg/ml となるように TBS-T (ph8.0) で希釈して添加し 室温で 1 時間振盪する ❼TBS-T (ph8.0) に交換して 5 分間振盪し 洗浄を行う この操作を 4 回繰り返す ❽HRP 検出用発光試薬を用いて検出する 一次抗体反応時間の短縮 Lane 1 一次抗体 : 抗 IDH1 抗体 (RcMab-1), 1μg/ml 二次抗体 : 抗ラット IgG-HRP 標識, 1000 倍希釈 Lane 2 一次抗体 : 抗 PAタグ抗体, 1μg/ml 二次抗体 : 抗ラット IgG-HRP 標識, 1000 倍希釈 Lane 3 一次抗体 : 抗 DYKDDDDKタグ抗体, 3.5μg/ml 二次抗体 : 抗マウス IgG-HRP 標識, 1000 倍希釈サンプル量 : 各 10μg 露光時間 : 10 分 図 7. PAタグ / 抗 PA tag 抗体 (NZ-1) を用いたウエスタンブロットの例 C 端末側にDYKDDDDK タグと PAタグをタンデムに付加したイソクエン酸脱水素酵素 /IDH1(IDH1-PA-DYK) を骨肉腫細胞株で発現させ その細胞のライセートをサンプルとし SDS-PAGEを行った後 各抗体を用いてウエスタンブロットにて検出しました 抗 PA tagラットモノクロナール抗体 (NZ-1) は抗 DYKDDDDK tag 抗体よりも高い感度 特異性で検出できました 抗 PA tag 抗体 (NZ-1) を1 次抗体として使用した場合のIncubation time (min) PA tag は 抗 PA tag 抗体 (NZ-1) を一次抗体として用いた場合 わずか 5 分間の抗体反応を行うだけで目的タンパク質を高感度で検出できます 図 8. 抗 PA tag 抗体のインキュベーション時間の検討結果 一次抗体に 1μg/ml 抗 PA tag 抗体を 二次抗体に抗ラット IgG HRP 標識を用いて一次抗体のインキュベーション時間の検討を行った結果です 1 分程度のインキュベーション時間でも明確なバンドを確認することができ 5 分程度のインキュベーション時間でバンドの濃さは既に飽和していることが確認できました データ提供 : 東北大学大学院医学系研究科地域イノベーション分野加藤幸成先生, 金子美華先生 サンプル : IDH-PA-DYKDDDDK 抗 PA tag 抗体 (NZ-1) を一次抗体として使用 データ提供 : 東北大学大学院医学系研究科地域イノベーション分野加藤幸成先生, 金子美華先生 一次抗体反応時間わずか 5 分!( 通常 60 分 ) 実験例Ⅱ実験のポイント 9
12 実験例 Ⅲ 免疫細胞化学染色 PA tag は免疫細胞化学染色に使用できます PA tag が有する特異性 結合力により 目的タンパク質を高感度で特異的に検出できます ペプチドタグに塩基性アミノ酸のリジンやアルギニンを含まないため ホルマリンやパラホルムアルデヒドの影響を受けにくいです ここでは PA tag を用いた免疫細胞化学染色の例を紹介します 実験例 ❶ トランスフェクションから 24~48 時間後に培養細胞を 3.7 % ホルムアルデヒドを含む PBS で処理し 10~30 分程度静置する ❷PBS で 3 回洗浄する ❸0.1 %Triton X を含む PBS で処理し 10 分間静置する ❹1 % ヤギ血清 0.1 %Triton X を含む PBS を細胞に添加し 30 分 ~1 時間静置する - ブロッキング ❺ 抗 PA tag 抗体 (1μg/mL) を 1 % ヤギ血清 0.1 %Triton X を含む PBS で希釈し 細胞に添加して 1 時間静置する ❻2 次抗体 ( 抗ラット IgG 抗体 ) を 1 % ヤギ血清 0.1 %Triton X を含む PBS で希釈し 細胞に添加して 1 時間静置する 2 次抗体の希釈倍率は製品説明書に記載された数値を参考にする 蛍光二次抗体を使用する場合はアルミホイル等を用いて遮光する ❼PBS を用いて 3 回洗浄する ❽ 蛍光顕微鏡を用いて観察する 10 実験例Ⅲ実験のポイント 図 9. PAタグシステムを免疫細胞化学染色に使用した例 IDH2-PAを発現した CHO-K1 細胞を抗 PA tag 抗体により検出しました 抗 PA tag 抗体 (1μ g/ ml) を30 分間反応させ その後 Alexa488 標識抗ラット IgG 抗体を30 分間反応させ 蛍光顕微鏡で検出しました 緑 :IDH2-PA 青 :DAPI データ提供 : 東北大学大学院医学系研究科地域イノベーション分野加藤幸成先生 発現細胞の選択抗 PA tag 抗体は HEK293 COS-1 COS-7 といった細胞株の内在性のポドプラニンに反応します 霊長類由来の細胞株の免疫細胞染色に PA tag システムを使用する場合は ポドプラニンの発現が認められない細胞株を使用してください 霊長類以外のポドプラニンには抗 PA tag 抗体は反応しないため CHO 細胞などのげっ歯類由来の細胞株は使用可能です 二次抗体で検出する Jackson 社では 高品質な二次抗体を多数取り揃えています カタログをご用意しております 弊社営業員もしくは販売代理店までお申し付け下さい
13 PA tag は 生細胞条件下で抗体を反応させることも可能です この特長を利用しフローサイトメトリーを行った例を紹介します 実験例 ❶ 細胞をチューブに回収し 5%FCS を含む DMEM で再懸濁する ❷5%FCS を含む DMEM に抗 PA tag 抗体を加え 細胞に添加する 濃度の目安は μg/ml ❸30 分間氷上でインキュベートする ❹PBS で細胞を洗浄する (1 回 ) ❺ フローサイトメーターで解析する Control タグ抗体を標識する同仁化学 Labeling Kitを使用してタグ抗体を標識することができます Labeling Kitは活性化試薬とフィルトレーションチューブにより 抗体等を簡単に標識するためのキットです 前処理 反応 精製まで全て 1つのフィルトレーションチューブで行うことができ 3 時間以内に標識体が得られます Peroxidase Labeling Kit-NH2 メーカーコード No. 容量希望納入価格 ( 円 ) 回用 17,600 Peroxidase Labeling Kit-SH 回用 17,600 Biotin Labeling Kit-NH 回用 12,400 Biotin Labeling Kit-SH 回用 12,400 Fluorescein Labeling Kit-NH 回用 21,600 HiLyte Fluor 555 Labeling Kit-NH 回用 21,600 同仁化学 HiLyte Fluor 647 Labeling Kit-NH 回用 21,600 HiLyte Fluor 750 Labeling Kit-NH 回用 49,000 ICG Labeling Kit-NH2 抗 PA tag 抗体 図 10. PA tag をフローサイトメトリーに応用した例 抗 PA tag 抗体を用いて PA- ラビットポドプラニンを発現した CHO-K1 細胞をフローサイトメトリーにより検出しました 細胞に抗 PA tag 抗体を 30 分間反応させ その後 Oregon Green 標識抗ラット IgG 抗体を 30 分間反応させました ( 抗 PA tag 抗体はラビットポドプラニンは認識しません ) データ提供 : 東北大学大学院医学系研究科地域イノベーション分野加藤幸成先生 プロトコルもご用意しております ご請求下さい 回用 20, 回用 46,400 Allophycocyanin Labeling Kit-NH 回用 44,200 R-Phycoerythrin Labeling Kit-NH 回用 44,200 実験例 Ⅳ フローサイトメトリー実験例Ⅳ11
14 実験例Ⅴ12 実験例 Ⅴ 表面プラズモン共鳴 (SPR) 法への応用 タンパク質精製に安定発現株を使用する場合 発現量が多い細胞株を選別することが必要です 表面プラズモン共鳴法 (SPR 法 ) は 相互作用を調べたいタンパク質の一方をセンサーチップに固定化し もう一方のタンパク質を液相に流してその結合と解離をセンサーチップ表面の質量変化として検出する技術です 分子間相互作用をリアルタイムに計測する技術を使用することにより 目的タンパク質の発現量が多い細胞株をスクリーニングすることが可能です ここでは PA tag 融合タンパク質 TARGET tag 融合タンパク質を SPR 法により検出する方法を紹介します 実験例 ❶ カルボキシメチルデキストラン薄膜でコーティングされたセンサーチップを用意する ❷ ランニングバッファーを流す ❸N- ヒドロキシスクシンイミドと N- エチル -N - (3 - ジメチルアミノプロピル ) カルボジイミドを等量で混合した溶液をインジェクトする ( カルボキシメチル基の活性化 ) ❹ 抗体を希釈した溶液をインジェクトする ( カップリング反応により抗体をセンサーチップに固定化 ) ❺ メタノールアミンをインジェクトする ( 残存する活性基の不活性化 ) ❻ ランニングバッファーで希釈した目的タンパク質をインジェクトする ❼ インジェクション終了後 3 分間解離させる センサーチップに固定化する抗体量 インジェクトを行うタンパク質量 流量 流速 バッファー組成は使用する機器に適したものを選んでください 図 11. PA タグシステムを表面プラズモン共鳴法に使用した例 センサーチップに抗 PA タグ抗体を固定化し その後 PA tag 融合 T4L を 10 nm ( 赤 ) 3 nm ( 青 ) 1 nm ( 緑 ) でインジェクトした例です データ提供 : 大阪大学蛋白質研究所附属蛋白質解析先端研究センター分子創製学研究室高木淳一先生 東北大学大学院医学系研究科地域イノベーション分野藤井勇樹先生 実験のポイント SPR 法では 一度センサーチップに固定化した抗体を繰り返して使用することが望まれます PA tag や TARGET tag を用いた SPR 法では 洗浄溶液をインジェクトしてセンサーチップに固定した抗体から目的タンパク質を解離できるため 一度センサーチップに固定化した抗体で細胞株のスクリーニングを繰り返すことが可能です 参考文献 "A rapid screening method for cell lines producing singly-tagged recombinant proteins using the" TARGET tag" system." Tabata S. et al., J. Proteomics, 73(9): (2010) "PA tag: A versatile protein tagging system using a super high affinity antibody against a dodecapeptide derived from human podoplanin." Fujii, Y. et al., Protein Exp. Purif.,95, (2014). 藤井ら,. 新規アフィニティータグシステム "PA タグ " の利用法 ~ 蛋白質の精製および検出 ~. 蛋白質科学会アーカイブ, 7, e075 (2014)
15 アフィニティータグラインアップ tag 6xHis tag GFP tag HA tag c-myc tag GST tag V5 tag MBP tag コードNo. 容量 希望納入価格 ( 円 ) μg 24,000 Anti DYKDDDDK tag,monoclonal Antibody mg 48, mg 77,000 Anti DYKDDDDK tag,monoclonal Antibody,Rat μg 40,000 Anti DYKDDDDK tag,monoclonal Antibody, μl 45,000 Peroxidase Conjugated ml 95, ml (Net 1ml) 48,000 Anti DYKDDDDK tag Antibody Beads ml (Net 5ml) 90, ml (Net 25ml) 290,000 Anti DYKDDDDK tag Antibody Magnetic Beads ml 50, mlx5 200,000 DYKDDDDK Peptide mg 18, mg 80,000 Anti 6xHistidine,Monoclonal Antibody(9F2) μg 30, mg 65,000 Anti 6xHistidine,Monoclonal Antibody(9C11) μg 40, mg 65,000 Anti 6xHistidine,Monoclonal Antibody(21-48) μg 35, mg 95,000 Anti 6xHistidine,Monoclonal Antibody (28-75) μg 40, mg 95,000 Anti 6xHistidine,Monoclonal Antibody(9F2), μl 36,000 Peroxidase Conjugated μl 75,000 Anti 6xHistidine,Monoclonal Antibody(9C11), μl 45,000 Peroxidase Conjugated μl 75,000 Anti 6xHistidine Antibody (28-75) Beads ml (Net 1ml) 65, ml (Net 5ml) 200,000 6xHistidine Peptide mg 20, mg 80,000 Anti Green Fluorescent Protein,Monoclonal Antibody(mFX73) μl 30,000 Anti Green Fluorescent Protein,Monoclonal Antibody(mFX75) μl 30,000 Anti Green Fluorescent Protein,Rabbit Polyclonal IS μg 45,000 Anti Hemaggluthin,Monoclonal Antibody μg 30, mg 66,000 Anti Hemagglutinin,Monoclonal Antibody, μl 33,000 Peroxidase Conjugated μl 75,000 Anti HA Antibody Beads ml (Net 1ml) 65, ml (Net 5ml) 150,000 HA Peptide mg 30,000 Anti c-myc,monoclonal Antibody μg 30, mg 66,000 Anti c-myc, Monoclonal Antibody, Peroxidase μl 33,000 Conjugated μl 75,000 c-myc Peptide mg 25, mg 100,000 Anti Glutathione S-transferase, μg 30,000 Monoclonal Antibody mg 66,000 Anti Glutathione S-transferse,Monoclonal μl 33,000 Antibody, Peroxidase Conjugated μl 75,000 Anti V5 tag,monoclonal Antibody (6F5) μg 35, mg 65,000 Anti V5 tag, Monoclonal Antibody(6F5), Peroxidase Conjugated μl 35,000 Anti V5 tag Antibody Beads ml (Net 1ml) 65, ml (Net 5ml) 150,000 Anti MBP,Monoclonal Antibody μg 30,000 DYKDDDDK 関連製品一覧13
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プロトコール集 ( 研究用試薬 ) < 目次 > 免疫組織染色手順 ( 前処理なし ) p2 免疫組織染色手順 ( マイクロウェーブ前処理 ) p3 免疫組織染色手順 ( オートクレーブ前処理 ) p4 免疫組織染色手順 ( トリプシン前処理 ) p5 免疫組織染色手順 ( ギ酸処理 ) p6 免疫
< 目次 > 免疫組織染色手順 ( 前処理なし ) p2 免疫組織染色手順 ( マイクロウェーブ前処理 ) p3 免疫組織染色手順 ( オートクレーブ前処理 ) p4 免疫組織染色手順 ( トリプシン前処理 ) p5 免疫組織染色手順 ( ギ酸処理 ) p6 免疫組織染色手順 ( ギ酸処理後 マイクロウェーブまたはオートクレーブ処理 )p7 抗原ペプチドによる抗体吸収試験 p8 ウエスタン ブロッティング
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ChIP Reagents ~ クロマチン免疫沈降 (ChIP) 法用ストック溶液セット ~ マニュアル ( 第 1 版 ) Code No. 318-07131 NIPPON GENE CO., LTD. 目次 Ⅰ 製品説明 1 Ⅱ セット内容 1 Ⅲ 保存 2 Ⅳ 使用上の注意 2 Ⅴ 使用例 2 < 本品以外に必要な試薬 機器など> 2 1) 磁気ビーズと一次抗体の反応 3 2)-1 細胞の調製
<4D F736F F D B82C982C282A282C482512E646F63>
サンプル条件および固定化分子の選択 Biacoreの実験ではセンサーチップに固定化する分子をリガンド それに対して結合を測定する分子をアナライトと呼びます いずれの分子をリガンドとし アナライトとするかは 実験系を構築する上で重要です 以下にサンプルに適したリガンド アナライトの設計方法やサンプルの必要条件などをご紹介します アナライト リガンド センサーチップ (1) タンパク質リガンドとしてもアナライトとしても用いることができます
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ISSN 1347-4804 January 2009 Vol.77 No.1 2 6 10 13 16 29 18 18 20 20 32 21 22 23 27 5 9 12 17 23 24 25 26 26 27 28 4 28 36 1 Research 2 Vol.77, No.12009 Vol.77, No.12009 3 4 Vol.77, No.12009 P roducts Vol.77,
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組織からのゲノム DNA 抽出キット Tissue Genomic DNA Extraction Mini Kit 目次基本データ 3 キットの内容 3 重要事項 4 操作 4 サンプル別プロトコール 7 トラブルシューティング 9 * 本製品は研究用です * 2 本キットは動物の組織からトータル DNA を迅速に効率よく抽出するようにデザインされています また 細菌 固定組織 酵母用のプロトコールも用意しています
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蛍光色素を標識したい 利用製品 < 少量抗体 (0μg) 標識用 > ICG Labeling Kit- H [LK] - アミノ基標識用 - R-Phycoerythrin Labeling Kit - H [LK] Ab-0 Rapid Labeling Kit [LK] Allophycocyanin Labeling Kit- H [LK] Ab-0 Rapid HiLyte Fluor TM
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140-0002 東京都品川区東品川 2-2-24 天王洲セントラルタワー 4F Tel: (03) 5796-7330 Fax: (03) 5796-7335 e-mail: sialjpts@sial.com FLAG Tagged Protein Immunoprecipitation Kit (FLAG 融合タンパクタンパク質免疫沈降免疫沈降キット ) 製品番号 FLAGIPT-1 TECHNICAL
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アフィニティービーズのご紹介 住友ベークライト株式会社 S- バイオ事業部 - 1 - 製品概要 生体分子 ( タンパク質や核酸など ) のアプリケーションに幅広く対応できるアフィニティ精製用担体 ( 球状ビーズ ) です ビーズ表面に施した弊社独自の表面処理により非特異吸着が高度に抑制されています 高 S/N 比を実現! ビーズ表面の活性エステル基がアミノ基 (-NH2) をもつリガンド ( タンパク質
製品コード 3372 研究用 pcold GST DNA 説明書 v201909da
研究用 pcold GST DNA 説明書 v201909da タンパク質の構造や機能の解明はポストゲノムの重要な研究対象であり 効率の良いタンパク質生産システムはポストゲノム解析に必須の基盤技術です 組換えタンパク質の生産には大腸菌を宿主とする発現系が広く利用されています しかしながら 大腸菌発現系は扱いやすく低コストである反面 遺伝子によっては発現できない あるいは発現タンパク質が不溶化するという問題が起こることがあります
TaKaRa PCR Human Papillomavirus Detection Set
研究用 TaKaRa PCR Human Papillomavirus Detection Set 説明書 v201703da 本製品は子宮頸癌において最も高頻度に検出される Human Papillomavirus(HPV)16 18 および 33 型をそれぞれ特異的に増幅し 検出するセットです HPV16 18 および 33 型の E6 を含む領域 (140 bp ただし HPV33 型は 141
BKL Kit (Blunting Kination Ligation Kit)
製品コード 6126/6127 BKL Kit (Blunting Kination Ligation Kit) 説明書 PCR 産物を平滑末端ベクターにクローニングする場合 使用するポリメラーゼ酵素の種類により 3' 末端に余分に付加された塩基を除去し さらに 5' 末端をリン酸化する必要があります 本製品は これらの一連の反応を簡便に短時間に行うためのキットです PCR 産物の末端平滑化とリン酸化を同時に行うことにより
PanaceaGel ゲル内細胞の観察 解析方法 1. ゲル内細胞の免疫染色 蛍光観察の方法 以下の 1-1, 1-2 に関して ゲルをスパーテルなどで取り出す際は 4% パラホルムアルデヒドで固定してから行うとゲルを比較的簡単に ( 壊さずに ) 取り出すことが可能です セルカルチャーインサートを
1. ゲル内細胞の免疫染色 蛍光観察の方法 以下の 1-1, 1-2 に関して ゲルをスパーテルなどで取り出す際は 4% パラホルムアルデヒドで固定してから行うとゲルを比較的簡単に ( 壊さずに ) 取り出すことが可能です セルカルチャーインサートを用いた培養ではインサート底面をメス等で切り取ることで またウェルプレートを用いた培養ではピペットの水流でゲル ( 固定後 ) を底面から浮かすことで 回収しやすくなります
Microsoft Word - タンパク質溶液内酵素消化 Thermo
タンパク質の溶液内酵素溶液内酵素消化 ( 質量分析用サンプル調製 ) 質量分析計によるタンパク質解析においては 一般的にタンパク質を還元 アルキル化した後にトリプシン等で酵素消化して得られた消化ペプチドサンプルが用いられます 本資料ではこのサンプル調製について 専用キットを用いて行う方法 各種試薬や酵素を用いて行う方法 また関連情報として タンパク質の定量法についてご紹介しています 内容 1 培養細胞の酵素消化
1-4. 免疫抗体染色 抗体とは何かリンパ球 (B 細胞 ) が作る物質 特定の ( タンパク質 ) 分子に結合する 体の中に侵入してきた病原菌や毒素に結合して 破壊したり 無毒化したりする作用を持っている 例 : 抗血清馬などに蛇毒を注射し 蛇毒に対する抗体を作らせたもの マムシなどの毒蛇にかまれ
1. 血液細胞の免疫蛍光染色とフローサイトメトリー解析 1-1. フローサイトメトリー ( Flow Cytometory ) とは細胞浮遊液をフローセル内を高速で流し 個々の細胞の形質等についてレーザー光を用いて解析する研究手法 フローサイトメーター( Flow Cytometer ) フローサイトメトリーにおいて使用する細胞解析用の装置今回は BD Accuri C6 を使用する 1-2. フローサイトメーターで何ができるか?
Microsoft Word - H18年度生命工学報告書 Astro ver.3
1. Rotavirus Norovirus Adenovirus Astrovirus Sapovirus 5 1) Human Astrovirus HastV 1975 Madeley Cosgrove EM RNA 30nm 5 6 Fig. 1 2) HastV 8 3 5 HastV ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay RIA Radio immunoassay
Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST
ytotoxicity L ssay Kit-WST はじめに 本説明書は ytotoxicity L ssay Kit-WST を用いた抗体依存性細胞傷害測定用 (ntibody-dependent cellmediated cytotoxicity: ) です 本製品のキット内容や Working Solution の調製方法に関して 製品添付の取扱い説明書も合わせてご覧ください 正確な測定のために
【Webinar】蛍光免疫染色の基礎
蛍光免疫染色の基礎 ライフテクノロジーズジャパン株式会社 テクニカルサポート 小林英夫 The world leader in serving science 1 蛍光免疫染色の概要 タンパク質の発現の確認 タンパク質の局在性の確認 上記を細胞や組織の形態と照らし合わせて観察 固定膜の浸透処理ブロッキング 1 次抗体を加える 酵素抗体法 ( 発色 ) と比較して 両方とも高感度 多重染色が容易 長期保存は不向き
Mouse IgG EIA Kit
製品コード MK137 研究用 Mouse IgG EIA Kit 説明書 生体防御のひとつ 液性免疫の主役となる抗体 : 免疫グロブリン (Ig) は動物体内では 5 種類のクラス (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD) が存在し 血液中で 80% を占めるのが IgG クラスです 血液中の IgG は 免疫応答によりその含有量は大きく変動しますが 一般的に 3 ~ 10 mg/ml
The Science of Western Blotting
メンブレンメーカーだから知っているウェスタンブロッティングのコツ ラボジャパン事業本部 バイオサイエンス営業部間瀬久 Contents 1 ウェスタンブロッティングの概要 2 電気泳動 & 転写 3 免疫検出 4 トラブルシューティング 5 吸引ろ過を用いた免疫反応 2 ウェスタンブロッティングの概要 3 ウェスタンブロッティングの概要 サンプル調製電気泳動転写免疫検出 タンパク質精製 分離 濃縮
1. 背景血小板上の受容体 CLEC-2 と ある種のがん細胞の表面に発現するタンパク質 ポドプラニン やマムシ毒 ロドサイチン が結合すると 血小板が活性化され 血液が凝固します ( 図 1) ポドプラニンは O- 結合型糖鎖が結合した糖タンパク質であり CLEC-2 受容体との結合にはその糖鎖が
参考資料配布 2014 年 11 月 10 日 独立行政法人理化学研究所 国立大学法人東北大学 血小板上の受容体 CLEC-2 は糖鎖とペプチド鎖の両方を認識 - マムシ毒は糖鎖に依存せず受容体と結合 - 本研究成果のポイント レクチンは糖鎖とのみ結合する というこれまでの考え方を覆す CLEC-2 受容体は同じ領域でマムシ毒とがんに関わる糖タンパク質に結合 糖鎖を模倣したペプチド性薬剤の設計への応用に期待
Microsoft Word - Zenon Mouse IgG Labeling Kit_J1_28Apr2008.doc
製品情報 2008 年 4 月 28 日改訂 Zenon Mouse IgG Labeling Kit はじめに ひとこと 届いた製品はすぐに下記の条件下で保存してください : 2~6 C 遮光条件下 励起 / 蛍光波長 : 表 1 参照 Zenon Mouse IgG Labeling Kit は 抗体コンジュゲート生成のための 迅速かつ汎用的で信頼性のある方法を提供します しかも 出発物質はごく少量
■リアルタイムPCR実践編
リアルタイム PCR 実践編 - SYBR Green I によるリアルタイム RT-PCR - 1. プライマー設計 (1)Perfect Real Time サポートシステムを利用し 設計済みのものを購入する ヒト マウス ラットの RefSeq 配列の大部分については Perfect Real Time サポートシステムが利用できます 目的の遺伝子を検索して購入してください (2) カスタム設計サービスを利用する
無細胞タンパク質合成試薬キット Transdirect insect cell
発現プラスミドの構築 1. インサート DNA の調製開始コドンは出来るだけ 5'UTR に近い位置に挿入して下さい 経験的に ptd1 の EcoRV/KpnI サイトへのライゲーション効率が最も高いことを確認しています 本プロトコルに従うと インサートサイズにも依りますが 90% 以上のコロニーがインサートの挿入されたクローンとして得られます 可能な限り EcoRV/KpnI サイトへ挿入されるお奨めします
培養細胞からの Total RNA 抽出の手順 接着細胞のプロトコル 1. プレート ( またはウエル ) より培地を除き PBSでの洗浄を行う 2. トリプシン処理を行い 全量を1.5ml 遠心チューブに移す スクレイパーを使って 細胞を掻き集める方法も有用です 3. 低速遠心 ( 例 300 g
Maxwell RSC simplyrna Cells / Tissue Kit ( カタログ番号 AS1340/AS1390) 簡易マニュアル 注意 : キットを受け取りましたら 1-Thioglycerolを取り出し キット箱は室温で保存してください 取り出した1-Thioglycerolは2~10 で保存してください ご用意いただくもの 細胞 組織の両方の場合で共通 ボルテックスミキサー ピペットマン
パナテスト ラットβ2マイクログロブリン
研究用試薬 2014 年 4 月作成 EIA 法ラット β 2 マイクログロブリン測定キット PRH111 パナテスト A シリーズラット β 2- マイクロク ロフ リン 1. はじめに β 2 - マイクログロブリンは, 血液, 尿, および体液中に存在し, ヒトでは腎糸球体障害, 自己免疫疾患, 悪性腫瘍, 肝疾患などによって血中濃度が変化するといわれています. また,β 2 - マイクログロブリンの尿中濃度は,
Gen とるくん™（酵母用）High Recovery
研究用 Gen とるくん ( 酵母用 ) High Recovery 説明書 v201510da Gen とるくん ( 酵母用 )High Recovery は 細胞壁分解酵素による酵母菌体処理と塩析による DNA 精製の組み合わせにより 効率良く酵母ゲノム DNA を抽出 精製するためのキットです 本キットを用いた酵母ゲノム DNA 調製操作は 遠心による酵母菌体の回収 GenTLE Yeast
おすすめのローディング コントロール抗体 ターゲット 免疫動物 * モノ M ポリ P 交差性 * 製品番号 Actin Rb P Ms, Rat, Chk, Cow, Hu, Xl,Dm, Zfsh ab1801 alpha sarcomeric Actin Ms M Hu, Ms, Rat ab
ローディング コントロール抗体 アブカムならあなたにぴったりの コントロール抗体 が見つかるはずです ローディング コントロール抗体 (Loading control antibody) は ウエスタン ブロッティングにおけるポジティブ コントロールとなる抗体で 各レーンのサンプルが均等に泳動されていることの確認 ゲルからメンブレンへ確実に転写されていることの確認 また異なるサンプル中のターゲット
Oligotex ™-dT30 <Super> mRNA Purification Kit (From total RNA)
研究用 Oligotex -dt30 mrna Purification Kit (From total RNA) 説明書 v201706 Oligotex-dT30 は 培養細胞や動植物組織などの total RNA から polya + RNA を高純度に分離 精製するために JSR ライフサイエンス社およびロシュ ダイアグノスティックス株式会社が共同開発した mrna
ISOSPIN Blood & Plasma DNA
血液 血清 血しょうからの DNA 抽出キット ISOSPIN Blood & Plasma DNA マニュアル ( 第 2 版 ) Code No. 312-08131 NIPPON GENE CO., LTD. I 製品説明 ISOSPIN Blood & Plasma DNA( アイソスピンブラッド & プラズマ DNA) は 血液 血清 血しょうから DNAを抽出するためのキットです 本キットは
Microsoft PowerPoint - 4_河邊先生_改.ppt
組換え酵素を用いた配列部位 特異的逐次遺伝子導入方法 Accumulative gene integration system using recombinase 工学研究院化学工学部門河邉佳典 2009 年 2 月 27 日 < 研究背景 > 1 染色体上での遺伝子増幅の有用性 動物細胞での場合 新鮮培地 空気 + 炭酸ガス 使用済み培地 医薬品タンパク質を生産する遺伝子を導入 目的遺伝子の多重化
実験操作方法
実験操作方法 A. サンプル ( 菌液 ) の調製検出目的の菌種に適した方法でサンプル調製を行い 最終的に100μl 程度の菌懸濁液を用意してください このサンプル液のうち40μlを B.EMA 処理 に使用します 残りは氷上もしくは4 で保存し EMA 処理なしサンプルを用意するために40μlを B.EMA 処理 8) 加熱殺菌 ( 不活化処理 ) の操作を行った後 C. 核酸抽出 に使用します
本日の内容 HbA1c 測定方法別原理と特徴 HPLC 法 免疫法 酵素法 原理差による測定値の乖離要因
HbA1c 測定系について ~ 原理と特徴 ~ 一般社団法人日本臨床検査薬協会 技術運営委員会副委員長 安部正義 本日の内容 HbA1c 測定方法別原理と特徴 HPLC 法 免疫法 酵素法 原理差による測定値の乖離要因 HPLC 法 HPLC 法原理 高速液体クロマトグラフィー 混合物の分析法の一つ 固体または液体の固定相 ( 吸着剤 ) 中で 液体または気体の移動相 ( 展開剤 ) に試料を加えて移動させ
蛋白質科学会アーカイブ メチオニン要求株を使わないセレノメチオニン標識蛋白質のつくりかた
メチオニン要求株を使わないセレノメチオニン標識蛋白質のつくりかた 産業技術総合研究所 中村努 石川一彦 ( 投稿日 2008/7/29 再投稿日 2008/8/21 受理日 2008/8/27 修正日 2013/11/29) キーワード : セレノメチオニン 生合成阻害 X 線結晶構造解析 概要 X 線結晶構造解析において初期位相を決定する際 セレン原子による異常散乱を利用することが広く行われている
抗体定量用アフィニティークロマトグラフィー
59 抗体定量用アフィニティークロマトグラフィーカラム TSKgel Protein A 5PW の開発 バイオサイエンス事業部開発部セパレーション G 藤井智荒木康祐 1. はじめに近年 バイオ医薬品市場の成長は著しく 特に免疫グロブリン G(IgG) を中心とした抗体医薬品については 212 年に 46 億ドルであった市場規模が 218 年には 772 億ドルまで拡大すると予測されている 1)
大学院博士課程共通科目ベーシックプログラム
平成 30 年度医科学専攻共通科目 共通基礎科目実習 ( 旧コア実習 ) 概要 1 ). 大学院生が所属する教育研究分野における実習により単位認定可能な実習項目 ( コア実習項目 ) 1. 組換え DNA 技術実習 2. 生体物質の調製と解析実習 3. 薬理学実習 4. ウイルス学実習 5. 免疫学実習 6. 顕微鏡試料作成法実習 7. ゲノム医学実習 8. 共焦点レーザー顕微鏡実習 2 ). 実習を担当する教育研究分野においてのみ単位認定可能な実習項目
Microsoft Word - h8162bul_ Edit.doc
140-0002 東京都品川区東品川 2-2-24 天王洲セントラルタワー 4F Tel: (03) 5796-7330 Fax: (03) 5796-7335 e-mail: sialjpts@sial.com HIS-Select R Cobalt Affinity Gel (HIS-Select コバルトアフィニティーゲル ) 製品番号 H8162 保存温度 2~8 C TECHNICAL BULLETIN
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植物 DA の抽出と増幅 1 背景 植物種子から DA 抽出する際 有機溶媒や酵素を用いた処理 遠心分離装置を使った操作など 煩雑で時間のかかる工程が用いられてきた カ技ネ術カの 検体採取 簡易 DA 抽出キット version2( 抽出キット ) と高速増幅用 DA Polymerase ( 増幅キット ) を組合わせる事で 遺伝子検査時間を短縮可能! 抽出キット * 抽出 DA を 増幅キット
Microsoft Word - cellmm2bul_ edit.doc
140-0002 東京都品川区東品川 2-2-24 天王洲セントラルタワー 4F Tel: (03) 5796-7330 Fax: (03) 5796-7335 e-mail: sialjpts@sial.com FLAG M Purification Kit 哺乳動物発現系用 製品番号 CELLMM2 保存温度 -20 C TECHNICAL BULLETIN ( 使用説明書 ) 製品概要エピトープタグが付いたタンパク質は
Microsoft Word - Dr. Abe.doc
3 ステップ アビジン - ビオチンシステム (SAB 法 ) とポリマー法 慶應義塾大学医学部病理学教室阿部仁 はじめに 免疫組織化学は Coons らが蛍光色素を抗体に標識した蛍光抗体法の技術を確立してから Singers のフェリチン抗体法を経て 1967 年に Nakane と Pierce により標識物質に西洋ワサビペルオキシダーゼ (horseradish peroxidase:hrp)
生物学に関する実験例 - 生化学 / 医療に関する実験例 ラジオアッセイ法によるホルモン測定 [ 目的 ] 本実習では, 放射免疫測定 (Radioimmunoassay,RIA) 法による血中インスリンとイムノラジオメトリックアッセイ ( 免疫放射定測定 Immunoradiometric ass
![生物学に関する実験例 - 生化学 / 医療に関する実験例 ラジオアッセイ法によるホルモン測定 [ 目的 ] 本実習では, 放射免疫測定 (Radioimmunoassay,RIA) 法による血中インスリンとイムノラジオメトリックアッセイ ( 免疫放射定測定 Immunoradiometric ass](/thumbs/104/163903931.jpg "生物学に関する実験例 - 生化学 / 医療に関する実験例 ラジオアッセイ法によるホルモン測定 [ 目的 ] 本実習では, 放射免疫測定 (Radioimmunoassay,RIA) 法による血中インスリンとイムノラジオメトリックアッセイ ( 免疫放射定測定 Immunoradiometric ass")
生物学に関する実験例 - 生化学 / 医療に関する実験例 ラジオアッセイ法によるホルモン測定 [ 目的 ] 本実習では, 放射免疫測定 (Radioimmunoassay,RIA) 法による血中インスリンとイムノラジオメトリックアッセイ ( 免疫放射定測定 Immunoradiometric assay, IRMA) 法による血清中のレニンを定量を通して 今日用いられている種々のインビトロ検査法の原理並びに両者の違い等を理解する
Microsoft Word - Fluo4 Direct Calcium Assay Kits_J1_3Apr2009.doc
Fluo-4 Direct Calcium Assay Kit カタログ番号 F10471 F10472 F10473 表 1. 製品内容および保存方法 試薬 Fluo-4 Direct カルシウムアッセイ試薬 (Component A) 量 F10471 F10472 F10473 10 10 ml 1 100 ml 1 1 L 水溶性プロベネシド (Component B) 2 77 mg 2
TaKaRa PCR Human Papillomavirus Typing Set
研究用 TaKaRa PCR Human Papillomavirus Typing Set 説明書 v201703da 本製品は さまざまなタイプの Human Papillomavirus(HPV) において塩基配列の相同性の高い領域に設定したプライマーを consensus primer として用いることにより HPV の E6 と E7 を含む領域 (228 ~ 268 bp) を共通に PCR
Vitronectin EIA Kit
製品コード MK102 研究用 Vitronectin EIA Kit 説明書 ビトロネクチン (Vitronectin:VN) は 補体結合蛋白質 S- プロティンとしても知られている血中の主要な接着タンパク質で 血中には高濃度に存在しています ビトロネクチンは ビトロネクチンレセプターを保有する細胞に対して接着活性を持つ他 コラーゲン へパリンなどの物質 またプラスミノーゲン活性化阻害因子 -1
Microsoft Word - iBind Western System 日本語簡易取扱説明書
簡易取扱説明書 ibind Western System 簡易取扱説明書 ver.2 ibind Western System 日本語簡易取扱説明書 ver.2 サンプルブロッティング済みメンブレン 試薬 ibind Solution kit 抗体反応用試薬 ibind Detection Kits 検出試薬 (AP 用の二次抗体も含む ) 一次抗体脱イオン水装置と器具 ibind Device ibind
EpiScope® ChIP Kit (anti-mouse IgG)
研究用 EpiScope ChIP Kit (anti-mouse IgG) 説明書 v201802da クロマチン免疫沈降 (ChIP; Chromatin Immunoprecipitation) は 生きた細胞内のタンパク質 - DNA 間の相互作用を解析する方法の 1 つで 修飾ヒストンや転写因子などのクロマチン関連タンパク質のゲノム上局在解析に利用されています 本キットには クロスリンク処理後の細胞からの
Microsoft Word ab205921_自動染色プロトコール_YU_IS.docx
抗 PD-L1 抗体 [clone 28-8] 動免疫組織染 装置別プロトコール PD-L1 RabMAb [clone 28-8] (ab205921) BioGenex 社 i6000( オフライン抗原賦活化 ) Leica 社 BOND RX( オンライン抗原賦活化 ) Ventana 社 Ultra( オフライン抗原賦活化 ) Dako 社 Omnis BioGenex 社 i6000 プロトコール
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ELISA 用プレート ( フ ロッキンク レスタイフ ) ( 旧称 :New ELISA plate) 住友ベークライト株式会社 S- バイオ事業部 - 1 - ELISA 用プレート ( フ ロッキンク レスタイフ ) の特長 当社独自の表面処理技術によりブロッキング 操作なしで低いバックグランドを提供します 血清などに含まれる種々タンパク質の非特異吸着を抑制します 予めブロッキング処理がされている為
HVJ Envelope VECTOR KIT GenomONE –Neo (FD)
HVJ Envelope VECTOR KIT GenomONE -Neo (FD) Instruction Manual GenomONE Neo (FD) 取扱説明書 ( 第 版 ). 概要............ 2 -: トランスフェクション原理... 2-2: 製品仕様... 2 2.. 本書記載の方法について......... 3 2-: 使用量の定義 (AU:Assay Unit)...
Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)
Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) 山根美穂 020617 調整する試薬類 11 % Formaldehyde Solution Formaldehyde* 11 % (v/v) 100mM EDTA-Na (ph 8.0) EGTA-Na 0.5mM 50mM *use 16 % Formaldehyde (Methanol free) (PSI/ コスモバイオ
Microsoft Word - Fluo4 NW Calcium Assay KitsJ1_20Jun2006.doc
製品情報 2006 年 10 月 20 日改訂 Fluo-4 NW Calcium Assay Kit(F36205 F36206) F36205 Fluo-4 NW Calcium Assay Kit (high-throughput) *for 100 microplates* F36206 Fluo-4 NW Calcium Assay Kit (starter pack with buffer)
Microsoft PowerPoint - ELISA MAX Standard Protocol
Sandwich ELISA Protocol ELISA MAX TM Standard set トミーデジタルバイオロジーアライアンストプロダクトカスタマーサポート 試薬の構成 1 Capture Antibody (200 倍 ) 2 Detection Antibody (200 倍 ) 3 Standard 4 Avidin - HRP (1000 倍 ) 5 Instruction Sheet
TaKaRa Bradford Protein Assay Kit
研究用 TaKaRa Bradford Protein Assay Kit 説明書 v201701da TaKaRa Bradford Protein Assay Kit は Coomassie Dye を用いる Bradford 法に基づいたキットであり 簡単な操作で迅速に 濃度範囲が 1 ~ 1,000 μg/ml のタンパク質溶液の定量を行うことができます 本キットの定量の原理は Coomassie
In vivo へのトライ
アデノウイルスベクターによる RNAi 特長 高い感染能を利用し 効率よく一過性の RNAi 実験が行える 広い動物種に用いることができ 増殖細胞だけでなく静止期の細胞にも感染 発現できる 神経系を含む多くの分化 未分化動物培養細胞をターゲットにすることができ さらに動物個体への直接注入 投与による遺伝子発現が可能である 原理説明 アデノウイルスは最もよく研究されているウイルスのひとつである
No. 1 Ⅰ. 緒言現在我国は超高齢社会を迎え それに伴い 高齢者の健康増進に関しては歯科医療も今後より重要な役割を担うことになる その中でも 部分欠損歯列の修復に伴う口腔内のメンテナンスがより一層必要となってきている しかし 高齢期は身体機能全般の変調を伴うことが多いため 口腔内環境の悪化を招く
学位論文内容の要約 甲第 692 号論文提出者金野弘靖 論文題目 口腔レンサ球菌における環状ヌクレオチドの働きについて No. 1 Ⅰ. 緒言現在我国は超高齢社会を迎え それに伴い 高齢者の健康増進に関しては歯科医療も今後より重要な役割を担うことになる その中でも 部分欠損歯列の修復に伴う口腔内のメンテナンスがより一層必要となってきている しかし 高齢期は身体機能全般の変調を伴うことが多いため 口腔内環境の悪化を招くことに成り易い
Microsoft PowerPoint - LEGEND MAX Protocol
Sandwich ELISA Protocol LEGEND MAX TM ELISA Kit with Pre coated Plates トミーデジタルバイオロジーアライアンストプロダクトカスタマーサポート 試薬の構成 試薬 包装単位 1プレート包装 5プレート包装 容量 ( ボトル ) プレコート96ウエルマイクロタイタープレート 1 5 ディテクション抗体 1 5 12ml スタンダード 1
cDNA cloning by PCR
cdna cloning/subcloning by PCR 1. 概要 2014. 4 ver.1 by A. Goto & K. Takeda 一般的に 細胞または組織由来の RNA から作製した cdna(cdna pool) から 特定の cdna をベクターに組み込む操作を cdna cloning と呼ぶ その際 制限酵素認識配列を付与したオリゴ DNA primer を用いた PCR
MLPA 法 Q&A 集
MLPA 法 Q&A 集 目次 1. MLPA 法の導入 Q1. 導入にあたり 何が必要になりますか? Q2. 実験にはどのようなサンプルが必要でしょうか? Q3. サンプルDNAはどれくらい用意すれば良いですか? Q4. キャピラリーシーケンサが自施設に無い場合でも実験はできますか? Q5. FFPE 検体でも実験はできますか? 2. 実験のセットアップ Q1. 実験において重要なポイントはありますか?
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QCWS 参考プロトコル 抗 HLA 抗体検査 (ICFA) 2019 年度版 作成者日本組織適合性学会認定制度委員会ワーキンググループ抗 HLA 抗体 WG 制定 改訂履歴 版数 制定日 施行日 制定理由 作成責任者 初版 日本組織適合性学会が開催する QCWS での HLA 検査を実施する際に用いる QCWS 参考プロトコルとして制定した WG 版数 改訂日 施行日 改訂理由 改訂内容 改訂責任者
SPP System Set,SPP System I,SPP System II,SPP System III,SPP System IV
研究用 SPP System Set ( 製品コード 3366) SPP System I ( 製品コード 3367) SPP System II ( 製品コード 3368) SPP System III ( 製品コード 3369) SPP System IV ( 製品コード 3370) 説明書 v201612da 目次 I. 製品説明...3 II. 内容...4 III. 保存...4 IV.
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35 カチオン交換型ミックスモードゲル TOYOPEARL MX-Trp-650M の性能 バイオサイエンス事業部 開発部セパレーションセンター 久保雄二 中村孝司 1. 背景近年 バイオ医薬品の中でも免疫グロブリン G(IgG) を中心とした抗体医薬に対する需要の増加は特に著しい その抗体医薬品の成功に伴い 生産工程の第一段階である培養工程において 抗体の発現量が増加している その結果 生産工程の第二段階である精製工程においても
<4D F736F F D20834E E815B82CC8DEC90BB B835A838B838D815B835882F08E E646F6378>
17/09/15 版 Muse 細胞の特性解析 目次 1. poly-hema コート処理 1 2. メチルセルロースを用いた bulk でのクラスターの作製 2 3. Single cell suspension culture におけるクラスターの作製 3 4. 多能性の検証 1 アルカリフォスファターゼ染色 4 5. 多能性の検証 2 Gelatin 上でのクラスターの培養 5 6. RT-PCR
抗体キャンペーン（2018/8/31まで）
富士フイルム和光純薬株式会社 キャンペーンって簡単じゃない それでもキャンペーンを続けるのは そこに試して欲しい試薬があるから 和光自慢の製品をこの機会に是非お買い求めください 今年もやります抗体キャンペーン キャンペーン期間 2018 年 6 月 1 日 ( 金 ) 2018 年 8 月 31 日 ( 金 ) 和光オリジナル抗体 市販の抗体でお困りではないですか? そんな方は当社の高品質抗体をお試しください!
発現ベクターによるRNAi
発現ベクターによる RNAi 特長 合成 sirna を導入した場合に比べ 長期に RNAi 効果を観察できる 細胞中に高効率で sirna を発現させることが可能 研究目的に応じて任意のベクターが選択できる 原理及び説明遺伝子発現をノックダウンする手法としてRNA 干渉作用 (RNAi) が注目されている RNAi は二本鎖 RNA(dsRNA) を細胞に導入することにより 標的遺伝子のmRNAを分解し
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フローサイトメトリープロトコル集 イムノフェノタイピング アポトーシス 細胞周期 作成日 2017 年 5 月 Version 1.0 研究目的でのみ使用できます 診断には使用できません A. 細胞表面マーカーの染色 蛍光標識した細胞表面マーカーとフローサイトメトリー解析を組み合わせることにより 分化や発生のステージ また細胞機能に基づいた細胞集団サブセットの同定が可能になります これらの表面マーカーには様々なタイプまたは機能があり
Alpha Protein-Protein Interactionユーザーガイド
Alpha Protein-Protein Interaction ユーザーガイド 1 目次 1. はじめに... 3 2. アッセイ系の構築... 4 2.1 ビーズの選択... 4 2.1.1 AlphaLISA vs. AlphaScreen ビーズ... 4 2.1.2 ビーズの種類... 4 2.1.3 偽陽性を生じるビーズペア... 9 2.2 バッファーの選択... 12 2.2.1
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QCWS 参考プロトコル 抗体検査 (FlowPRA) 平成 29 年度版 作成者 日本組織適合性学会認定制度委員会ワーキンググループ 抗 HLA 抗体 WG 改訂履歴 版数 改訂日 施行日 改訂理由 改訂内容 改訂責任者 2 目 次 1.FlowPRA 製品概要... 1 1.1 FlowPRA の使用目的 原理... 1 1.2 FlowPRA の種類... 2 2. 検査の準備... 3 2.1
DVDを見た後で、次の問いに答えてください
( 実験責任者 実験従事者兼用 ) 理解度テスト問題 動画を視聴した後に この問題を見ながら設問に答えてください ( 二択もしくは複数選択問題です 正しいものを全て選んでください ) 問題 1 HIV-1 の病原性に関与しない rev 遺伝子を pcdna3.1 と pet28a プラスミド ( 図 1 参照 ) に挿入し COS 細胞および大腸菌で発現させる実験を計画した Step 1. Step
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QA7-0878-V02 1 ❶ ❷ ❷ ❶ 2 ❶ ❷ ❶ ❷ 1 2 1 3 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 1 ❶ ❷ ❶ ❷ 2 1 1 2 3 4 1 2 ❶ ❷ ❶ ❷ 3 4 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 1 2 3 4 ❶ ❷ ❸ ❸ ❷ ❶ 5 ❶ ❶ ❷ ❸ ❹ ❷ ❸
CONTENTS January 2007 No Cosmo Bio News No.0 1
http://www.cosmobio.co.jp January 2007 No. 0 CONTENTS January 2007 No.0 1 7 7 8 10 1 17 20 2 2 11 12 12 1 1 1 1 1 1 19 20 21 22 2 2 2 2 17 18 18 27 28 0 1 2 Cosmo Bio News No.0 1 7 F F F F E B B B B B
免疫組織化学の基礎と応用 蓮井和久鹿児島大学大学院医歯学総合研究科 講師 この講義は 2007 年から大学院専門基礎過程の選択科目として開講しているものである 教科書には 改訂四版渡辺 中根の酵素抗体法 ( 名倉宏 長村義之 堤寛編集 ) 学際企画を用いています それに 最近のポリマー法の開発等と私の研究への応用等を基礎にしています I. 序論 1) 医学 生物学における免疫組織化学の確立と意義免疫組織化学は
遺伝子検査の基礎知識
リアルタイム PCR( インターカレーター法 ) 実験ガイドこの文書では インターカレーター法 (TB Green 検出 ) によるリアルタイム PCR について 蛍光検出の原理や実験操作の流れなどを解説します 実際の実験操作の詳細については 各製品の取扱説明書をご参照ください - 目次 - 1 蛍光検出の原理 2 実験に必要なもの 3 実験操作法 4 結果の解析 1 1 蛍光検出の原理 インターカレーターによる蛍光検出の原理
MEGALABEL™
研究用 MEGALABEL 説明書 v201711 MEGALABEL は [γ- 32 P]ATP と T4 Polynucleotide Kinase を用いて DNA の 5' 末端を効率よく標識するためのキットです 本製品は T4 Polynucleotide Kinase を用いたリン酸化反応 交換反応それぞれに 独自の Buffer 系を採用し 末端形状によらず 10 6 cpm/pmol
鶏大腸菌症 ( 組換え型 F11 線毛抗原 ベロ細胞毒性抗原 )( 油性アジュバント加 ) 不活化ワクチン平成 20 年 6 月 6 日 ( 告示第 913 号 ) 新規追加 平成 25 年 9 月 26 日 ( 告示第 2480 号 ) 一部改正 1 定義組換え型 F11 線毛抗原産生大腸菌及びベ
鶏大腸菌症 ( 組換え型 F11 線毛抗原 ベロ細胞毒性抗原 )( 油性アジュバント加 ) 不活化ワクチン平成 20 年 6 月 6 日 ( 告示第 913 号 ) 新規追加 平成 25 年 9 月 26 日 ( 告示第 2480 号 ) 一部改正 1 定義組換え型 F11 線毛抗原産生大腸菌及びベロ細胞毒性抗原産生大腸菌の培養菌液を不活化し その遠心上清を濃縮後 油性アジュバントを添加したワクチンである
コメDNA 抽出キット（精米20 粒スケール）
食品 環境分析用 コメ DNA 抽出キット ( 精米 20 粒スケール ) ( コメ判別用 PCR Kit 用 ) 説明書 v201703da 本キットは未加熱の精米 20 粒から DNA の調製を行う際に使用します 最終的に回収された DNA 溶液は 直接 PCR 反応に利用することができます 本キットを用いた DNA 調製には 劇物であるフェノールやクロロホルムは使用しません I. 内容 (50
MB-lecture12.pptx
タンパク質の発現精製方法 目的遺伝子 タンパク質発現に用いる生物種のプロモーター例 )Lac (E. coli) ADH1 (S. cerevisiae) Promoter STOP タンパク発現用プラスミド マーカー遺伝子 ( 薬事耐性など ) 複製開始点 198 培地中のラクトース E. coli lac promoter E. coli でのタンパク質発現の例 pet system T7 RNA
Microsoft Word - A5_FlowCount.DOC
>> http://www.bc-cytometry.com Flow-Count TM を用いた細胞絶対数の測定 5 はじめに - 目印の効用 従来 フローサイトメトリー (FCM) の使用目的は 細胞集団の中のあるポピュレーションの割合 ( 陽性率 ) を調べることが中心でした しかし 今日 造血幹細胞 残存白血球 CD4 陽性 T 細胞数などポピュレーションの割合と同時に その細胞実数 ( 絶対数
PureExo Exosome Isolation Kit for cell culture media & serum 高純度エクソソームを高収率 迅速に単離 エクソソームは 細胞由来の直径 nm の細胞外小胞で 広範囲の生体液 ( 血液 尿 羊水 細胞培養培地など ) に存在していま
Revolutionary Tools for Exosome Research Cell Exosome Cell 2 ml 0.1 ml 2 ml 0.1-2 ml PureExo Cell KIT P100 PureExo Serum KIT P101 DiagExo Urine KIT P120 DiagExo BodyFluid KIT P121 in 100 ul PBS 75 ul 25
Product Description Recombinant tagged proteins are widely used for protein purification and protein characterization. There are many purification met
Printed June 20, 2013 Version 1.0 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. c-myc-tagged Protein PURIFICATION CARTRIDGE (Clone 1G4) CODE No. 3306K PURIFICATION to maintain protein activity
P TOYOPEARL TOYOPEARL DEAE-650S, M, C TOYOPEARL CM-650S, M, C TOYOPEARL SP-650S, M, C TOYOPEARL SuperQ-650S, M, C TOYOPEARL QAE-550C TOYOPEARL
P0300101 TOYOPEARL TOYOPEARL DEAE-650S, M, C TOYOPEARL CM-650S, M, C TOYOPEARL SP-650S, M, C TOYOPEARL SuperQ-650S, M, C TOYOPEARL QAE-550C TOYOPEARL SP-550C TOYOPEARL MegaCapSP-550EC ご使用の前に この製品を使用する前に,
目次 IPS 細胞の継代... 3 細胞継代後の培地交換... 5 IPS 細胞の凍結... 6 凍結ストックの解凍... 8 細胞融解後の培地交換 融解後 1 日目 ON-FEEDER IPS 細胞を FEEDER-FREE 条件にて継代する方法 参考資料 AC
プロトコール フィーダーフリーでのヒト ips 細胞の培養 1 目次 IPS 細胞の継代... 3 細胞継代後の培地交換... 5 IPS 細胞の凍結... 6 凍結ストックの解凍... 8 細胞融解後の培地交換 融解後 1 日目... 10 ON-FEEDER IPS 細胞を FEEDER-FREE 条件にて継代する方法... 11 参考資料... 14 ACIM 培地の調製... 14 0.5X
TaKaRa BCA Protein Assay Kit
研究用 TaKaRa BCA Protein Assay Kit 説明書 v201307da TaKaRa BCA Protein Assay Kit は 高感度にタンパク質溶液の比色定量を行う試薬であり 界面活性剤によって可溶化されたタンパク質溶液の定量も可能です BCA によるタンパク質定量の原理は 2 段階の反応に基づいています 第 1 段階では タンパク質溶液中のペプチド結合によって キットに含まれる二価銅イオン
P1
❶ 15% 5% 20% 6,000 万 円 以 下 の 部 分 10% 4% 14% 6,000 万 円 超 の 部 分 15% 5% 20% ❷ 30% 9% 39% 2,000 万 円 以 下 の 部 分 10% 4% 14% 2,000 万 円 超 の 部 分 15% 5% 20% ❸ ❹ ❺ ❻ ❼ ❽ ❶ ❷ ❸ ❶ ❷ 売 上 代 金 に 係 る 金 銭 等 の 受 取 書 例 )
GMP-140 (P-selectin) EIA Kit
製品コード MK112 研究用 GMP-140 (P-selectin) EIA Kit 説明書 GMP-140(CD62 PADGEM) は活性化状態にある血小板 血管内皮細胞 巨核球の細胞膜表面に特異的に出現する分子量 14 万の糖蛋白質であり 1) 血管内皮傷害などの炎症部位において 単球や好中球などのリンパ球を結合および誘引する白血球接着分子として機能していると考えられています GMP- 140
Bacterial 16S rDNA PCR Kit
研究用 Bacterial 16S rdna PCR Kit 説明書 v201802da 微生物の同定は 形態的特徴 生理 生化学的性状 化学分類学的性状などを利用して行われますが これらの方法では同定までに時間を要します また 同定が困難な場合や正しい結果が得られない場合もあります 近年 微生物同定にも分子生物学を利用した方法が採用されるようになり 微生物の持つ DNA を対象として解析を行う方法が活用されています
八村敏志 TCR が発現しない. 抗原の経口投与 DO11.1 TCR トランスジェニックマウスに経口免疫寛容を誘導するために 粗精製 OVA を mg/ml の濃度で溶解した水溶液を作製し 7 日間自由摂取させた また Foxp3 の発現を検討する実験では RAG / OVA3 3 マウスおよび
ハチムラサトシ 八村敏志東京大学大学院農学生命科学研究科食の安全研究センター准教授 緒言食物に対して過剰あるいは異常な免疫応答が原因で起こる食物アレルギーは 患者の大部分が乳幼児であり 乳幼児が特定の食物を摂取できないことから 栄養学的 精神的な問題 さらには保育 教育機関の給食において 切実な問題となっている しかしながら その発症機序はまだ不明な点が多く また多くの患者が加齢とともに寛解するものの
コメDNA 抽出キット（精米、玄米1 粒スケール）
食品 環境分析用 コメ DNA 抽出キット ( 精米 玄米 1 粒スケール ) 説明書 v201703da 本キットは未加熱の精米あるいは玄米 1 粒から DNA の調製を行う際に使用します 最終的に回収された DNA 溶液は 直接 PCR 反応などに利用することができ また 制限酵素処理やサブクローニングに使用することもできます 本キットを用いた DNA 調製には 劇物であるフェノールやクロロホルムは使用しません
Pyrobest ® DNA Polymerase
Pyrobest DNA Polymerase 説明書 v201102da 対活Pyrobest DNA Polymerase は Pyrococcus sp. 由来の 3' 5' exonuclease 活性 (proof reading 活性 ) を有する耐熱性 α 型 DNA ポリメラーゼです α 型 DNA ポリメラーゼは Pol I 型ポリメラーゼ (Taq DNA ポリメラーゼなど )
本実験では 複製された DNA や転写された RNA を個々の細胞で可視化して細胞核の 機能と細胞周期の制御を理解すること 及び 染色体標本の作成により染色体の構造 多様性 分配機構について理解することを目的とする 実習の流れ 第一回実習説明 複製された DNA 複製の検出と観察 第二回染色体標本の
細胞核と染色体の機能と構造の観察 担当 : 木村研究室 ( 木村宏 ) 連絡先 :B2-938 室 (045-924-5742) hkimura@bio.titech.ac.jp 実験概要 本実習では DNA 複製や転写など細胞核で起こる現象を蛍光顕微鏡で観察するととも に 染色体標品を作成し 細胞核の機能と細胞周期の制御 染色体の多様性について理 解する 背景 多細胞生物の細胞が増殖するときに 細胞核が存在する間期と染色体が現れる分裂期が繰り返えされる