Key words : two-step PCR, Mycoplasma pneumoniae, throat swab Mycoplasma pneumoniae-mac, Mycoplasma buccale, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma genitali
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- きみとし ちゅうか
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1 Key words : two-step PCR, Mycoplasma pneumoniae, throat swab Mycoplasma pneumoniae-mac, Mycoplasma buccale, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma orale, Mycoplasma penetrans, Mycoplasma primatum, Mycoplasma salivarium, Acholeplas- laidlawii, Ureaplasma urealyticum, Bacillus ma subtilus, Escherichia coli, Enterococcus faecalis,
2 二 段 階PCRに Stmphylococcu 2. 記 載 に従 って培 養 1995年 に,神 奈 川 県 の 結 核 感染 症サー 者50名 染 を疑 わ お よ び イ ン フル エ ン ザ ウ イ ル ス 感 染 を 疑 わ れ た96名 の 急性 呼 吸 器 疾 患 患 者 な らび に健 常 所 への搬入 過 程 に お け る ト ラ ブ ル に よ り 凍 結(-20 )融 3. 繰 り返 し た57例 解 も併 せ て 使 用 し た. ラ イ マ ー お よ び耐 熱 リ メ ラ ー ゼ1Uよ り成 り,二 次PCR反 応 液 に は プ ラ イ マ ー 濃 度 を50nMと 用 し た.一 次PCRは PCRは 反 応 液40μlに 反 応 液45μlに 一 次PCR産 々 全 量 を50μlと し た.増 下 流 プ ラ イ マ ー は 一 次PCRと 次PCRに マ ー は,M.Pneumoniae遺 る こ と がSasakiら7)に 次 物 の5μlを 試 幅 反 応 は一 次 お よ び72 物 ガ ロー ス ゲ ル を使 用 した 電 気 泳 同 用 いたプ ライ 伝 子 を特 異 的 に増 幅 す 分離培養 M.pnezamoniae分 離培 養 の試料 には咽頭 ス ワ ブ 絞 り液 を 使 用 し,分 板 培 地 で9),同 離 培 養 は 二 層 培 地 と寒 天 平 定 は抗 血 清 に よ る発 育 阻 止 試 験 で 行 っ た12). よ り確 認 さ れ て い る. 結 一 次PCR;5/GCAAGTCGATCGAAAGTA- 1. 果 特 異 性 と感 度 Fig.1に GT3' は 既 報4)8)に 従 っ た. 5. 次 お よ び 二 次PCRに 用 い た プ ラ イ マ ー の 塩 基 配 列 は 下 記 の 通 りで あ る じ も の を 使 用 し た.尚,二 した もの を使 試 料10μl,二 2分 を30サ イ ク ル"の 条 件 で 実 施 し た.PCR産 の 解 析 は1.5%ア 較 の た め に 実 施 し た 一 段 階PCR法 伝 子領 域 の一 部 を プ ラ イ マ ー と し た.一 次PCRの,10mMTris- 動 と エ チ ジ ウ ム ブ ロ マ イ ド染 色 に よ り行 っ た.比 プライマー M.pneblmoniaeの16SrRNA遺 が,二 応 液 は50mMKCl お よ び 二 次 共 に"94 1分,59 1.5分 染 の 集 団 発 生 事 例(1995年) に お い て 採 取 さ れ た 咽 頭 ス ワ ブ で,当 性DNAポ 料 と し,各 よ り採 取 さ れ た 咽 頭 ス ワ ブ を 使 用 し た.ま た,M.pneumoniae感 を3回 一 次PCR反 0.2mMd-NTP,31.25nMプ ベ イ ラ ン ス に お い てM.pneumoniae感 れ た322名 743 HCI(pH9.0),0.1%TritonX-100,2mMMgCI2, 験 に 供 し た. 咽頭 ス ワブ 1992年 検 出 べ る た め に 使 用 し た. saureus こ れ ら の 菌 株 をSasakiら7)の し,実 よ るM.pneumoniaeの 示 す よ う に,二 段 階PCRで807bpの 5'ATTTGCTCACTTTTACATGCTGGCG3 Fig. 1 Specificity of two-step for M. 二 次PCR;5'GAATGACTTTAGCAG- pneumoniae. Lane 1, phy marker ; 2, M. pneumoniae-mac; 3, M. buccale; 4, M. fermentans, 5, M. genitalium ; 6, M. hominis ; 7, M. orale ; 8, M. penetrans ; 9, M. GTAATGGCTA3' 5'ATTTGCTCACTTTTACATGCTGGCG3' ま た,比 較 の た め 実 施 し た 一 段 階PCR法 Sasakiら7)お よ びvan Kuppeveldら8)の には 報 告 した faecalis ; 16, Staphylococcus aureus ; 17, no template. プ ラ イ マ ー を使 用 し た. 4. PCR法 咽 頭 ス ワ ブ か ら のPCR試 に 行 っ た.咽 rpm30分 料 の 調 製 は次 の よ う 頭 ス ワ ブ をマ イ コプ ラズ マ 保存 培 地9)中 で 充 分 絞 り 出 し,そ の 絞 り 液1mlを15,000 遠 心 し て 沈 渣 を1%Triton-X加STE 緩 衝 液10)0.1mlに 加 熱 後,急 再 浮 遊 さ せ た.こ れ を100 10分 冷 し てPCR試 料 と した.ま た,上 記各 マ イ コ プ ラ ズ マ お よ び 細 菌 か ら 所 定 の 方 法11)で DNAを 調 製 し,PCRの 平 成10年7月20日 primatum ; 10, M. salivarium ; 11, Acholeplasma laidlawii ; 12, Ureaplasma urealyticum ; 13, Bacillus subtilus ; 14, Eschericha coli ; 15, Enterococcus 特 異 性 あ る い は 感 度 を調
3 岡崎 則男 他 744 M.pneumoniae遺 伝 子 断 片 が 増 幅 さ れ,今 し たM.pneumoniae以 マ11種 の 遺 伝 子 は増 幅 され な か っ 遺 伝 子 検 出 感 度 は,Fig.2に う に1.5fgで 階PCRの 2. 外 の ヒ ト系 マ イ コ プ ラ ズ お よ び 細 菌4種 た.本PCRの 回供 試 あ っ た.尚,比 感 度 は15fgで 示 す よ 較 の た め 実 施 した一 段 あ っ た. Pneumoniae検 出 に お け る 培 養 法 に よ る 成 績 を 示 し た.322例 あ っ た.雑 と分 離 中,PCR法 に よ し て 培 養 法 の そ れ は20 2%で 菌 増 殖 に よ り培 養 検 査 で は 結 果 が 判 明 し な か っ た29例 在 し た.イ 中 にPCR陽 性 が10例(34.5%)存 の 咽 頭 ス ワ ブ の 中 にPCR 陽 性 あ る い は 培 養 陽 性 例 は な か っ た. 3. 一 段 階PCR法 対 し,後 段 階PCRで PCRで 示 し た.前 あ っ た.一 は 陰 性 を 示 し た255例 中,二 陽 性 と な っ た9例(3.5%)が PCR法 で は 陰 性 を 示 し た13例 PCR法 で 陽 性 を 示 し た.更 認 め られ た. p neumonice. Lane 1, phy marker ; 2, 1, 500fg/assay ; 3, 150fg ; 4, 15fg ; 5, 1.5fg ; 6, 0.15fg ; 7, 0.015fg ; 8, negative control. 段 階 が 二 段 階 段 階PCR法 で 定 に 戸 惑 っ た5例 が で は明 瞭 な 陽性 とな っ た. M.pneumoniae感 染 の集 団発 生事 例 で採 取 さ 結 融 解 を3回 繰 り返 し た 後 の 咽 頭 ス ワ ブ よ り 調 整 し た 試 料57例 に つ い て は, 培 養 検 査 で の 陽 性 例 は 認 め ら れ ず,一 (50.9%)が Sensitivity of two-step for M. 中7例 に,一 は 遺 伝 子 増 幅 が 不 十 分 で,判 法 で11例(19.3%)お との 比 較 段 階 養 あ る い は 血 清 抗 体 検 査 でM.pneumon- 段 階PCR よ び で は29例 陽 性 を 示 し た. 考 Fig. 2 者 の 陽 性 率 者 の そ れ は20.8%で れ た 咽 頭 ス ワ ブ で,凍 ン フ ル エ ン ザ を 疑 わ れ た 患 者 由 来96例 お よ び 健 常 者 由 来50例 23.6%に iae感 染 が 証 明 さ れ た に も か か わ ら ず,一 者 咽 頭 ス ワ ブ か ら のM. る 検 出 率 は23.6%そ と 前 報4)で 報 告 し た 一 段 階PCR 法 の 比 較 をTable2に ま た,培 分 離 培 養 法 との 比 較 Table1に,患 は,一 察 回 目 のPCRで 増 幅 した 遺 伝 子 断 片 の 塩 基 配 列 の 内 側 に 設 定 した プ ラ イ マ ー を 使 用 し,再 度PCRに よ る 増 幅 を す る た め,感 度 お よ び 特 異 性 共 に 一 段 階PCR法 る と さ れ る.今 よ り も優 れ て い 回 著 者 ら が 検 討 し たM.pneumo- niae検 出 の た め の DNAを 検 出 で き た が,こ 1 2個 は1.5fgの れ は試 料 中 に存 在 す る のM.pneumoniaeを 検 出可能 で ある こ と を 示 し て お り,十 分 に 満 足 し 得 る 感 度 と 言 え る. 5 50fgと CFUで の 感 度 に つ い て はNaritaら3)が し,石 田 ら1)は1CFUと 表 すPCR感 ら れ る こ と か ら,Naritaら Table 1 Evaluation comparison of two-step with culture of M. Pneumoniae from method throat in 報 のPCRは swabs Table 2 detection with result other was not reliable due の 報 告 と比 較 す る と本 よ り 高 い 感 度 を 持 っ と言 え る.一 方 for the detection Evaluation comparison *Culture 報 告 し て い る. 度 は 正 確 性 に 欠 け る と考 え to of two-step with single-step of M. pneumoniae in for the from swabs throat contamination bacteria. 感 染 症 学 雑誌 第72巻 第7号
4 2) Kai M, Kamiya S, Yabe H, Takakura I, Shiozawa K, Ozawa A : Rapid detection of Mycoplasma pneumoniae in clinical samples by polymerase chain reaction. J Med Microbiol 1993 ; 38 : ) Narita M, Matsuzono Y, Togashi T, Kajii N : DNA dignosis of central nervous system infection by Mycoplasma pneumoniae. Pediatrics 1992 ; 90 : ) Skakni L, Sardet A, Just J et al. : Detection of Mycoplasma pneumoniae in clinical samples from pediatric patiens by polymerase chain reaction. J Clin Microbiol 1992 ; 30 : ) Tjhie JHT, van Kuppeveld FJM, Roosendaal R et al. : Direct PCR enables detection of Mycoplasma pneumoniae in patients with respiratory tract infections. J Clin Microbiol 1994 ; 32 :
5 7) Sasaki Y, Shintani M, Shimada T, Watanabe H, Sasaki T : Detection and discrimination of Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma genitalium by in vitro DNA amplification. Microbiol Immunol 1992 ; 36 : ) van Kuppeveld FJM, van der Logt JTM, Angulo AJ et al. : Genus- and species-specific identification of mycoplasmas by 16S rrna amplification. Appl Environ Microbiol 1992 ; 58 : ) Jensen JS, Schndergard-Andersen J, Uldum SA, Lind K : Detection of Mycoplasrna pneurnoniae in simulated clinical samples by polymerase chain reaction. APMIS 1989 ; ) Wilson K : Preparation of genomic DNA from bacteria. In : Ausubel FM et al, ed. Current protocols in molecular biology, Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York, 1990 ; 1 : Mycoplasma pneumoniae Detection from Throat Swab by Two-Step Polymerase Chain Reaction Norio OKAZAKI & Shiro YAMAI Kanagawa Prefectural Public Health Laboratories, Department of Bacteriology and Pathology Yuko SASAKI & Tsuguo SASAKI National Institute of Infectious Desease, Department of Safety Research on Biologics Two-step polymerase chain reaction (PCR) with primers designated against 16S rrna gene of Mycoplasma pneumoniae for diagnosis of infection was evaluated in cmparison with the conventioal single-step PCR and culture methods. The two-step showed specific amplification of M. pneumoniae DNA and higher sensitivity (1.5 fg/assay) than the single-step. With the two-step, 76 of 322 throat swabs (23.6%) from patients with acute respiratory complaints gave positive results whereas 20.2% were positive in the culture method. Seven of 13 samples which were negative in the single-step but positive in either serological or the culture method showed positive results by the two-step. In addition, 5 samples which were weakly positive in the single-step showed distinctly positive results in the two-step PCR. These results indicate that the two-step is a useful tool for detection of M. pneumoniae in clinical specimens, although it requires a relatively sophisticated in technique.
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