160 J. Mamm. Ova Res. Vol.30 (4), Mutagenesis IVF B6 33 / F1 domesticus molossinus, castaneus, spretus F1 CD9 Sl/Sld Sl/Sld GV ES ips PGC TG/KO

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1 J. Mamm. Ova Res. Vol.30 (4), , 総説 - 特集 :ICSI の可能性と問題点 実験動物の顕微授精技術の開発とその応用 Development of Microinsemination Techniques for Laboratory Animals and Its Practical Applications Narumi Ogonuki RIKEN Bioresource Engineering Division Bioresorce Center, Koyadai, Tsukuba-shi, Ibaraki , Japan 要旨 : 顕微授精技術とは, 雄性生殖細胞を顕微操作により人為的に卵子に受精させる技術であり, 精子の運動性 を必要とせず, 不動精子, 精巣精子や精細胞などの未成熟精子などを用いて受精させることが出来る. 顕微授精 技術が報告される以前は, 運動精子のみが受精に関与できると考えられており, 自然交配や体外受精 (IVF) に加 わる新しい技術として, 胚 個体の作出方法をさらに広げる技術となった. 開発された当初は繁殖 受精の仕組 みの解明に利用されていたが, 現在ではヒト生殖補助医療技術 (assisted reproductive technology: ART) の重要 技術として, また実験動物では繁殖継代や遺伝資源の保存に加えて遺伝子治療モデル, トランスジェニック作出 など, 様々な応用例が実施されている. 今後, 他の技術と組み合わせることで生殖細胞のあらゆる状況 ステー ジに対応して胚を作製できる技術としてますます利用価値が高まることが期待される. キーワード : 顕微授精,ART, 雄性生殖細胞, 卵子活性化因子 Abstract: Microinsemination, also referred to as intracytoplasmic sperm injection (ICSI), is a technique used to fertilize oocytes by delivering spermatozoa into ooplasm using micromanipulation devices. Microinsemination dose not need some of the sperm-specific properties, such as motility, acrosome reaction, or sperm-oocyte membrane fusion. So we can obtain normal offspring not only with spermatozoa but also with male germ cells that are unable to fertilize oocytes under conventional in vivo and in vitro conditions. ICSI has been widely used as an assisted reproduction technique to study the mechanisms of mammalian fertilization and to rescue male-factor infertility in humans and animals. This review describes how to apply ICSI referring to many studies and discusses future applications. Key words: ICSI, ART, Spermatogenic cells, SOAF はじめに顕微授精とは, 雄性生殖細胞を顕微鏡下で人為的に卵子へ注入して受精させる技術である. 一般的に, 顕微授精とは卵子細胞質内精子注入法 (Intracytoplasmic sperm injection: ICSI) を示すが, 広義には卵子の透明帯にスリットを入れる技術 (partial zona dissection: PZD) や卵子の囲卵腔に精子を注入する技術 (subzonal insemination: SUZI) といった, ogonuki@rtc.riken.jp 精子の透明帯通過を補助する技術, さらには未成熟精子 ( 精細胞 ) を用いた顕微授精などが含まれる. 実験動物における顕微授精技術は 1960 年代にウニやカエルでの報告がある. 哺乳動物の顕微授精技術はハワイ大学の Yanagimachiらによって研究が始まり 1), 初めて産仔が得られたのはウサギ 2) とウシ 3), それからヒト 4) と続き, 家畜とヒトで先行して進められた.1995 年に Kimuraらのマウスの顕微授精においてピエゾドライブユニットを利用したことによる産仔獲得 5) 成功の報告以降, 顕微授精はマウスのリードによって発展を続けている. 顕微授精技術は不妊治療を目的とするイメージが強いが, 実験動物分野では次世代獲得や遺伝資源の保存のみならず遺伝子治療モデル, トランスジェニック作出など, 今日では様々な応用例が実施されている ( 表 1). さらに多くの実験動物種で伸張精子細胞の顕微授精 (elongated

2 160 J. Mamm. Ova Res. Vol.30 (4), Mutagenesis IVF B6 33 / F1 domesticus molossinus, castaneus, spretus F1 CD9 Sl/Sld Sl/Sld GV ES ips PGC TG/KO in vitro DNA speed congenic 17 speed congenic 22 2 ES sperm factor ICSI Praomys coucha spermatid injection: ELSI) 円形精子細胞の顕微注入(round spermatid injection: ROSI) による産仔獲得 (ELSI; 6, 7), ROSI; 8 10) ) や, マウスでは一次精母細胞および二次精母細胞を用いた顕微注入による産仔獲得が成功されてきた 11 13). 本稿では実験動物での顕微授精の有用性と今後の展開について, マウスでの例を中心に紹介したい. 精細胞を用いた顕微授精顕微授精に用いる雄性生殖細胞に必要なのは, 半数体核と卵子活性化能 (sperm-borne oocyte-activating factor: SOAF) である. IVFに必須な精子の運動性を必要としないため, 不動精子や精細胞での受精も可能である. ただし, 用いる精細胞が SOAFを持ち合わせていない場合は人為的な卵子活性化刺激を加える必要がある. 例えばマウスでは円形精子細胞から精子に発生する段階で卵子活性化能を獲得することが知られている 14, 15). つまりマウス円形精子細胞を注入に用いる際には, 卵子への人為的活性化処理が必要である. それに対し, カニクイザルの円形精子細胞はすでに 活性化能を獲得していることから卵子活性化処理は不要である 16). 用いる動物種によって卵子活性化能獲得の時期が異なる 15, 17) ので, 注意しなければならない. また, マウス卵にハムスターやヒト精子あるいはそれらの抽出液, ウニ, クジラ精子を注入しても活性化が起こる 18 21) ことから, SOAFは種特異性が低いことが知られている. この性質を利用して, 精細胞をマウス卵子等の異種卵に顕微注入して卵子活性化能を確認することが可能である 17, 22).Wakayama ら 20) はウニ精子を10 個以上注入しないとマウス卵の活性化が生じないことを報告している. またWatanabeらは 21), クジラ精子をマウス卵子に注入した場合,87% の雄性前核形成率だったのに対し, ウシ卵子では 39% と卵子の動物種により活性化率に違いがあることを指摘している. すなわち動物種により卵子活性化の閾値が異なる点にも留意しなければならない. SOAFの正体は長年不明であったが, 近年になって精子に存在するホスホリパーゼ Cζであることが明らかになった 23).

3 越後貫 161 凍結配偶子を用いた顕微授精飼育スペースや飼育代節約のために, 配偶子や受精卵の凍結保存は有効である. 特にマウスは多くの組み換え動物の生産や多種等による飼育スペースの削減のために, 凍結保存した配偶子や受精卵を次世代作製に用いることが望ましく 24), マウス配偶子の凍結保存技術は卵子 精子ともに広く利用されているが, 卵子は凍結することで透明帯の硬化が生じるために IVFでの受精が難しい場合も認められる 25). 一方精子では凍結の傷害から系統によっては融解後の生存率や運動性が悪く,IVFに使用できない場合も多い 26). このように凍結配偶子を用いてIVFを行う際, 状況によっては顕微授精での対応が必要となることも考慮しておくべきである. また凍結融解操作により, 精細胞の性質が変化すると考えられる実験事実も存在する. 我々の研究において, マウス凍結円形精子細胞の顕微注入では卵子への人為的活性化を与えなくても自発的に活性化が生じ産仔が得られている 27). この原因として凍結融解操作の傷害を受けた円形精子細胞に外液中の Ca 2+ が取り込まれた可能性が考えられ, 顕微授精を行う際には留意しておくべきである. さらに顕微授精技術を利用することで, より過酷な環境で凍結を行った配偶子からも産仔を得ることが可能となっている. 我々はマウス精巣を単離し凍結用チューブにいれて- 80 o C にて凍結保存を行ったところ, 少なくとも 1 年間凍結保存した精巣由来の精子および精細胞から産仔を獲得する事に成功した 28). またマウス個体ごと15 年間 -20 o Cにて凍結保存したケースでも精巣精子から産仔獲得に成功した 28). 以上から摘出した組織あるいは安楽死後の個体での - 20 保存でも精巣精子の受精能は保持されることが明らかになった. この方法は専門的な凍結保存技術を必要とせず, 操作を行う個人差の影響を排除することができる. さらに液体窒素を用いずに冷凍温度での保存 輸送が可能であることから, 国内だけではなく海外からの遺伝子改変マウスの精子を輸送する際にも有用であると考えられる. さらに簡便な精子の保存法として, フリーズドライ法が挙げられる. フリーズドライ法はガラスアンプル瓶に精子懸濁液を入れ, 低温で真空状態にすることによって乾燥させる技術で, 精子の安定的な保存法として近年注目されている. しかし保存後の精子の運動活性は損なわれていることから, 顕微授精技術を併用することでマウス, ラット, ウサギのフリーズドライ精子から産仔が得られている 29, 30, 31). 現時点では常温での保存可能期間は 1 3 ヶ月程度とされているが, ラットでは 5 年間 4 で保存された精子から産仔の獲得例が報告されている 32). また, ディープフリーザー (- 80 ) 内であれば半永久的に保存が可能であると報告されている 33). 精子や系統の簡便な輸送や保存におけるコスト削減に繋がる技術であり, 今後, 常温での長期保存法の開発が期待される. 特殊な条件下における配偶子を用いた顕微授精まず顕微授精を行う前に, 用いるマウスの繁殖状況やIVF での成績などを可能な限り把握しておくことが重要である. さらに顕微授精実施時に精子 精細胞の形態を観察して, その状況に合わせた的確な方法をその場で判断することが必要になる. 我々の経験により, 以下のようなケースが散見された.1 遺伝子改変マウスの一部や加齢マウス, または長期間交配が確認されなかった雄個体を扱うケース : 精巣上体尾部に精子が存在しない場合や, 長期間の貯留により精子内の核が損傷を受け,ICSI 後の着床率や産仔率の低下が報告されている 34). その際には, 精巣精子または精細胞を顕微授精に用いることが次の手段として講じられる. ヒトでも同じ傾向が認められ 35),ARTにおいても射出精子や精巣上体精子が不動または奇形精子の場合, この精子を使用せずに精巣精子を用いる.2 精子の発生異常, あるいは保存状態等によっては顕微注入から約 1 時間経っても卵子に活性化 (Anaphase IIへの移行による第二極体の突出 ) が認められないケース : 卵子活性化が誘起されない場合には, 精子の核が脱凝縮を開始する前に速やかに人為的活性化処理を施す必要がある. 我々は顕微注入 1 時間後に卵子活性化処理を行った胚でも, 産仔が得られることを確認している.3 雄性配偶子の細胞膜が脆弱と考えられるケース : 精細胞を浮遊させる培養液の組成や培養液への暴露時間が雄性染色体に影響することが報告されている 36, 37) ことから, 細胞の状態に合わせた培養液の選択は重要である. 我々は凍結精細胞を用いた顕微授精において, 通常の細胞内に近い状態に維持出来る高 K + 低 Na + である nucleus isolation medium (NIM) 38) を用いることで, 新鮮精細胞に用いる培養液浮遊の場合と比較して高率に産仔が得られることを報告している 28). 顕微授精を用いたトランスジェニック動物の作出従来より, トランスジェニック ( 以下 TG) 動物の作製には前核期の受精卵へ外来遺伝子を注入する方法 39) とレンチウイルスなどのレトロウイルスを卵子囲卵腔に注入する方法 40) が主に利用されている. 近年, 精細胞を導入したい DNA 溶液に懸濁し, 顕微注入する際に同時にDNAが卵子へ持ち込まれるTG 動物の作出法がマウス, ブタ, ラットなどで報告されている 41 43). 精子 精細胞へDNAを密着させる方法と DNA 濃度の最適化がポイントであり, 凍結融解精子やフリーズドライ精子を用いる方法,Triton X-100による細胞膜の処理により効率が上がることが報告されている. 開発当初の遺伝子改変効率は3% 程度と前核内注入法と同等レベルであったが, 最近,NaOHやグラム陽性球菌である streptolysin-oを作用させた精子を用いることで両報告ともに効率が 10% まで向上している 44, 45). 少ない卵子数で効率的に Tg 動物を作製するためには顕微授精技術の利用がより有効と考えられる.

4 162 J. Mamm. Ova Res. Vol.30 (4), 2013 図 1 顕微授精技術を利用した新たなマウス系統の確立野生由来マウスは一般的な実験用マウスとは異なる亜種に分類され, 異なる特性を多く持つことが知られている. 野生由来マウスと実験用マウスの交雑によって新たな系統を確立することはそれらの特性の解析のためにも有用である. しかし野生由来マウスは一般的に実験用マウスと比較して産仔数が少ないこと, 排卵誘起ホルモン (ecg) を投与しても排卵数が少ないこと, 体格差が大きく交配率が高くないなど, 雌雄同居での自然交配およびIVFの適応による産仔の獲得は困難なケースが見受けられる. そこで我々は野生由来マウス精子を実験用マウス卵子に顕微注入することで 4 種の亜種間交雑マウス系統の作出に成功した 46). 一般に, 新たなコンジェニック系統を樹立する場合, 雄マウスの性成熟を待って交配を行うために 1 世代の交代に最短 3 ~ 4 ヶ月はかかり, 系統樹立までには2 ~ 5 年という長い期間を要する. 本来の目的である遺伝子や表現型に関する研究にはなかなか到達できないのが現状である. そこで我々は自然交配の代わりに未成熟マウスの精細胞を用いて顕微授精を行うとともに, 得られたマウスを多型マイクロサテライトマーカーによるゲノムスキャンによる選抜システムを併用することで,1 世代あたりの時間短縮を図る超スピードコンジェニック法を確立した ( 図 1). 本法では生後 日齢の雄マウス由来の円形精子細胞を顕微注入に用いることで 1 世代を最短 42 日間まで短縮することができ, マーカー上でのコンジェニック化が 3 ~ 5 世代 (160 ~ 190 日 ) で完了させることに成功した 47). 現在までにC57BL/6N, C57BL/6J,NOD/SCID 系統の卵子を用いた短期間でのコンジェニック化に成功している. マウス以外の実験動物種での技術開発体内 / 体外の受精に関する基礎情報が乏しい動物種を用いて胚作製を行う場合にはIVFの適応が難しいことがある. 一方で顕微授精は精子の運動性や受精能の獲得を必要としないので, 様々な動物種に適応しやすい. アフリカ原産の小 型げっ歯類であるマストミス (Praomys coucha) は精子の前 培養による受精能獲得および透明帯通過が難しいために IVF が困難なことが知られている. 顕微授精に関しては精子頭部 が鎌形形状であることから,ICSI に用いるピペットの直径 が太くなり卵子の発生率が低下した (2-cell 発生率 : 25%). そこで精子と同ステージにある伸張精子細胞を用いて ELSI を行ったところ, 受精卵が得られ産仔獲得に至った 6). ラッ トも精子頭部が鎌形形状であることに加え,in vitro では未 受精卵が自発的に活性化を起こすために顕微注入が困難な 動物であるが, 精子頭部をピペットの先端に引っ掛ける様に吸引して顕微注入することで成功した 48). その後,ROSI 9, 49) や ELSI 7) でも産仔が得られている. またウサギにおいて も ELSI で産仔が得られている 50). サル類では, ヒトと同様に円形精子細胞の段階で既に卵 子活性化能を有することが, マウス未受精卵への顕微注入 によって明らかになった. そこでカニクイザル卵子に凍結 円形精子細胞を顕微注入し, 胚移植を行った結果, 胎生後期 までの発生を認めた 16). ハムスターは実験動物において一 番最初に顕微授精が成功した動物種である 1) が, 体外発生が 難しいために長年産仔獲得に至っていなかった. 近年になっ て培養技術を改善することで ICSI および ROSI での産仔獲 得が報告されている 10, 51). 以上のことからも明らかなよう に, 顕微授精は精子の運動性を必要としないので様々な場 面で技術利用が可能である. 一方, 家畜 ( ウシ, ブタ ) では顕微授精技術があまり普及 していない. その理由として家畜では人工授精技術や IVF 技 術が発展しているため, わざわざ顕微授精を行う利点が少な いのと, 顕微注入後, 精子の脱凝縮や卵子の活性化が生じに くいなどが挙げられる. しかし家畜における顕微授精技術の 有用性の一つに, 精子分別による雌雄産み分けがある 52). Hamano らは,X 精子と Y 精子の微量な比重の差をもとにフ ローサイトメーターで分離を行い ( 分離精度 82%),ICSI す ることで 80% の確立で雌雄産み分けの成功を報告してい る. 現在, 精子の雌雄分離精度の向上および家畜特有の顕微 授精周辺技術の確立の両方から研究が行われている.

5 越後貫 163 ART のモデル ARTの技術の向上や安全性の観点から, 用いる配偶子の選抜がますます重要課題となっている. 顕微授精技術は ARTの重要な技術の一つであるが, 実験動物を用いた研究では顕微授精技術を使って配偶子の選抜方法が検討されている. 現在 ARTでは最終倍率 6,000 倍以上に拡大した超高倍率の顕微鏡下で選抜した形態良好な精子を用いた顕微授精 (Intracytoplasmic morphologically selected sperm injection: IMSI) の報告が行われている. 精子頭部内の大きな空腔様構造の有無が妊娠 流産率に影響する 53) という報告から, IMSIの有用性を示唆する報告が続いている.IMSIの今後の課題は, 超高倍率による精子の形態観察と染色体の正常性との関連性を証明することが重要であるが, 実験用小動物において空腔精子は観察されず, 追試できないのが現状である. また, ヒト精子の大部分は空腔様構造を認めるといった報告 53) や, ヒト空腔精子をマウス卵に顕微注入して染色体解析を行ったところ, 空腔様構造と DNAフラグメンテーションの関連が認められないといった報告 54) もされている. さらに IMSI 技術を用いてヒト精子を精子中片部の形態ごとに分類し, ウシ卵子へ顕微注入したところ, 星状体形成率に差があることが報告されている 55). このことは精子中片部の形態が精子中心体の機能に影響を及ぼす可能性を示唆しており, さらにはその後の受精率にも影響すると考えられる. 着床前に胚の様々な異常を発見できれば, 母体に危険を伴う妊娠を回避することができる. 現在 ARTでは8 細胞期から胚盤胞期胚の割球を採取して染色体解析の実施や羊水の染色体検査が導入されているが, 検体の採取には胚に, また異常の検出により妊娠の継続を中止する場合には母体に危険が伴う. さらに解析可能な染色体異常が限定され, その他の染色体異常についてはカバーしないなど, いまだ多くの課題がある 56, 57). 胚発生への安全性を考慮して, 受精胚の第二極体を使った染色体解析も考えられているが, 第二極体の染色体が必ずしも胚自体の染色体を反映している訳ではないことが最近報告されている 58, 59).Watanabeらは除核したマウス卵子に精子を注入して半数体の雄核発生胚を作製, 培養後 2 細胞期胚の時点で割球それぞれをMII 卵に融合して1つを染色体解析に用いた 60). この解析結果をもとに残りの胚を選抜し, 胚盤胞期胚に発生した時点でレシピエントマウスに胚移植を行うことで, 染色体解析の結果を反映した正常マウスの獲得を報告した. この方法は受精前の段階で父方からの染色体異常の伝播を防ぐことを可能にする方法であり, 胚や母体に危険が伴わず, さらに正常胚および産子を得られる技術として有用と考えられる. しかしこれらの技術を ARTで応用するためには, 倫理的に改善しなければ難しい手法と現時点では考えられる. ARTにおける大きな課題の 1つは, 卵子の老化による受精 流産への影響である. 卵子老化の原因として, 活性酸素の影 61, 響 62) やミトコンドリアの機能低下 63) などが考えられている.Tachibanaらはサルおよびヒトの除核卵に別の MII 卵の核を移植した卵子に顕微授精を行い, 産仔を得ている 64, 65). これはミトコンドリア病の母子伝播を防ぐことを目的とした技術であるが, 将来的には加齢卵子の染色体を若い卵子に核移植し, 正常受精を促すことも可能と考えられる. マウスでは老齢マウスの卵子核の幼若齢マウスの卵細胞質への移植により産仔獲得がすでに報告されている 66, 67). 実験動物とヒトでは受胎数や妊娠期間も大きく異なるが, 実験動物で得られた知見は直接的あるいは間接的に ARTに貢献できると思われる. また, 現時点では ART において顕微授精に用いる雄性配偶子として後期 ( 伸張 ) 精子細胞は利用可能だが, 円形精子細胞は安全性の証明が不十分ということで利用されていない. しかしながらマウスでは, 円形精子細胞を培養して伸張精子細胞に分化させ,SOAFの指標である Ca 2+ オシレーションが起きることが確認されている 68) ため, 将来的にはヒトへの応用の可能性が考えられる. KohdaらはARTが個体発生に与える影響について解析を行っている 69). 遺伝的に均一な純系マウスを用いて, 同一の飼育条件, 実験条件で作製した IVFおよびICSI 由来マウスの脳, 肝臓, 腎臓の 3 臓器でおよそ 4 万の遺伝子について DNAマイクロアレイ解析を行い, 自然交配で産出された個体との比較を行った.IVF 由来新生仔は自然交配由来と比較して有意な変化が認められなかった. 一方,ICSI 由来新生仔では2 倍以上発現量が変化する遺伝子が多く認められた. しかしこの変化は生後 8 週間までにほぼ正常に戻り, 次世代への伝達が認められないことが確認された. 今後,ICSI 操作の何が遺伝子発現へ影響しているか明らかにされることが期待される. また, マウスで得られた傾向が異種であるヒトにおいても同様に反映されているかは不明であるが, ヒト ICSI 由来出生児では, このような解析は不可能であるので, 貴重なデータであると言える. 体外培養由来配偶子を用いた顕微授精配偶子の体外培養による作出は生物学的知見あるいは生殖医療の分野で非常に重要である. 顕微授精技術を利用して作出した配偶子から産仔作出能を証明した例が数件報告されている. Yangらは雄性半数体胚より樹立したES 細胞をマウス未受精卵に顕微注入することにより産仔作出に成功し, その繁殖能力も正常であることを明らかにした 70). つまり, 正常な雄ゲノムの情報を持つ半数体細胞であれば精子の代替になることを示している. 著者らは, 本技術の向上により, 遺伝子操作マウス作出が受精卵 ES 細胞を経た従来法に比べ, さらに効率良く産出できると期待している. 一方 Hayashiらは雌雄両方の ES 細胞と ips 細胞からの配偶子形成を報告している 71, 72). 作製した精子は卵子に顕微注入することで, 卵子は体外成熟と IVF を経て産仔作出に成功した. また Matobaらの報告 73) では 12.5 日齢マウス由来の雌雄の始原生殖細胞 (primordial germ cell: PGC) をマウスの腎皮膜下

6 164 J. Mamm. Ova Res. Vol.30 (4), 2013 に移植したところ, 精巣あるいは卵巣様の形態が確認され, それぞれ円形精子細胞と卵核胞期胚 (germinal vesicle: GV) 卵が認められた. この各配偶子を用いて顕微授精すること で, 産仔が得られている. また Sato ら 74, 75) はマウス新生仔 精巣片を器官培養することにより精子形成に成功し, 顕微授 精で産仔を得ている. 詳細については小川の項を参考にされ たい. さらに異種間移植ではウサギ 76), ラット 77) およびブタ 78) の新生仔精巣片をマウスに移植することで精子への発生が 認められ, 顕微授精技術により産仔が得られている. 現段階 ではヒト生殖細胞の体外培養は実験的には容認されている が, 作製した生殖細胞を用いて生殖補助行為をすることは 禁止されている. しかし実験動物で得られたこれらの知見 はヒト ART の参考になることに違いない. おわりに 顕微授精技術は精細胞を人為的に卵子に授精させるとい う単純かつ効果的な技術である. 開発された当初は繁殖, 受 精の仕組みの解明に利用されていたが, 現在では ART の重 要技術として, また実験動物では他の技術と組み合わせるこ とで, あらゆる状況やステージの生殖細胞に対応して胚を作 製できる技術として発展してきた. 現時点では顕微授精の技 術習得に長期間のトレーニングが必要である. 将来的にはマ イクロマニピュレーターの簡素化あるいは画像処理機能等 の簡便化等, 誰でも容易に操作可能な技術に改良することで さらに利用方法が広がることが期待される. 文献 1) Uehara, T. and Yanagimachi, R. (1976): Microsurgical injection of spermatozoa into hamster eggs with subsequent transformation of sperm nuclei into male pronuclei. Biol. Reprod., 15, ) Hosoi, Y., Miyake, M., Utsumi, K. and Iritani, A. (1988): Development of rabbit oocytes after microinjection of spermatozoa. Proceedings of 11th International Congress of American Reproduction, abs ) Goto, K., Kinoshita, A., Takuma, Y. and Ogawa, K. (1990): Fertilisation of bovine oocytes by the injection of immobilised, killed spermatozoa. Vet. Rec., 127, ) Palermo, G., Joris, H., Devroey, P. and Van Steirteghem, A.C. (1992): Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte. Lancet, 340, ) Kimura, Y. and Yanagimachi, R. (1995): Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biol. Reprod., 52, ) Ogonuki, N., Mochida, K., Inoue, K., Matsuda, J., Yamamoto, Y., Takano, K. and Ogura, A. (2003): Fertilization of oocytes and birth of normal pups following intracytoplasmic injection with spermatids in mastomys (Praomys coucha). Biol. Reprod., 68, ) Kato, M., Ishikawa, A., Kaneko, R., Yagi, T., Hochi, S. and Hirabayashi, M. (2004): Production of transgenic rats by ooplasmic injection of spermatogenic cells exposed to exogenous DNA: a preliminary study. Mol. Reprod. Dev., 69, ) Ogura, A., Matsuda, J. and Yanagimachi, R. (1994): Birth of normal young after electrofusion of mouse oocytes with round spermatids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 91, ) Hirabayashi, M., Kato, M., Aoto, T., Ueda, M. and Hochi, S. (2002): Rescue of infertile transgenic rat lines by intracytoplasmic injection of cryopreserved round spermatids. Mol. Reprod. Dev., 62, ) Haigo, K., Yamauchi, Y., Yazama, F., Yanagimachi, R. and Horiuchi, T. (2004): Full-term development of hamster embryos produced by injection of round spermatids into oocytes. Biol. Reprod., 71, ) Kimura, Y. and Yanagimachi, R. (1995): Development of normal mice from oocytes injected with secondary spermatocyte nuclei. Biol. Reprod., 53, ) Ogura, A., Suzuki, O., Tanemura, K., Mochida, K., Kobayashi, Y. and Matsuda, J. (1998): Development of normal mice from metaphase I oocytes fertilized with primary spermatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 95, ) Kimura, Y., Tateno, H., Handel, M.A. and Yanagimachi, R. (1998): Factors affecting meiotic and developmental competence of primary spermatocyte nuclei injected into mouse oocytes. Biol. Reprod., 59, ) Kimura, Y., Yanagimachi, R., Kuretake, S., Bortkiewicz, H., Perry, A.C. and Yanagimachi, H. (1998): Analysis of mouse oocyte activation suggests the involvement of sperm perinuclear material. Biol. Reprod., 58, ) Yazawa, H., Yanagida, K., Katayose, H., Hayashi, S. and Sato, A. (2000): Comparison of oocyte activation and Ca2+ oscillation-inducing abilities of round/ elongated spermatids of mouse, hamster, rat, rabbit and human assessed by mouse oocyte activation assay. Hum. Reprod., 15, ) Ogonuki, N., Sankai, T., Yagami, K., Shikano, T., Oda, S., Miyazaki, S. and Ogura, A. (2001): Activity of a sperm-borne oocyte-activating factor in spermatozoa and spermatogenic cells from cynomolgus monkeys and its localization after oocyte activation. Biol. Reprod., 65, ) Yanagida, K., Yazawa, H., Katayose, H., Kimura, Y., Hayashi, S. and Sato, A. (2000): Oocyte activation induced by spermatids and the spermatozoa. Int. J. Androl., 23 Suppl 2, ) Homa, S.T. and Swann, K. (1994): A cytosolic sperm factor triggers calcium oscillations and membrane hyperpolarizations in human oocytes. Hum. Reprod., 9, ) Dozortsev, D., Rybouchkin, A., De Sutter, P., Qian, C. and Dhont, M. (1995): Human oocyte activation following intracytoplasmic injection: the role of the sperm cell. Hum. Reprod., 10,

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