Cancer 26: (2017)

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かずひろひろなが
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1 Cancer 26: (2017) Carcinological Society of Japan オウギガニの胃咀嚼器断面観察による年齢査定の試み報告 A preliminary investigation of the direct age determination using band counts in the gastric mill of the xanthid crab Leptodius exaratus (H. Milne Edwards, 1834) 森川英祐 1 渡邊隆司 1 * 1 浜崎活幸 Eisuke Morikawa, Ryuji Watanabe and Katsuyuki Hamasaki はじめに年齢査定は水産資源の適切な利用を進めるうえで基礎的な調査項目であるが, 最近まで甲殻類は年齢形質として有効な硬組織 ( 鱗, 耳石, 脊椎骨, 貝殻など ) を持たないと考えられてきた. このため, 甲殻類の年齢は体サイズの頻度分布におけるモード解析, 飼育による脱皮成長量の把握, 蛍光性色素リポフスチンの頻度分布解析などにより推定されてきた ( 渡邊ら,2012). 特に蛍光性色素リポフスチンは, 加齢とともに一定の速度で蓄積していくため, 近年ではリポフスチン解析による年齢推定が広く利用されている. しかし, リポフスチン解析による年齢推定は1 個体の年齢を直接査定できるものではなく, また対象種は加入時期が1 年の中で明確に分けられる種に限定される (Bluhm & Brey, 2001). さらに, 水温をはじめとする環境要因によってリポフスチンの蓄積量は変化することが知られている (Wahle et al., 1996). このため, 甲殻類の新たな年齢形質が長年にわたって探索されてきた. このような中で, 最近, 胃小骨の一部である胃咀 1 東京海洋大学海洋生物資源学部門東京都港区港南 Department of Marine Biosciences, Tokyo University of Marine Science and Technology, Konan, Minato, Tokyo , Japan * 現所属 (Present address):( 株 ) サンケイ分析センター東京都豊島区東池袋 Sankei Analysis Center, Higashi-Ikebukuro, Toshima, Tokyo , Japan 嚼器 (gastric mill) あるいは眼柄 (eyestalk) が甲殻類の年齢形質として報告された (Leland et al., 2011; Kilada et al., 2012, 2016; Kilada & Ibrahim, 2016). これは胃咀嚼器あるいは眼柄の切断面を観察した際, 内クチクラ層に年齢を示すバンドを確認できるというものである. なお, 甲殻類各種の胃咀嚼器の形態の比較および機能の詳細については田崎 (1995) に詳しい. この手法を用いた年齢査定が, ズワイガニ Chionoecetes opilio, ホンホッコクアカエビ Pandalus borealis ( ともに Kilada et al., 2012), タイワンガザミ Portunus pelagicus (Kilada & Ibrahim, 2016), ナンキョクオキアミ Euphausia superba(kraft et al., 2016) などで行われている. しかし, これまで広く用いられてきたリポフスチンによる年齢推定結果との比較を行なった事例は報告されていない. オウギガニLeptodius exaratus (H. Milne Edwards, 1834) は岩礁やサンゴ礁に生息する十脚目, 短尾下目, オウギガニ科に属するカニ類であり, わが国においては房総半島から八重山列島に, さらにはインド西太平洋にかけて広く分布している ( 三宅,1983). 本種は東京海洋大学水圏科学フィールド教育研究センター館山ステーション ( 千葉県館山市 ) 地先の潮間帯にも多く生息しており, 繁殖期などの生活史特性および成長に関する研究事例がいくつか報告されている. 特に渡邊ら (2012) は館山湾で得られた本種を用いてリポフスチン解析による年齢推定を行い, その結果本種は雌が4 年級群, 雄が5 年級群に分けられることを報告した. そこで本研究では, 館山湾にて採集したオウギガニを用いて胃咀嚼器断面日本甲殻類学会 Report 53

森川英祐渡邊隆司浜崎活幸観察による年齢査定を行ない, 先行研究であるリポフスチン解析による年齢推定結果との比較考察を試みた. 材料と方法採集 2016 年 7 月 20 日 ~22 日にかけて, 東京海洋大学水圏科学フィールド教育研究センター館山ステーション地先の潮間帯にて, オウギガニの雌 19 個体と雄 29 個体を採集した.

2 森川英祐渡邊隆司浜崎活幸観察による年齢査定を行ない, 先行研究であるリポフスチン解析による年齢推定結果との比較考察を試みた. 材料と方法採集 2016 年 7 月 20 日 ~22 日にかけて, 東京海洋大学水圏科学フィールド教育研究センター館山ステーション地先の潮間帯にて, オウギガニの雌 19 個体と雄 29 個体を採集した. 採集個体は研究室に持ち帰り, 腹節幅から雌雄を判別した後, ノギスを用いて甲幅を0.05 mmの精度で測定した. 測定後の個体は冷凍保存した. 年齢査定本研究で用いた年齢査定方法は以下のとおりである. なお, 基本的な操作は増田ら (2003) による魚類の耳石処理の手法を参考にした. 解剖オウギガニを解凍したのち, 腹節との接合部の両端から眼窩にかけて背甲を切断除去し, 胃を取り出した. 取り出した胃は蒸留水中で解剖して胃壁, 胃内容物, 筋肉組織などの不要な部分を取り除き, 胃咀嚼器 ( 胃小骨のうち尾噴門骨 (urocardiac), 中央噴門骨 (mesocardiac), 翼噴門骨 (pterocardiac), 対噴門骨 (zygocardiac) を含む部分 ) をエタノールグリセリン液 (70% エタノール,26% 蒸留水,4% グリセリン ; 以下, 保存液と記載する ) に液浸した. 得られた胃咀嚼器は顕微鏡 (SMZ800, Nikon 社製 ) で観察し, その観察像をデジタルカメラ (DS-Fi1, Nikon 社製 ) で撮影, 保存し, 画像解析ソフト (NIS-Elements, Nikon 社製 ) を用いて翼噴門骨長および尾 / 中央噴門骨長を測定した ( 図 1). 樹脂包埋バンドの観察には胃咀嚼器の対噴門骨を用いた. なお主に左側の対噴門骨を使用し, 左側が欠損等していた場合は右側を使用した. 保存液から取り出した対噴門骨は室温で約 1 時間乾燥させ, エポキシ樹脂に包埋した. 包埋にはエポキシ樹脂および硬化剤 (Epofix, いずれもStruers 社製 ) を重量比 17 : 2で混合したものを使用した. 混合した樹脂はシリコーン離型剤 (KF412SP, 信越化学工業 ) を吹き付けたテフロン製の樹脂包埋用モールド (Teflon 図 1. 腹側から観察したオウギガニの胃咀嚼器と各部名称および測定部位 ( 横両矢印が翼噴門骨長, 縦の両矢印が尾 / 中央噴門骨長 ). mounting moulds ϕ20 mm, PRESI 社製 ) に流し込み, 乾燥させた試料を, ピンセットを用いて樹脂中に包埋した. エポキシ樹脂に包埋した試料は直ちに恒温器に入れ,30 で12 時間静置して樹脂を硬化させ, 樹脂包埋用モールドから取り出した. 樹脂研磨および観察包埋した樹脂は電動の刃物研磨機 ( モデル9820, マキタ製作所製 ) を用いて研磨し, 対噴門骨の横断面を露出させた. なお, 荒削りには耐水ペーパー ( 粒度 320 番 ) および粒度 60 番の砥石を, 仕上げには粒度 1000 番の砥石を用いた. 研磨を終えた試料は, 樹脂表面の凹凸による乱反射を抑えるため保存液中に液浸し, そのまま検鏡に供した. 観察にはNikon 社製 SMZ800 実体顕微鏡を使用し, 内クチクラ層のバンドを計数した. また, 観察像はNikon 社製 DS-Fi1デジタルカメラによって撮影, 記録した. 相対成長解析甲幅と翼噴門骨長および尾 / 中央噴門骨長の関係を相対成長式 (1) によって解析した. 相対成長式の aは初期成長定数,b は相対成長係数とよばれ,MS- Excelの回帰分析で推定したbが1より有意に大きい場合は優成長, 小さい場合は劣成長, 有意差がない場合は等成長とした. また, 相対成長式の雌雄差を, 統計解析ソフトRのlm 関数を用いた共分散分析によって検定した. y=ax b (1) 54 Cancer 26 (2017)

3 胃咀嚼器によるオウギガニの年齢査定の試み成長様式得られた年齢情報から雌雄別に3つの成長式 (von Bertalanffy 式,Gompertz 式,Logistic 式 ) を求めた. 成長式のパラメータ推定は統計解析ソフトRのnls 関数を用いて行なった. 各式は赤嶺 (2016) に従い, 以下の (2)~( 4) 式に示すとおりである. 推定するパラメータの持つ意味は各式によって異なるが,tと l は共通して年齢および極限体長を表す. またvon Bertalanffy 式におけるcは, 理論上の体長が0 mmのときの年齢を表している. なお採集した個体の年齢は, オウギガニの抱卵個体が6 月から確認されること (Than Than Lwin, 2008) から, 観察されたバンド数に0.2を足したものと仮定して計算した. von Bertalanffy 式結果相対成長解析採集したオウギガニの甲幅の頻度分布を図 2に示す. 甲幅の平均値 ± 標準偏差は, 雌で17.6±3.4 mm, 雄で20.5±7.3 mmであった. 翼噴門骨長と尾 / 中央噴門骨長は甲幅にともない大型化し ( 図 3), それぞれの甲幅に対する相対成長は, 雌では等成長 ( それぞれp=0.09, p=0.8), 雄では劣成長 ( それぞれp= 0.002, p=0.01) を示した. 次に, 雌雄で比較すると, 甲幅と翼噴門骨長の相対成長式では, 切片, 傾きともに雌雄差がみられ ( それぞれp=0.02, p<0.001), 雌の切片が小さく傾きが大きかった. 甲幅と尾 / 中央噴門骨長の相対成長式では, 雌の切片は雄より大 l(t)=l *(1-exp(-k(t-c))) (2) Gompertz 式 l(t)=l *exp(-e -k(t-c) ) (3) Logistic 式 l(t)=l /(1+exp(-k(t-c))) (4) 図 2. 採集したオウギガニの体長組成ヒストグラム. 図 3. オウギガニの甲幅と翼噴門骨長および尾 / 中央噴門骨長の関係. Cancer 26 (2017) 55

森川英祐渡邊隆司浜崎活幸きく有意差がみられたが (p<0.001), 傾きでは有意差はみられなかった (p=0.1). 年齢査定内クチクラ層のバンドは雄 1 個体を除く47 個体 ( 雌 19 個体, 雄 28 個体 ) で観察された ( 図 4). バンド数は, 雌では0~3 本, 雄では0~5 本であり, 甲幅はバンド数にともない大きくなる傾向がみられた ( 表 1).

4 森川英祐渡邊隆司浜崎活幸きく有意差がみられたが (p<0.001), 傾きでは有意差はみられなかった (p=0.1). 年齢査定内クチクラ層のバンドは雄 1 個体を除く47 個体 ( 雌 19 個体, 雄 28 個体 ) で観察された ( 図 4). バンド数は, 雌では0~3 本, 雄では0~5 本であり, 甲幅はバンド数にともない大きくなる傾向がみられた ( 表 1). なお, 対噴門骨断面におけるバンドの観察部位は個体によって異なるため, バンド間の長さを測定することはできなかった. また, バンドが確認できなかった1 個体は, 採集時に外骨格が柔らかく, 脱皮直後の個体であった. 成長様式成長式 (2)~( 4) のパラメータ推定結果を表 2に示す. 雄では3つのパラメータを推定できたが, 雌では値が収束せず, パラメータを推定することができなかった. このため, 本研究ではcに雄の値を代入することによりl およびkの値を推定し, 参考値とした. 得られた結果を成長式に代入し, 各成長曲線を図 5に示す. 実測した年級群の範囲でみると, 雌雄とも3つの式で同様の成長曲線を示し,2 年級群以降は雄が雌の成長を上回っていた. 考察図 4. オウギガニの対噴門骨断面観察像 ( 雄個体, 甲幅 26.5 mm). 黒矢印は外内クチクラ層境界, 白矢印は内クチクラ層に形成されたバンドを示し, バンドは0から計数した. 胃咀嚼器の長さである翼噴門骨長と尾 / 中央噴門骨長は雌雄とも成長にともない大型化したが, 雌では両サイズともに等成長を示したのに対し, 雄ではどちらも劣成長であった. したがって, 雌では体の成長と胃咀嚼器の成長率が同じであるが, 雄では表 1. オウギガニの胃咀嚼器の対噴門骨断面に観察されたバンド数と体サイズの関係. バンド数雌 (n=19) 雄 (n=28) 個体数平均甲幅 (mm) 標準偏差個体数平均甲幅 (mm) 標準偏差表 2. オウギガニの雌雄別に推定した各成長式のパラメータ. 成長式 l k c 雌 von Bertalanffy Gompertz Logistic 雄 von Bertalanffy Gompertz Logistic 雌はすべてのパラメータを推定できなかったため,c に雄で推定した値を代入してその他の値を推定した. 56 Cancer 26 (2017)

胃咀嚼器によるオウギガニの年齢査定の試み図 5. 推定したvon Bertalanffy 式,Gompertz 式, Logistic 式によるオウギガニの成長曲線. 徐々に胃咀嚼器の成長率が鈍くなっていくといえる. このことは, 雌は雄に比べて生殖腺の発達に大きなエネルギーを投資するため, 雄よりも多くの餌を摂取する必要があるのかもしれない.

5 胃咀嚼器によるオウギガニの年齢査定の試み図 5. 推定したvon Bertalanffy 式,Gompertz 式, Logistic 式によるオウギガニの成長曲線. 徐々に胃咀嚼器の成長率が鈍くなっていくといえる. このことは, 雌は雄に比べて生殖腺の発達に大きなエネルギーを投資するため, 雄よりも多くの餌を摂取する必要があるのかもしれない. 本研究では, 胃咀嚼器断面観察による年齢査定法によって, オウギガニの雌では最大 3 本, 雄では最大 5 本のバンドが確認された. また, 脱皮直後の個体では胃咀嚼器にバンドが確認されなかった.Vatcher et al. (2015) は胃咀嚼器が外骨格と同様に脱皮することを明確な写真を用いて示したうえで, 胃咀嚼器は年齢形質として不適切であると結論づけている. 一方で Leland et al. (2015) は, カルセイン染色を施した個体を長期間飼育した結果, 胃咀嚼器の染色された面の外側に新たな層が形成されることを示し, 胃咀嚼器は脱皮によって失われないと報告していることから, 脱皮後の再石灰化の過程でバンドが確認できるようになることも考えられる. 胃咀嚼器におけるバンドの形成メカニズムについては全く解明されていないことから, 今後の検討が望まれる. 雌雄それぞれの成長式に von Bertalanffy 式,Gompertz 式,Logistic 式を適用したところ, いずれの成長式においても2 歳以降では雄が雌の成長を上回り, 大型化することが示された. このことは,Than Than Lwin(2008), 渡邊ら (2012) で報告された体長組成の頻度分布解析によるオウギガニの成長様式と一致していた. ここで, 渡邊ら (2012) によるオウギガニのリポフスチン解析結果 ( 雌 99 個体, 甲幅 12.4~28.3 mm; 図 6. オウギガニの胃咀嚼器による年齢査定法とリポフスチン解析による年齢推定法における各年級群の平均甲幅の比較. エラーバーは標準偏差を示す. 雄 104 個体, 甲幅 11.8~36.7 mm) から, 各年級群の平均甲幅 ( 標準偏差 ) を算出し, 本研究の結果と併せて図 6に示す. なお, オウギガニは生まれた年の 12 月には甲幅が約 12 mmの大きさまで成長することが報告されているため (Than Than Lwin, 2008), リポフスチン解析による年齢推定結果の最小群は本研究における1 歳群に相当するものとした. この結果から, 雌では数値に多少の乖離がみられるものの, リポフスチン解析法と胃咀嚼器断面観察法とによる年齢推定査定結果はほとんど同じ傾向を示すことが明らかになった. このことは, 胃咀嚼器に見られるバンドが年齢を表していることを支持するものである. また, この2 手法による年齢情報の比較から, オウギガニの雄は0~5 歳の6 年級に, 雌は0~4 歳の5 年級群に分けられる. 渡邊ら (2012) は寿命に性差が生じることについて, 繁殖行動にともなうエネルギーの消費によって雌が短命となると考察しており, 本研究で得られた結果は前述の甲幅と胃咀嚼器長の相対成長における性差と合わせて, この説を支持するものと考えられる. 以上, 本研究によって, 胃咀嚼器断面観察によるオウギガニの年齢査定の可能性が示唆された. 今後は個体数を増やして本研究の結果を補強するとともに, 加齢にともなうバンド数の増加について飼育実験等によって確認する必要がある. Cancer 26 (2017) 57

6 森川英祐渡邊隆司浜崎活幸引用文献赤嶺達郎,2016. 水産総合研究センター叢書水産資源解析のエッセンス. 第 4 章水産資源解析のエッセンス. 恒星社厚生閣, 東京,pp Bluhm, B. A., & Brey, T., Age determination in the Antarctic shrimp Notocrangon antarcticus (Pfeffer, 1887) (Crustacea: Decapoda) using the autofluorescent pigment lipofuscin. Marine Biology, 138: Kilada R., Sainte-Marie, B., Rochette, R., Davis, N., Vanier, C., & Campana, S., Direct determination of age in shrimps, crabs, and lobsters. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 69: Kilada, R., & Ibrahim, N. K., Preliminary investigation of direct age determination using band counts in the gastric mill of the blue swimmer crab (Portunus pelagicus Linnaeus, 1758) in two salt-water lakes in the eastern Mediterranean. Journal of Crustacean Biology, 36(2): Kraft, B. A., Kvalsund, M., Søvik, G., Farestveit, E., & Agnalt, Ann-L., Detection of growth zones in the eyestalk of the Antarctic krill Euphausia superba (Dana, 1852) (Euphausiacea). Journal of Crustacean Biology, 36(3): Leland, J. C., Coughran, J., & Bucher, D. J., A preliminary investigation into the potential value of gastric mills for ageing crustaceans. In: Akira Asakura (ed.), New Frontiers in Crustacean Biology: Proceeding of the TCS Summer Meeting, Tokyo, September BRILL, Leiden, pp Leland, J. C., Bucher, D. J., & Coughran, J., Direct age determination of a subtropical freshwater crayfish (redclaw, Cherax quadricarinatus) using ossicular growth marks. PLoS ONE, 10(8): e Doi: /journal.pone 増田育司野呂忠秀,2003. 耳石横断薄層切片を用いた魚類の年齢査定の薦め. 鹿児島大学水産学部紀要,52: 三宅貞祥原色日本大型甲殻類図鑑 (II). 保育社, 大阪,277 pp. 田崎健郎甲殻類の口胃神経系 III その比較生理学. 比較生理生化学,12(4): Than Than Lwin, Population biology of the xanthid crab Leptodius exaratus (H. Milne-Edwards, 1834) in Tateyama Bay, Japan. PhD Thesis, Graduate school of Marine science and Technology, Tokyo university of Marine science and Technology. Vatcher, H. E., Roer, R. D., & Dilaman, R. M., Structure, molting, and mineralization of the dorsal ossicle complex in the gastric mill of the blue crab, Callinectes sapidus. Journal of Morphology, 276: Wahle R. A., Tully, O., & O Donovan, V., Lipofuscin as an indicator of age in crustaceans: analysis of the pigment in the American lobster Homarus americanus. Marine Ecology Progress Series, 138: 渡邊隆司浜崎活幸横田賢史 Strüssmann C. A. 渡邊精一,2012. Lipofuscin を年齢形質としたオウギガニの年級群推定.Cancer, 21: Cancer 26 (2017)

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Microsoft Word Mannual of Fish Population Dynamics-Ver1.doc 4. 魚の成長 - 体長組成と成長曲線 - 4.1 概要魚のサイズは季節や年により変化します資源全体として見たとき成長により1 尾の体重は増加しますが個体数は減少していきます水産資源の有効利用を考えどのサイズの魚を漁獲するかあるいは漁獲を制限するかを提案するためには魚の成長をモデルで表す必要がありますこれが成長曲線です成長曲線をモデルで表すために必要なデータは年齢別の体長や体重です