Fig. 1 Preparation of RNA 1) 4.2 M Guanidium thiocyanate, 25 mm Tris-HC1 ph 8.0, 0.5% Sarkosyl 2) 1 M tris-hc1 ph 8.0, 100mM EDTA ph 8.0, 10% SDS Tabl
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- ありさ あみおか
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1 Key words: PCR, influenza virus, detection of HA gene, rapid diagnosis
2 Fig. 1 Preparation of RNA 1) 4.2 M Guanidium thiocyanate, 25 mm Tris-HC1 ph 8.0, 0.5% Sarkosyl 2) 1 M tris-hc1 ph 8.0, 100mM EDTA ph 8.0, 10% SDS Table 1 Origonucleotide primers for PCR amplification of influenza viruses 1) The nuclotide bases are numbered according to the positive strand sequence of A/PR/8/34 (H1N1) HA gene6). 2) The nuclotide bases are numbered according to the positive strand sequence of A/Aichi/2/68 (H3N2) HA gene9). 3) The nuclotide bases are numbered according to the positive strand sequence of B/Great Lakes/54 HA gene11)
3 森下 高行 他 946 を 加 え,全 量20μlと し43,60分 間 イ ソ キ ュベ ー 液50μ1を ト した. cdna20μlの HCl 接 種 し,初 う ち10μlを 使 用 し た.PCR反 終 濃 度:PCR reation ph8.3,50mm pairs,1.25u buffer 10mM KC1,1.5mM (M/V)gelatin,200μM MgCl2,0.01% 間 で35サ cler: Perkin HA特 系 で さ ら にPCRを イ ク ル 実 施 し,さ Elmer, 異DNAバ Cetus, を 示 し た.さ USA) ロダク 衝 液 に て 作 製 し た1.5%ア ガ ロ ー ス ゲ ル を 用 い 電 気 泳 動 を 行 っ た 後,EtBr染 色 に よ りHA特 5)PCRの chuan/2/87,b型 か らRNAを 用 い1stPCRを 検 出感 度 行 うこ とに よ り 異DNAバ ン ドの 検 出 が 可 今 回 我 々が 作 製 し た プ ラ イ マ ーを 使 々 が 分 離 し た ウ イ ル ス と標 準 株3種 ウ イ ル ス は450basesに,AH3型 ル ス は727basesに,B型 ウイ ウ イ ル ス は549basesに れ ぞ れ の 培 養 上 清 を10 れ ぞ れ の プ ラ イ マ ーを 行 い さ ら に2ndPCRを ち ウ イ ル スHA特 は110pfu/50μ1の の ア ガ ロース ゲ ル電 気 泳 動 像 を 示 し た.AH1型 で の 希 釈 液 を 作 製 し50μl 調 整 し た.そ は200pfu/50μ1,AH3 ライマーの特異性 のPCR後 養 上 清 を 使 用 し ブ ラ ッ ク法 に よ り ウ イ ル ス 力 価 を 測 定 し た.そ 果 ら に2ndPCRを でHA特 用 し 近 年,我 ウ イ ル スA/ ウ イ ル ス はA/Si- 段 階 希 釈 し ま pfu/50μ1ま Fig.2に ウ イ ル スB/Yamagata/16/88 のMDCK培 り50μlの AH1型2.Opfu/50μ1,AH3型3.5pfu/50μ1,B型1.1 2)プ 検 出感 度 使 用 し た ウ イ ル ス はAH1型 目の 能 と な っ た. 異 バ ン ドの 検 出 を 行 っ た. Yamagata/120/86,AH3型 物 か ら5μlと お い てAH1型 型 は350pfu/50μ1,B型 Thermalcy, ン ドの 検 出 はPCRプ ト10μ1をTBE緩 実 施 し た.1回 ラ イ マ ーの 検 出感 度 1stPCRに ら に72, らRNAを 異 バ ン ドが 検 出 さ れ な か っ 結 1)プ 間, よ るHA 行 っ た, 間 イ ン 間,55,2分 7分 間 イ ン キ ュ ベ ー トし た.(DNA 作 製 しPCRを 物 か らHA特 た 検 体 に つ い て はPCR産 primer 度 設 定 ぱ94,5分 キ ュ ベ ー ト し た 後94,1分 抽 出,cDNAを が い 認 め られ な か っ 継 代 し た.PCRに 遺 伝 子 の 検 出 は う が い 液 か ら50μlか PCR産 Polymerase(TAKARA))50 μlの 系 で 行 っ た.温 72,3分 Tris- dntps,0.5μm Taq 応 胞 を 使 用 し,う 代 でCPEの た 検 体 に つ い て は2代 4)PCR 液(最 ウ イ ル ス の 分 離 はMDCK細 異DNAバ Fig. 2 Agarose gel electrophoresis analysis of HA gene 行 った の ン ドの 検 出 を 行 っ た. 6)プ AH1型 ライ マ ーの 特 異 性 はA/PR/8/34,A/FM/1/47,A/NJ/8/ 76,A/Bangkok/10/83,A/Yamagata/32/89, AH3型 はA/Victoria/3/75,A/Philippines/2/ 82,A/Hukuoka/CL29/85,A/Sichuan/2/87,A/ Aichi/1/91,B型 はB/Lee/40,B/Kagoshima/1/ 68,B/Virtoria/2/87,B/Yamagata/16/88,B/ Aichi/1/90ま 上 清50μlを 7)う るHA遺 で の そ れ ぞ れ5種 類 のMDcK培 養 使 用 し た. が い 液 か ら の ウ イ ル ス 分 離 とPCRに よ 伝 子 の検 出 1986年 か ら91年 の 問 に イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス 集 団 発 生 よ り得 ら れ た うが い 液63件 を 使 用 し た. 感 染症 学 雑誌 第66巻 第7号
4 Table 2 Specificity of primer for PCR 1) 450 base pair band was visible when samples were amplified using AH1 primers. 2) 727 base pair band was visible when samples were amplified using AH3 primers. 3) 549 base pair band was visible when samples were amplified using B primers. 4) No visible band was detected Table 3 Comparison for detection of influenza virus in gargle between virus isolation and PCR 1) Samples were obtained from the outbrake of influenza (AH1, AH3, B) in school children. 2) Virus isolation was carried out using MDCK cells. 3) HA gene was detected by ethidium bromide staining after agarose gel electrophoresis.
5 1) Berg, P. A., Yolken, R. H., Ronnard, S. I., Dolin, R., Murphy, B. R. & Straus, S. E.: New enzyme immunoassays of influenza A/Victria/3/75 virus in nasal wash-es. Lancet, 1: , ) Coonrod, J. D., Karathanasis, P. F. & Donofio, J. C.: Enzyme-linked immunosorbent assay of core antigen for clinical diagnosis of influenza. J. Med. Virol., 25: , ) Daisy, J. A., Lief, F. S. & Friedman, M. H.: Rapid diagnosis of influenza A infection by direct immunofluoresence of nasopharyngeal aspirates in adult. J. Clin. Microbiol., 9: , ) Katz, J. M., Wang, M. & Webster, R. G.: Direct sequencing of HA gene of influenza (H3N2) virus in original clinical samples reveals sequence identity with mammalian cell-grown virus. J. Virol., 64: , ) Yamada, A., Imanishi, J., Nakajima, E., Nakajima, K. & Nakajima, S.: Detection of influenza virus in threat swab by using polymerase chain reaction. Microbiol. Immunol., 35: , 1991.
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60 1 pp.3-8 2010 1. H1N1 1) 2) 3) 4) ERATO 2009 H1N1 21 H1N1 HA PB2 2009 3 Pandemic H1N1 2009 WHO 6 11 21 2009 11 2010 4 21 H1N1 H1N1 2009 4 15 CDC 108-8639 4-6-1 TEL: 03-5449-5281 FAX: 03-5449-5408 E-mail:
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イタリア 各 都 市 における 滞 在 税 ( 宿 泊 税 )の に 関 して 平 素 は 格 別 の お 引 き 立 て を 賜 り 誠 に 有 難 う ご ざ い ま す こ の 度 2 0 1 1 年 1 月 1 日 よ り ロ ー マ に お い て ご 宿 泊 の お 客 様 を 対 象 に 滞 在 寄 付 金 ( C o n t r i b u t o d i S o g g i o r
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Shigetaka KATOW 2009 4 24 WHO 5 9 1 5 16 1 TV 6 12 6 11 WHO 6 4 5 12 E-mail : modern_media@eiken.co.jp 2009. 4. 28. http:idsc.nih.go.jpidwrkanjaweeklygraph01flu.html 0101-0051 - RIKEN Center of Research
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22 610407487 ロ ペ ミ ッ ク 小 児 用 0. 0 5 % 2319001C1072 23 610412059 ゲ シ ン L 錠 5 0 m g 2478001G1046 24 610412105 ソ レ ル モ ン S R カ プ セ ル 3 7. 5 m g 1147002N1
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59 1 pp.53-58 2009 1. H5N1 3 H5N1 2007 1 2 2008 4 5 2003 H5N1 2005 50 1 429 262 2009 5 22 2 680-8553 4 101 TEL/FAX : 0857-31-5437 E-mail: toshiito@muses.tottori-u.ac.jp 3 H5N1 1 A A A 54 59 1 4 A A 5 1997
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19 610406260 フ ェ ネ ル ミ ン 錠 鉄 5 0 m g 3222013F1068 20 610406267 プ リ ン ド リ ル 細 粒 1 % 1179028C1031 21 610406339 リ ザ ス ト 錠 3 m g 4420001F1040 22 610406350
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の と す る (1) 防 犯 カ メ ラ を 購 入 し 設 置 ( 新 設 又 は 増 設 に 限 る ) す る こ と (2) 設 置 す る 防 犯 カ メ ラ は 新 設 又 は 既 設 の 録 画 機 と 接 続 す る こ と た だ し 録 画 機 能 付 防 犯 カ メ ラ は
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2) Goetz, A., Tsuneishi, N.: Application of molecular filter membranes to the bacteriological analysis of water, J. Am. Water Works Assn., 43 (12): 943-969,1951. 3) Clark, H.F. et al.: The membrane filter
血 清 気 管 ク ロ ア カ ス ワ ブ : 各 10 検 体 細 菌 検 査 心 肺 肝 脾 全 血 顔 面 腫 脹 部 皮 下 ス ワ ブ を 血 液 寒 天 DHL 寒 天 チ ョ コ レ ー ト 寒 天 に ス タ ン プ 37 24 ~ 48 時 間 好 気 微 好 気 培 養 ウ イ
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23 シロア リ腸 内共生系 カ ラ ー 図2シ whole ロ ア リ共 生 原 生 生 物(Dinenympha exilis)の cellハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン に よ る 同 定 腸 内 の共 生原 生 生 物 か ら得 たEF-lα す る 配列 をFrTCラ ゼ を結 合 させ た抗FITC抗 い 矢 じ りはD,exilisを,小 バ ー は50μmに 遺 伝 子
400 46 THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS 65 6 Dec. 2012 LVFX 100 mg 3 / 7 150 mg 2 / 7 2 2006 2008 9 LVFX PK PD 2009 7 100 mg 1 3 500 mg 1 1 AUC/MIC
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