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- こうじ ことじ
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2 日本 化 学 療 法 学 会 雑 誌 Sequences of oligonucleotide primers and their NOV.1995 positions in the lyta gene of pneumoniae used in this study. The nucleotide sequences are numbered on the basis of data reported by Garcia P et al, Gene 43: , た 溶 菌 液 の 組 成 は,100mM 1.5mM MgCl, AIWm1, cholate, K/ml, 0.45% bovine 0.1% triton X-100, tween 20, 0.45% チ ュ ー ブ はthermal 94 で10分 Gene 200 nonidet Amp セ ッ ト し,60 cyclerに 55 が30秒,72 つ 加 え た 後, セ ッ ト し て,94 が1分 が30秒, の 条 件 下 で30サ イクルの ル に て 電 気 泳 動 を 行 い,ethidium ガロースゲ bromide染 色 によっ バ ン ドを観 察 し た サ イ ズ マ ー カ ー と し て は,pUC19をMsp PCRの PCRの つ れ も 非 特 異 的DNAフ 1)PCRに ラ グ メ ン トは 認 め ら れ 果 よ る検 出 感 度 今 回 のPCRに 使 用 し た 溶 菌 方 法 と反 応 組 成 液 で の 肺 示す 写 真 か ら も 明 ら か な よ う に,カ ラ ム1 2の1 103 上 の も の で は(+++)の グ メ ン トが 観 察 さ れ,カ 102/mlの 明 瞭 なDNAフ ラ ラ ム3 4の2.3x も の で は(++)と が 観 察 さ れ,カ 102/mlの Iで 切 断 し た も の を 用 い た ど か ら抽 出 用 い た ブ ラ イマ ー で の特 異性 に 関す る検 討 なかった CFU/ml以 こ の よ う に し て 得 ら れ た サ ン プ ル は3%ア coli, Klebsiella aeruginosaな 炎 球 菌 の 検 出 感 度 を2に 幅を行った てDNAの し たDNAを sanguis, Escherichia Paeudomonas II.結 ュー ブ を取 ラ イ マ ー 混 合 液 を 各5μlず 再 びthermal 9600 salivarius, pneumoniae, で20分, の 溶 菌 操 作 を 行 っ た 次 に,チ り 出 し て,ブ DNA増 cycler( Cetus)に mitis, serum で は,い Perkin-Elmer 5) (ph8.9), あ る6) PCR用 R: KC1,500,μg sodium μg proteinase P-40で Tris-HCI 80mM 0.1% ラ ム5 6の も の で は,EB染 し たDNAフ ラグメ ン ト 接 種 菌 量 色 を 忠 実 に 行 え ばDNAフ ラ 感度 感 度測 定 に は化 膿 性 髄 膜 炎 か ら分 離 され た血 清 型19型 broth の 肺 炎 球 菌 を 用 い た 10mlのTodd (TH broth: Difco)に Hewitt 被 検 菌 を 接 種 し,co 下 に て18時 間 前 培 養 し た 翌 日,こ 10mlのTH brothに 植 え つ ぎ,さ の1 mlを ら に2時 間培 養 し た 菌 液 を 原 液 と し た 菌 液 の 希 釈 方 法 は,TH い て10倍 希 釈 で2管 行 い,そ 培養 新鮮 な brothを れ 以 降 は2倍 用 希 釈 を10 段 階行 っ た 増 幅 さ れ たDNAの 表 記 に つ い て は,マ と し て 用 い たpUC19のMsp トの1番 目(501 bp)と2番 目(488 さ に 匹 敵 す る 濃 度 を(+++),3番 番 目(331bp)の 目(147bp)と8番 の を(+)と な お,こ ー カー サ イ ズ I切 断 のDNAフ ラグメ ン bp)の 目(404 断片の濃 bp)と4 濃 さ に 匹 敵 す る も の を(++),7番 目(111bp)の し た(2参 濃 さ に 匹 敵す る も 照) こ に は 示 し て い な い が,ブ pyogenes, ド ウ 球 菌, agalactiae, 2. Sensitivity of PCR pneumoniae. in detecting the lyta gene of
3 V0L. 43 N0.11 PCRに グ メ ン トは(+)で 観察可能で あった (++)は23例(8.0%)に つ ま り,本 法 に よ る肺 炎 球 菌 の検 出 感 度 は, CFU/ml前 2)培 養 とPCRの 成績 体 につ い の 成 績 を示 す 図 の 下 方 に培 餐 成 績 と増 幅 さ れ たDNAフ 体 につ い て 成 績 と,同 時 に 実 施 した培 養 成 績 の 関係 を示 す 縦 軸 はPCR後 (+++)の のDNA量 養 で肺 炎球 菌 が 認 め られ ず 陰 性 と判 定 し た も の をnegativeと あ る PCR(+++)の (19.8%)に して 表 して も の は288例 認 め られ たが,培 養 でpo8itiveと た もの は そ の う ち の38例(66.7%)で た 肺 炎 球 菌 の 菌 量 とPCRに わ ち,10μlの 中57例 判 定 され あ っ た PCR 養 で の菌陽性 例 は 成績 との 関 係 陽 性 と 判 定 さ れ た118例 係 を5に に つ い て.検 よ っ て得 られ た 成 績 との 関 検 体 培 養 で 培 地 上 に100 も全 例(+++)と 地 上 に10 colony以 3. Agarose 273-bp specimens DNA gel electrophoresis fragment of the of an lyta gene 体 で は,1例 throat 4. Correlation between by PCR and the results Correlation bacterial cololly以 し た13検 な 上 の 体 は, colony以 下の肺炎球 菌が 養 で(++) がPCR(++)で あ っ た が, amplified from by PCR. 5. 上,す 判 定 さ れ て い た 次 い で培 上 100 検 出 さ れ( CFU/ml),培 と し た10検 出 され 示 す 検 出 菌 量 が104CFU/ml以 コ ロ ニ ー の 発 育 が み ら れ,(+++)と PCRで 中118 あった 量 とPCRの PCRで 性 例 は288例 な っ た の に 対 し,培 中59例(20,5%)で 3)菌 区分 で 表 し,各 区 分 につ い て は培 養 で肺 炎 球 菌 が検 出 され た もの をpositive,培 あ った 例(41.0%)と に も と つ く(-) 例 はその う で は 培 養 で もす べ こ れ ら を 合 計 す る と,PCR隅 288例 あっ た 養po8itiveの で あ っ た PCR(-)例 てnegativeで れ 判 定 さ れ た もの は 過 ぎ な か っ た PCR(+)で ち の15例 ラ グ メ ン トの 判 定 を 記 した 4に こ の よ う に して 観 察 した288検 のPCRの ら の 症 例 に お い て も培 養po日itiveと も の は38例(13.2%)で,培 実 際 に送 付 され て き た検 体 の14検 て 実 施 され たPCR後 お い て 認 め られ た が.こ 6例(26.1%)に 後 以 上 とな っ た 3に 1033 よる肺 炎球 菌の 検出 between cell counts. the presence the presence of bacterial of the lyta gene by PCR and of the lyta gene cultures.
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5 5) Garcia P, Garcia K L, Garcia E, Lopez R: Nucleotide sequence and expression of the pneumococcal autolysin gene from its own promoter in Escherichia coli. Gene 43: , ) Ubukata K, Nakagami S, Nitta A, Yamane A, Kawakami S, Sugiura M, Konno M: Rapid detection of the meca gene in methicillin-resistant Staphylococci by enzymatic detection of polymerase chain reaction products. J. Clin. Microbiol. 30: ) Zhang Y, Isaacman D J, Wadowsky R M, Rydquist-White J, Post J C, Ehrlich G D: Detection of pneumoniae in whole blood by PCR. J. Clin. Microbiol. 33: , ) Rudolph K M, Parkinson A J, Black C M, Mayer L W: Evaluation of polymerase chain reaction for diagnosis of pneumococcal pneumonia. J. Clin. Microbiol. 31: , ) Hassan-king M, Baldeh I, Secka O, Falade A, Greenwood B: Detection of pneumoniae DNA in blood cultures by PCR. J. Clin. Microbiol. 32: , ) Gillespie S H, Ullman C, Smith M D, Emery V: Detection of pneumoniae in sputum samples by PCR. J. Clin. Microbiol. 32: , ) Virolainen A, Salo P, Jero J, Karma P, Eskola J, Leinonen M: Comparison of PCR assay with bacterial culture for detecting pneumoniae in middle ear fluid of children with acute otitis media. J. Clin. Microbiol. 32: , 1994 Direct and rapid detection of pneumoniae in clinical specimens by PCR Atsumi Igarashi1), Tomoko Muraki1), Kimiko Ubukata1), Masatoshi Konno1), Hiromi Nakano2) and Akio Yamane2) Department of Clinical Pathology, Teikyo University, 1) School of Medicine, Tokyo, Japan 2) Wakunaga Pharmaceutical Co., Ltd., Hiroshima We assessed the direct detection of pneumoniae in clinical samples using the polymerase chain reaction (PCR) method. A total of 288 throat swab specimens were collected from children with acute respiratory infection. A set of primers for the PCR was designed to amplify the region between position 694-bp and 966-bp in the autolysin gene (lyta), which is specific for S. pneumoniae. The sentitivity of detection was 1.2 ~ 102 CFU/ml. The PCR procedure, including pretreatment of the sample, took about 2.5 hours. Bacterial cultures were performed from the same specimen in parallel with the PCR to compare the individual detection efficiencies. Cultivation revealed S. pneumoniae in only 59 (20.5%) of the 288 specimens, whereas the PCR revealed 188 (41.1%) to be positive. PCR was also positive in all samples containing at least 103 CFU/ml of bacteria. An obvious DNA fragment was detected by PCR in some culture-negative samples. These results suggest that PCR is clinically useful for detecting S. pneumoniae directly.
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想 像 思 行 ず 消 毒 擦 む 薄 血 混 じ 滲 み ぶ 痂 ぶ 取 下 薄 来 経 験 沢 山 お 思 健 常 人 間 元 々 備 能 力 中 具 的 何 起 ょ 簡 単 説 明 ず 人 間 負 部 リ ン パ 球 血 小 板 マ ク ロ フ ァ ジ 悪 食 べ 集 死 溶 食 べ 清 浄 一 肉 作 線 維 芽 作 表 活 発 肉 芽 コ ラ ゲ ン 線 維 呼 増 殖 埋 縮 併 進 先
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