技術論文 C. DIFF QUIK CHEK COMPLETE にてクロストリジウムディフィシル抗原グルタミン酸デヒドロゲナーゼ GDH 陽性トキシン陰性を示した検体における BD マックス CDIFF を用いた遺伝子検査の有用性松浦成美 1) 山田明輝 1) 佐伯裕二 1)

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そよたなせ
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1 技術論文 C. DIFF QUIK CHEK COMPLETEにてクロストリジウムディフィシル抗原グルタミン酸デヒドロゲナーゼ GDH 陽性トキシン陰性を示した検体における BD マックス CDIFFを用いた遺伝子検査の有用性松浦成美 1) 山田明輝 1) 佐伯裕二 1) 山本成郎 1) 梅木一美 1) 高城一郎 1) 2) 武田展幸 1) 岡山昭彦 1) 2) 1) 宮崎大学医学部附属病院検査部宮崎市清武町木原 ) 宮崎大学医学部内科学講座免疫感染病態学分野要旨 Clostridium difficile CD は抗菌薬投与などにより引き起こされる抗菌薬関連下痢症の原因菌であり接触感染により伝播するため院内感染対策が必要である当院では患者糞便検体からのトキシン産生 CD 検出のため C. DIFF QUIK CHEK COMPLETE アーリアメディカル以下 QUIK CHEK と略すを用いて一次検査を行っている QUIK CHEK でグルタミン酸デヒドロゲナーゼ GDH CD トキシンの検体は培養を行い得られたコロニーで再度 QUIK CHEK による検査を実施し最終報告を行っているが培養には 2 日を要するこの問題を解決するために CD トキシン遺伝子を検出する BD マックス CDIFF 日本 BD の有用性を検討した CD 菌株を用いた BD マックス CDIFFによる CD トキシン遺伝子の検出感度は QUIK CHEK による GDH と同等もしくはそれ以上であったさらに当院で CD トキシン検査の依頼があった 38 検体を用いて検査を行ったその結果 GDH CD トキシンであった 24 検体のうち 22 検体は培養法と BD マックス CDIFFによる CD トキシン遺伝子の結果が一致しほぼ同等の結果が得られた以上のことより BD マックス CDIFFは結果が 90 分と短時間で得られ高感度かつ迅速な CD トキシン検査法として役立つものとして期待されるキーワードクロストリジウムディフィシル培養検査遺伝子検査感染対策よりトキシン AB株トキシン AB I はじめに株トキシン AB株の 3 つに分類される 3) トキシンを産生する CD 株は抗菌薬関連下痢 Clostridium difficile CD は偏性嫌気性グラム陽性症の原因菌であり芽胞を形成しアルコールに抵抗桿菌で健常人でも数%が腸内に保菌している抗性で環境中に長期間生存できるため院内感染の原菌薬投与などにより腸内の正常細菌叢が減少し異因菌として重要である 1) 常増殖した CD がトキシン A 腸管毒およびトキ当院ではイムノクロマトグラフィー法を測定原シン B 細胞毒を産生することにより病原性を発理とした C. DIFF QUIK CHEK COMPLETE アーリ揮する 2) CD はそれぞれのトキシン産生の有無にアメディカル以下 QUIK CHEK と略すを用いて平成 29 年 9 月 6 日受付平成 30 年 4 月 2 日受理医学検査 Vol.67 No

2 便中 CD トキシン検査および分離菌株の CD トキシトキシン検査実施依頼のあった患者の便検体 38 検ン検査を行っている QUIK CHEK は菌体抗原であ体を使用したまず便検体を QUIK CHEK を用いるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ GDH 及び CD て GDH および CD トキシンを測定した QUIK トキシン A および B の両毒素を検出することがで CHEK で GDH CD トキシンと判定されきる 3), 4) しかし CD トキシンは GDH と比べ産生た検体については CD の選択培地である CCMA 培量が少ないため QUIK CHEK で GDH CD トキ地 EX で 2 日間嫌気培養し発育したコロニーを用シンの場合 CD トキシン非産生 CD 株の存在いて QUIK CHEK で再検査を行った本研究は宮崎あるいは CD トキシンが検出感度以下なのかの判断大学医の倫理委員会の承認を得て実施したが難しいそのため QUIK CHEK で GDH CD 3 臨床検体の BD マックス CDIFF測定トキシンの結果が得られた場合には CD 培養前述した便 38 検体を BD マックス CDIFFを用を行って分離菌株の CD トキシン検査を行う必要がいて CD トキシン遺伝子を検出した便検体を 10 ある 3) 当院でも QUIK CHEK で GDH CD ト μl ループで 1 白金耳採取し専用のサンプルチューブキシンの結果が得られた場合には便検体をに入れよく混和しサンプルとして用いた測定は CD 選択培地である CCMA 培地 EX 日水製薬で機器の手順書に従い操作を行った嫌気培養し発育したコロニーについて QUIK CHEK を用いて分離菌株の CD トキシン検査を行い最終判 III 結果定としているしかし培養には 2 日を要し結果報 1 QUIK CHEK および BD マックス CDIFFの検出告までに日数を要する一方 BD マックス CDIFF 日本ベクトンディッ感度キンソン株式会社はリアルタイム PCR 法を用い QUIK CHEK の GDH と CD トキシンおよび BD て便検体から直接 CD トキシン遺伝子を感度よく検マックス CDIFFの検出感度を Table 1 に示す QUIK 出できることが報告されており 5), 6) 結果判定までの CHEK の GDH は推定菌濃度 CFU/mL まで時間も大幅に短縮できる本法は便中 CD トキシ QUIK CHEK の CD トキシンは推定菌濃度ン B をコードする遺伝子をリアルタイム PCR 法で CFU/mL まで BD マックス CDIFFは推定菌濃度 3.0 検出する我々は BD マックス CDIFF を QUIK 105 CFU/mL まで陽性と判定された CHEK および培養法と比較しその有用性について 2 臨床検体における QUIK CHEK および BD マッ検討したクス CDIFFの比較検討臨床検体 38 検体における QUIK CHEK および BD II 対象及び方法マックス CDIFF の結果を示す Table 2 その結果 3 検体が QUIK CHEK で GDH CD トキシ 1 QUIK CHEK 及び BD マックス CDIFF の検出ンと判定され BD マックス CDIFFでも陽性感度であった QUIK CHEK で GDH CD トキシン GDH CD トキシンであった CD 株 1 株であった 24 検体のうち件体が BD マックを CCMA 培地 EX に接種して 2 日嫌気培養し発育ス CDIFF陽性件体は BD マックス CDIFF陰性した分離株を用いて再培養を行った再培養して得であった残りの 11 検体は GDH CD トキシられた菌を滅菌精製水でマックファーランド Mcf. ンであり BD マックス CDIFFも陰性であった 1 推定菌濃度 CFU/mL に調整しさらに 3 QUIK CHEK で GDH CD トキシンで 10 倍連続希釈系列を作成したこれらをサンプルとあった臨床検体の CD 培養および BD マックスして QUIK CHEK および BD マックス CDIFF で測 CDIFFの比較定した QUIK CHEK が GDH CD トキシンで 2 臨床検体の QUIK CHEK および CD 培養あった 24 検体について CCMA 培地 EX で培養し 2016 年 7 月から 2017 年 4 月までに当院で CD 452 発育した菌株を用いて QUIK CHEK で CD トキシン松浦他 CD トキシン検査の遺伝子検査法とイムノクロマト法の比較検討

3 Table 1 QUIK CHEK の GDH と CD トキシンおよび BD マックス CDIFFの検出感度 QUIK CHEK BD マックス CDIFF 推定菌濃度 CFU/mL GDH* CD トキシン CD トキシン遺伝子滅菌精製水 * GDH グルタミン酸デヒドロゲナーゼ Table 2 臨床検体 38 検体における QUIK CHEK および BD マックス CDIFF の結果 BD マックス CDIFF QUIK CHEK GDH* CD トキシン GDH CD トキシン GDH CD トキシン 3 7.9% 31.6% % % 3 7.9% % % % % % * GDH グルタミン酸デヒドロゲナーゼ Table 3 QUIK CHEK で GDH CD トキシンの結果が得られた 24 検体の培養法と BD マックス CDIFFの結果 CD 培養* 陽性 CD 培養陰性感度 92% BD マックス CDIFF陽性 BD マックス CDIFF陰性特異度 92% * CD 培養 Clostridium difficile 培養の産生を調べたその結果 CD 培養陽性 BD マッ GDH は米国病院疫学学会米国感染症学会 SHEA/IDSA のガイドラインで CD の一次スクリーニングとして採用されている 7) 西尾ら 3) によると GDHは培養検査陰性と完全に一致し GDH の場合には培養検査は不要と考えられることを報告している症例数は少ないが我々の結果も同様であった当院でも QUIK CHEK で GDHの場合には CDとし培養検査は行っていない QUIK CHEK で GDH CD トキシンの結果が得られた場合には CD トキシン産生 CD 株が存在すると考クス CDIFF 陰性および CD 培養陰性 BD マックスえ速やかに担当医と感染対策チーム infection control CDIFF 陽性が各 1 検体認められた Table 3 team; ICT に報告を行っておりこの結果が感染対 IV 考察 CD は抗菌薬関連下痢症の原因菌であり CD トキシンを産生する CD が病原性を有する本菌は芽胞を形成しアルコールに抵抗性があるためベッドやトイレなど病院施設の環境中に長期間生存可能であることから院内感染対策上特に注意すべき細菌であり迅速な感染対策と治療が重要となる医学検査 Vol.67 No 策にも反映されている QUIK CHEK において CD トキシンでも培養法で陽性となることがありその陽性一致率は 41 86%と低いことが報告されている 3), 8) そのため QUIK CHEK で GDH CD トキシンの結果が得られた場合 CD トキシン非産生 CD 株あるいはトキシン産生が検出感度以下の両者の可能性があるため CD 培養を実施して発育した菌株を用いて CD トキシンを検査する必要がある当院では GDH CD トキシンであっ 453

4 た患者は培養結果が得られるまでトキシン陽性患者入した今後迅速かつ効率的な CD トキシン検査のとして扱い感染対策を行ってきたしかしながら実施が診療や院内感染対策に活用されると期待され CD 培養には 2 日を要するため CD 培養で陰性の結る果が得られた患者にとって結果として不要な 2 日間の隔離を招くことになるこのため迅速な検査法 V 結語であるリアルタイム PCR 法を測定原理とする BD マックス CDIFFを検討した 5), 6), 9) BD マックス CDIFFを用いることで高感度かつ BD マックス CDIFF の検出感度迅速に CD トキシン陽性の結果を得られることから CFU/mL は QUIK CHEK の CD トキシン 3.0 迅速な結果報告が可能となり感染対策および治療に 108 CFU/mL より 1,000 倍 QUIK CHEK の GDH 貢献できるものと期待される CFU/mL より 10 倍高く高感度であった QUIK CHEK で GDH CD トキシンの 24 検体において BD マックス CDIFFは培養法に対して感度特異度ともに 92%であった一方で培養法陰性の 1 検体が BD マックス CDIFFで陽性培養法陽性の 1 検体が BD マックス CDIFF で陰性を示した不一致の原因として培養法陽性で BD マックス CDIFFが陰性の例ではコロニーの発育はわずか 1 個であった検体中の CD の菌数が少なく検出感度以下であったものと推定された CD トキシン遺伝子を検査するにあたり BD マックス CDIFFR の検出感度や偽陽性偽陰性反応の可能性に留意すべきである 10) また検討に用いた検体の性状を観察すると粘性の便や血液の混入している便もみられたこのような性状の便は PCR 反応が阻害され正しい結果を得られない可能性があるため白金耳で採取する前に検体をよく混和するもしくは滅菌水を加えて均一にする必要があると考えられた以上の点を考慮しても BD マックス CDIFFが培養法と比較して 2 日間検査時間が短縮されること検出感度が QUIK CHEK の CD トキシンおよび GDH より高感度であったことから臨床的に有用であると考える以上の結果から QUIK CHEK でスクリーニングを実施し GDH CD トキシンと判定された検体について CD トキシンの遺伝子を検出することの有用性が示された当院では 2017 年 3 月より便検体において QUIK CHEK で GDH CD トキシンであった場合培養検査に代わり BD マックス文献 1) 大木まゆみ他酵素抗体法迅速キットによる Clostridium difficile トキシン検出検査と毒素産生性 C. difficile の分離培養との比較検討日本臨床微生物学雑誌 2013; 23: ) 神谷茂ディフィシル感染症の基礎と臨床モダンメディア 2010; 56: ) 西尾美津留他 C. DIFF QUIK CHEK COMPLETE における GDH 抗原検出の有用性評価医学検査 2014; 63: ) Quinn CD et al.: C. Diff Quik Chek Complete enzyme immunoassay provides a reliable first-line method for detection of Clostridium difficile in stool specimens, J Clin Microbiol, 2014; 48: ) Le Guern R et al.: Evaluation of a new molecular test, the BD Max Cdiff, for detection of toxgenic Clostridium difficile in fecal samples, J Clin Microbiol, 20; 50: ) Verhoeven PO et al.: Evaluation of the new CE-IVD marked BD MAX Cdiff Assay for the detection of toxigenic Clostridium difficile harboring the tcdb gene from clinical stool samples, J Microbiol Meth, 2013; 94: ) Cohen, SH et al.: Clinical practice guidelines for Clostridium difficile infection in adults: 2010 update by the Society for Healthcare Epidemiology of America (SHEA) and the Infectious Diseases Society of America (IDSA), Infect Control Hosp Epidemiol, 2010; 31: ) 山本由香梨他 C. DIFF QUIK CHEK コンプリートによる Clostridium difficile 抗原およびトキシン A/B 検出の評価と運用について医療と検査機器試薬 2013; 36: ) Yoo J et al.: Evaluation of 3 automated real-time PCR (Xpert C. difficile assay, BD MAX Cdiff, and IMDx C. difficile for Abbott m2000 assay) for detecting Clostridium difficile toxin gene compared to toxigenic culture in stool specimens, Diagn Microbiol Infect Dis, 2015; 83: ) Shin BM et al.: Evaluation of Xpert C. difficile, BD MAX Cdiff, IMDx C. difficile for Abbott m2000, and Illumigene C. difficile assays for direct detection of toxigenic Clostridium difficile in stool specimens, Ann Lab Med, 2016; 36: 本論文に関連し開示すべき COI 状態にある企業等はありません CDIFFを用いた検査法をルーチン法として新たに導 454 松浦他 CD トキシン検査の遺伝子検査法とイムノクロマト法の比較検討

5 Technical Article Usefulness of genetic test for Clostridium difficile toxin gene using BD MAX CDIFF in combination with immunochromatography, C. DIFF QUIK CHEK COMPLETE Narumi MATSUURA 1) Yuji SAEKI 1) Kazumi UMEKI 1) Nobuyuki TAKEDA 1) Akiteru YAMADA 1) Ikuo YAMAMOTO 1) Ichiro TAKAJO 1) 2) 1) 2) Akihiko OKAYAMA 1) Clinical Laboratory, University of Miyazaki Hospital (5200, Kihara, Kiyotake-cho, Miyazaki , Japan) 2) Department of Rheumatology, Infectious Diseases and Laboratory Medicine, Faculty of Medicine, University of Miyazaki Summary Clostridium difficile is a pathogen causing antibiotics-associated colitis. Appropriate infection control for patients with C. difficile is required to prevent nosocomial infection. Immunochromatography with C. DIFF QUIK CHEK COMPLETE (Aerial Medical) (QUIK CHEK), which detects C. difficile-specific glutamate dehydrogenase (GDH) and toxins (CD toxins), is used as the screening test for C. difficile infection. It has been reported that the sensitivity of QUIK CHEK in detecting CD toxins in stool is relatively low. Therefore, when samples test positive for GDH but negative for CD toxins using QUIK CHEK, stool samples are processed for bacterial culture. If C. difficile colonies are obtained, they are tested for CD toxins by the same assay. However, it takes about 2 days for colonies to form, thus delaying the diagnosis of C. difficile infection. To solve this problem, we conducted real-time PCR analysis to detect the CD toxin B gene using BD MAX CDIFF (Becton, Dickinson and Company). The sensitivity of BD MAX CDIFF in detecting the CD toxin B gene was shown to be higher than or equal to that of QUIK CHEK to detect GDH of C. difficile. When we tested 38 clinical samples, 24 samples tested positive for GDH but negative for CD toxin B, and the results of 22 of them tested using BD MAX CDIFF almost agreed with those obtained using QUIK CHEK. Taken together, BD MAX CDIFF is considered as a quick and useful tool for the confirmation of the presence of CD toxins in samples. Key words: Clostridium difficile, the bacterial culture, genetic test, infection control (Received: September 6, 2017; Accepted: April 2, 2018) 医学検査 Vol.67 No

Clostridium difficile 毒素遺伝子検査を踏まえた検査アルゴリズム

Clostridium difficile 毒素遺伝子検査を踏まえた検査アルゴリズム委員一般社団法人日本臨床微生物学会理事長賀来満夫感染症領域新規検査検討委員会委員長三鴨廣繁副委員長栁原克紀石井良和大楠清文大塚喜人大曲貴夫國島広之鈴木広道細川直登柳沢英二 Ⅰ. 背景 Clostridium difficile 感染症 (CDI) は腸管内において毒素産生 C. difficile