細胞周期 cell cycle と細胞分裂 テーマ 1 セルサイクル制御概観 テーマ 2 セルサイクル制御発見小史 テーマ 3 細胞骨格と細胞分裂 参考書 細胞周期の分子生物学

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1 細胞周期 cell cycle と細胞分裂 テーマ 1 セルサイクル制御概観 テーマ 2 セルサイクル制御発見小史 テーマ 3 細胞骨格と細胞分裂 参考書 細胞周期の分子生物学

2 対立的な実験事実 生物群に応じて制御メカニズムは異なるのか ドミノモデルの主潮流 出芽酵母のcdc変異遺伝学 DNA複製が停止すれば分裂しない 末端事象の順序の厳密な依存性 依存経路 時計モデルの主潮流 カエル等初期胚の卵割 DNA複製を阻害しても分裂する セントラルタイマーによる制御 独立経路 この対立は80年代半ばまで続く

3 時計モデルとドミノ 将棋倒し モデル

4 モデル対立の統合的解決 制御メカニズムは真核生物に普遍的なものであった ドミノモデルからの研究 p34cdc2キナーゼの発見 時計モデルからの研究 MPFとサイクリンcyclinの発見 MPFの精製 MPF = p34cdc2キナーゼ + cyclin Bの発見 両モデルの分子的共通性 両モデルで何が異なるのか チェックポイント概念の導入 時計モデルの対象 胞胚期中期まで はチェックポイント欠落 統合 80年代末 2.セルサイクル制御の基本的枠組みの統一見解

5 2 セルサイクル制御の基本的枠組み ❶セルサイクルエンジン 自律的に振動し その位相に応じて末端事象を誘起 ON信号 ❷末端事象 成長 複製 分裂など細胞周期の巨視的事象 最下流の事象 ❸チェックポイント 末端事象の未了 不良をチェックし エンジンを停止させる機構

6 末端事象の未了や不良が細胞周期エンジンを停止 ECB18-3

7 テーマ2 セルサイクル制御発見小史 1 MPF機能とサイクリンB機能 実体の発見 い MPF機能の発見 ろ サイクリンの発見 は サイクリンB機能の解明 2 p34cdc2キナーゼの機能と普遍性 に 出芽酵母CDC28がStart 分裂酵母cdc2がStartとM突入に必要 ほ cdc2遺伝子はp34cdc2キナーゼをコード へ p34cdc2キナーゼ活性はセルサイクルとともに周期変動 と 出芽酵母cdc2遺伝子は分裂酵母 ヒトにも 3 MPFの精製 ち MPF サイクリンB p34cdc2キナーゼ 4 チェックポイント概念の提唱 り ドミノモデルと時計モデルの統合

8 テーマ2 セルサイクル制御発見小史 1 MPF機能とサイクリンB機能 実体の発見 い MPF機能の発見 ろ サイクリンの発見 は サイクリンB機能の解明 ECB p 解明への手がかり 2 p34cdc2キナーゼの機能と普遍性 に 出芽酵母CDC28がStart 分裂酵母cdc2がStartとM突入に必要 ほ cdc2遺伝子はp34cdc2キナーゼをコード へ p34cdc2キナーゼ活性はセルサイクルとともに周期変動 と 出芽酵母cdc2遺伝子は分裂酵母 ヒトにも 3 MPFの精製 ち MPF サイクリンB p34cdc2キナーゼ 4 チェックポイント概念の提唱 り ドミノモデルと時計モデルの統合

9 い MPF機能の発見 顕微注射 1971 by Y. Masui & C. L. Markert Maturation Promoting Factor Mitosis Promoting Factor 成熟分裂促進因子 有糸分裂促進因子

10 GREAT EXPERIMENTS The discovery of MPF Yoshio Masui In: CELLS (B. Lewin ed.) EXPT:

11 Figure 3 Maturation-promoting factor activity in the oocyte cytoplasm during maturation and early development. The horizontal axis indicates the age of the oocyte (hours since treatment with progesterone) and the vertical axis the concentration of MPF activity in its cytoplasm. (Fig. 10 of 1582: Masui, Y. and Markert, C. L. (1971). Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes. J. Exp. Zool. 177, Google Scholar)

12 MPF活性の上昇にも M 期への突入にもタンパク質 合成は必須である 1983 MPF振動は核 中心小体 微小管とは独立に生ずる 1960 1984

13 G2 arrest 排卵 500/生涯 Prophase arrest 出生時 思春期 70万 200万 4万 Adapted from Murray, A. W. & Kirschner, M. W. (1989) Dominoes and Clocks: The Union of the Two View of the Cell Cycle. Science 246, 細胞周期の分子生物学より

14 MPFは機能的タンパク質として発見されたが その分子的実体は不明のまま残された MPFの機能 maturation (mitosis) promoting MPFの挙動 M期に最高となる形で周期的に変動 MPFの分子的実体 精製できないので不明

15 増井禎夫 細胞と人間のサイエンス 細胞周期の主要な制御因子の発見 2001年 ノーベル生理学 医学賞 何故 ノーベル賞受賞とならなかったのか 山中博士のiPS細胞作成の基礎的知見を発見したガー ドン博士は同時受賞した

16 Expt by Gurdon (1962) Procedure used to obtain mature frogs from the intestinal nuclei of Xenopus tadpoles. The wild-type egg (with two nucleoli per nucleus; 2-nu) is irradiated to destroy the maternal chromosomes, and an intestinal nucleus from a marked (1-nu) tadpole is inserted. In some cases, there is no cell division; in some cases, the embryo is arrested in development; but in other cases, an entire new frog, with a 1-nu genotype, is formed. (After Gurdon 1968,Gurdon 1977.) From: Evidence for Genomic Equivalence

17 テーマ2 セルサイクル制御発見小史 1 MPF機能とサイクリンB機能 実体の発見 2 p34cdc2キナーゼの機能と普遍性 に 出芽酵母CDC28がStart 分裂酵母cdc2がStartとM突入に必要 ほ cdc2遺伝子はp34cdc2キナーゼをコード へ p34cdc2キナーゼ活性はセルサイクルとともに周期変動 と 出芽酵母cdc2遺伝子は分裂酵母 ヒトにも 3 MPFの精製 い MPF機能の発見 ろ サイクリンの発見 は サイクリンB機能の解明 ち MPF サイクリンB p34cdc2キナーゼ 4 チェックポイント概念の提唱 り ドミノモデルと時計モデルの統合

18 ろ サイクリンの発見 RIラベル実験 1983 by T. Hunt 機能未知タンパク質の セルサイクルに応じたリズミカルな変動 GREAT EXPERIMENTS The discovery of cyclins Tim Hunt In: CELLS (B. Lewin ed.) EXPT:

19 ウニ受精卵 連続ラベル実験 受精直後に35Sメチオニンを投与 し 時間を追って反応を止め SD Sゲル電気泳動にかけてタンパク 質を分離した cyclin バンドのみ周期的に変 動した Evans, T., Rosenthal, E. T., Youngblom, J., Distel, D., and Hunt, T. (1983). Cyclin: a protein specified by maternal mrna in sea urchin eggs that is destroyed at each cleavage division. Cell 33, Google Scholar

20 連続ラベル実験で分かること 新規合成 de novo合成 の有無 合成は定常的だが 分解は周期的 合成は周期的だが 分解は定常的 正味合成量の最大 合成量 分解量最小 新規合成量及び正味合成量の最大 分解量

21 ウニ受精卵 パルスラベル実験 受精直後から様々な時間に10分だ け35Sメチオニンをパルス投与した どの時間にパルス投与しても cyclin 合成量はほとんど同じ cyclin量の周期変動が周期的な cyclin分解に起因することが判明 もし 特定の時期にだけ合成される なら その時期だけにラベルcylinが 検出されるはず Evans, T., Rosenthal, E. T., Youngblom, J., Distel, D., and Hunt, T. (1983). Cyclin: a protein specified by maternal mrna in sea urchin eggs that is destroyed at each cleavage division. Cell 33, Google Scholar

22 テーマ2 セルサイクル制御発見小史 1 MPF機能とサイクリンB機能 実体の発見 い MPF機能の発見 ろ サイクリンの発見 は サイクリンB機能の解明 サイクリンの機能は ろ の段階では不明 ①卵細胞抽出液を用いたin vitro実験系の開発 1983 ②サイクリンB添加によるセルサイクル再開 1989 ③サイクリンB破壊による間期停止 1989 ④サイクリンB破壊抑制によるM期停止 M期脱出の抑制 1989

23 は サイクリンB機能の発見 ①卵細胞抽出液を用いたin vitro実験系の開発 Masui & Lohka (1983) On addition, sperm nuclei decondense then their DNA undergoes an essentially normal round of DNA replication Extract can complete 3-5 cycles Cycle time ~2 x that of intact eggs MBC17-9

24 は サイクリンB機能の発見 ②サイクリンB添加によるセルサイクル再開 Murray & Kirshner (1989) Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cyle. Nature 339: Google Scholar サイクリンBだけを合成する条件で M期突入ができ る サイクリンB合成はM期突入の十分条件 次の図 RNaseで すべてのmRNAを破壊した後 RNase阻害剤を添加してサイクリンmRNA を添加

25 細胞周期の分子生物学より

26 細胞周期の分子生物学より

27 は サイクリンB機能の発見 ③サイクリンB破壊による間期停止 Minshull, Blow & Hunt (1989) Translation of cyclin mrna is necessary for extract of Xenopus eggs to enter mitosis. Cell 56: Google Scholar サイクリンB合成だけを抑制する条件で in vitro セル サイクルは間期に停止する セルサイクルが止まる サイクリンB合成はM期突入の必要条件 次の図 アンチセンスオリゴヌクレオチドでサイクリンB mrnaを処理し RNaseHにて これを特異的 に破壊 セルサイクルは停止

28 細胞周期の分子生物学より

29 細胞周期の分子生物学より

30 は サイクリンB機能の発見 ④サイクリンB分解の抑制 M期脱出抑制 Murray, Solomon & Kirshner (1989) The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity Nature 339: Google Scholar サイクリンB分解だけを抑制する条件で M期脱出を 抑制できる サイクリンB分解はM期脱出の必要条件 次の図 サイクリンB N末端の90個のアミノ酸残基を 欠失させるmRNAを作成し in vitroセルサイ クル系に添加する サイクリンは分解されず に増え続け M期に突入できるが脱出できな い

31 細胞周期の分子生物学より

32 テーマ2 セルサイクル制御発見小史 1 MPF機能とサイクリンB機能 実体の発見 い MPF機能の発見 ろ サイクリンの発見 は サイクリンB機能の解明 2 p34cdc2キナーゼの機能と普遍性 に 出芽酵母CDC28がStart 分裂酵母cdc2がStartとM突入に必要 ほ cdc2遺伝子はp34cdc2キナーゼをコード へ p34cdc2キナーゼ活性はセルサイクルとともに周期変動 と 出芽酵母cdc2遺伝子は分裂酵母 ヒトにも 3 MPFの精製 ち MPF サイクリンB p34cdc2キナーゼ 4 チェックポイント概念の提唱 り ドミノモデルと時計モデルの統合

33 2 p34cdc2キナーゼの機能と普遍性 酵母のcdc遺伝学の系譜から に 出芽酵母CDC28がStart 分裂酵母cdc2がStartとM突入に必要 ほ cdc2遺伝子はp34cdc2キナーゼをコード へ p34cdc2キナーゼ活性はセルサイクルとともに周期変動 と 出芽酵母cdc2遺伝子は分裂酵母 ヒトにも

34 に 出芽酵母CDC28がStart 分裂酵母cdc2がStartとM突入に必要 二種の酵母を用いた遺伝学 将棋倒しモデル GREAT EXPERIMENTS Cell cycle genes Lee Hartwell In: CELLS (B. Lewin ed.) EXPT:

35 出芽酵母 Saccharomyces cervisiae ECB1-32

36 Adapted from Cell cycle genes by Lee Hartwell

37 レプリカ平板法 温度感受性変異株 temperature-sensitive mutant ts-mutant の分離 ECB1-35

38 Figure 5. Normal cells and cdc mutant cells several hours after incubation at the restrictive temperature. (A) wild type, (B) cdc8 (C) cdc24 (D) cdc10. Adapted from Nobel Lecture by Hartwell 2001

39 Synopsis of Hartwell s cell cycle pathway diagram (~1975) ファージ形態形成に模した順序的な依存経路 将棋倒しモデル 最重要な遺伝子はcdc28 (Start) 出芽 DNA複製 紡錘体極 中心体centrosomeに相当 は互いに独立 有糸分裂サイクルは細胞質分裂や出芽がなくても回転

40 に 出芽酵母CDC28がStart 分裂酵母cdc2がStartとM突入に必要 二種の酵母を用いた遺伝学 将棋倒しモデル GREAT EXPERIMENTS The discovery of cdc2 as the key regulator of the cell cycle Paul Nurse In: CELLS (B. Lewin ed.) EXPT:

41

42 WT wee

43 細胞周期の分子生物学より

44 分裂酵母 Schizosaccharomyces pombe のセルサイクル Adapted from Biology of The Cell (2006) 98:

45 細胞周期の分子生物学より

46 細胞周期の分子生物学より

47 細胞周期の分子生物学より

48 細胞周期の分子生物学より

49 二重変異で正常に戻っている 細胞周期の分子生物学より

50 細胞周期の分子生物学より Nurseらは cdc2 とcdc13 がM期突入の律速段階であること M期突入に必須であること を解明 Genetic control of cell size at cell division in yeast. Nature 256, (1975) Google Scholar

51 まとめ 出芽酵母 CDC28がStartに必要 Hartwell group (1977) 分裂酵母 cdc2 がStartとG2/M転換に必要 Nurse group (1981) Nurse groupは次に cdc2遺伝子を単離し その実体を解明

52 2 p34cdc2キナーゼの機能と普遍性 酵母のcdc遺伝学の系譜から に 出芽酵母CDC28がStart 分裂酵母cdc2がStartとM突入に必要 ほ cdc2遺伝子はp34cdc2キナーゼをコード へ p34cdc2キナーゼ活性はセルサイクルとともに周期変動 と 出芽酵母cdc2遺伝子は分裂酵母 ヒトにも

53 ECB10-10, 11

54 cdc2ts cdc2遺伝子がcdc2ts変異株を相補する遺伝子として単離された 配列が決められ タンパク質キナーゼ活性をもつことも判明した 細胞周期の分子生物学より

55 2 p34cdc2キナーゼの機能と普遍性 酵母のcdc遺伝学の系譜から に 出芽酵母CDC28がStart 分裂酵母cdc2がStartとM突入に必要 ほ cdc2遺伝子はp34cdc2キナーゼをコード へ p34cdc2キナーゼ活性はセルサイクルとともに周期変動 と 出芽酵母cdc2遺伝子は分裂酵母 ヒトにも

56 出芽酵母 CDC28がStartに必要 Hartwell group (1977) 分裂酵母 cdc2 がStartとG2/M転換に必要 Nurse group (1981) 相補性テストにより 分裂酵母 cdc2 出芽酵母 CDC28 (82) ヒトcdc2 (87) by Nurse group

57 Cdc2Pはp34cdc2 キナーゼ その活性はセルサイクルに応じて周期的に変動 (by Nurse group, 84-87) 細胞周期の分子生物学より

58 時計モデルとドミノ 将棋倒し モデル

59 テーマ2 セルサイクル制御発見小史 1 MPF機能とサイクリンB機能 実体の発見 い MPF機能の発見 ろ サイクリンの発見 は サイクリンB機能の解明 2 p34cdc2キナーゼの機能と普遍性 に 出芽酵母CDC28がStart 分裂酵母cdc2がStartとM突入に必要 ほ cdc2遺伝子はp34cdc2キナーゼをコード へ p34cdc2キナーゼ活性はセルサイクルとともに周期変動 と 出芽酵母cdc2遺伝子は分裂酵母 ヒトにも 3 MPFの精製 ち MPF サイクリンB p34cdc2キナーゼ 4 チェックポイント概念の提唱 り ドミノモデルと時計モデルの統合

60 Lohka MJ, Hayes MK, Maller JL. (1988) Purification of maturation- promoting factor, an intracellular regulator of early mitotic events. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, Google Scholar Gautier J, Norbury C, Lohka M, Nurse P, Maller J. (1988) Purified maturationpromoting factor contains the product of a Xenopus homolog of the fission yeast cell cycle control gene cdc2+. Cell 54, MPFの実体解明 二つの潮流が 共通のタンパク質 セルサイクルエンジン によって合流した チェックポイント概念の導入 時計モデルとドミノモデ ルの違いの理由が明らかに

61 Masui, Y. (2001) From oocyte maturation to... Differentiation 69: 1-17 Coudreuse, D. & Nurse, P. (2010) Driving the cell cycle... Nature 468: Genetics of cell division cycle (eplantscience.com) The control of septum formation in fission yeast (Genes & Dev : ) Polo-like kinases: a team that plays throughout mitosis (Genes & Dev : ) Cell Cycle Molecules and Mechanisms of the Buddingand Fission Yeasts (IN: Meth Mol Biol vol. 296 by Human Press a huge!!! pdf file) Cell cycle progression markers (Cardoso Lab)

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