ISSN CODEN: SZKHF Vol. 46 Tokyo Medical and Dental University Annual Reports of the Institute of Biomaterials and Bioengineering

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かんじにいだ
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2 16 Annual Reports of the Institute of Biomaterials and Bioengineering 46, (2012) トピックス吸着タンパク質の電荷検出と配向評価 Interpretation of Orientation and Conformation of Adsorbed Protein based on Local Net-Charges 合田達郎 * *, 宮原裕二 Tatsuro Goda *, Yuji Miyahara * Abstract Regulation of orientation and conformation of adsorbed protein is important for developing an advanced feature of biomaterials to achieve tissue regeneration and wound healing. However, there have been limited methods on the analysis of higher ordered structure of protein on the surface in situ at the intact state. Herein we focused on sensing of the heterogeneously distributed local net-charges of protein as essential information to interpret molecular structure of adsorbed protein film on a solid surface. A semiconductor-based transistor device enables to direct electrical readout of local innate charges of the protein at the contact phase in a physiological electrolytic environment owing to the predominant counterion screening effect. A comparison of the electric charges with the adsorbed dry and/or wet masses determined by conventional SPR and QCM techniques indicates time- and concentration-dependent variations on the orientation and conformation of the protein in the thin film. Further, we successfully integrated the charge sensor into QCM device to achieve a simultaneous detection of adsorbed charges and mass onto an identical sensor surface in real time. The local chargesensing of protein gives us a feedback for developing designer biomatetrials. Key Words:Protein adsorption; charge detection; orientation; conformation; surface plasmon resonance (SPR); quartz crystal microbalance (QCM); field-effect transistor (FET) 1. はじめに生体材料表面へのタンパク質吸着は血栓形成細胞接着バイオフィルム形成などと密接にかかわっており, 界面科学のみならず, バイオマテリアル科学および組織工学再生医学といった先端学際分野における重要な研究課題である. 人工材料と生体高分子との相互作用を主体的に制御するという目的を達成するにあたり, タンパク質吸着量といった定量的な解析に加えて, 高次構造変化分子配向といった定性的な情報を得る必要がある. タンパク質の吸着状態は外部環境に大きく影響するため, そのままの状態で, リアルタイムに, そして標識分子を用いずに検出する手法が求められる. これらの目的を達成するために, 分光エリプソメトリーや, 表面プラズモン共鳴 (SPR), 水晶発振振動子 (QCM,QCM-D) といった手法が開発され, 誘電率 ( 屈折率 ) 質量水 * 生体材料工学研究所バイオエレクトロニクス分野 Dept. of Bioelectronics, Div. of Medical Devices Institute of Biomaterials and Bioengineering 和水量粘弾性といった標的タンパク質分子の持つ生来の物理化学的情報に基づいた高感度センシング技術が応用されてきた. 本研究では, タンパク質分子が元来有する表面電荷に着目し, 半導体型センサーを用いて, その電荷を検出するという新たな手法を開発した 1, 2). これまでタンパク質の有する電荷情報は等電点電気泳動や質量分析機器といった解析などに用いられてきた経緯がある. 一方で, タンパク質の分子内に着目すると, その電荷分布は非常に不均一であり, プラスとマイナスの電荷の双方をヘテロに有する両性イオンナノコロイドと捉えることができる ( 図 1). 実際に, 生体内においては, この不均一に分布した電荷が長距離の分子認識や複合体形成, 生化学反応と密接にかかわっている. また, 電荷を有する表面部位はイオン性水和によって親水性ドメインを形成し, 電荷を有していない部位は疎水性ドメインを形成することから, 分子間力を駆動力とした疎水性相互作用にも影響する. したがって, 吸着タンパク質の局所的な電荷情報を得ることで, 分子レベルでの配向, 変性過程などを評価することが可能となる. 生体材料工学研究所年報

合田達郎, 宮原裕二 17 図 1 (a) 局所的なタンパク質電荷の検出による分子配向性および高次構造変化の評価. (b) タンパク質吸着と界面電位変化の機構. 2. 半導体型センサーを用いた電荷検出の原理タンパク質の電荷検出にあたり, 本研究では半導体型センサーである電界効果トランジスタ (FET) を用いた.

3 合田達郎, 宮原裕二 17 図 1 (a) 局所的なタンパク質電荷の検出による分子配向性および高次構造変化の評価. (b) タンパク質吸着と界面電位変化の機構. 2. 半導体型センサーを用いた電荷検出の原理タンパク質の電荷検出にあたり, 本研究では半導体型センサーである電界効果トランジスタ (FET) を用いた. タンパク質吸着にともなう界面での電荷密度変化は, 以下に示すようにリアルタイム電位計測によってラベルフリーで測定することが可能である. 一般的に, 材料の持つ表面電荷により, 固液界面においては電気二重層が形成されるが, これは特定の電気容量 (C) を有することから一種のキャパシターと捉える事ができる. したがって, 電荷を帯びた分子が吸着すると,ΔV = ΔQ/Cの関係により, 界面電位変化 ΔVが観測される ( 図 1) 1). 電気二重層内の単位面積当たりの電荷量変化 ΔQは電荷を有するタンパク質吸着に依存することから, 一分子のタンパク質が寄与する電荷量 q-real が分かれば, その吸着量はΓFET = ΔQ/qとして求めることができる. 生理学的なイオン強度においては,Poisson-Boltzmann 方程式で表わされるように, タンパク質の電荷は溶液中の対イオンによって大部分が遮蔽される. したがって, 実際に検出される電荷は, 溶液のデバイ長の範囲内 ( およそ1 nm) となり, 吸着したタンパク質の接着面とその近傍の電荷に限定される. 接着面近傍の電荷を反映したシグナルと, 総電荷量から予測される電荷 q-estimateをdebye-huckelモデルを用いて求めた結果を比較することにより, 吸着における分子の配向や経時的な高次構造変化を評価することが可能となる. 3.FET SPR QCM センサーによるタンパク質吸着挙動の解析高イオン強度溶液中における電荷検出は, タンパク質分子の接着斑近傍に限定されるため,FET 計測結果のみによって全体の吸着量を精確に求めることは困難である. そこで, 既存のラベルフリー検出技術であるSPR QCMセンサーによって得られた結果と,FETで得られ図 2 BSA(a) と fibrinogen(b) の C11-SAM 表面に対する非特異的吸着と各種センサー間のシグナル比較. Vol. 46(2012)

18 吸着タンパク質の電荷検出と配向評価た結果とを比較して, タンパク質の吸着挙動を定量的定性的に評価する手法を新たに見出した 3).SPR 信号は吸着分子の誘電率を反映していることから吸着量のmolar (dry)mass(γspr) を見積ることができる.QCMは吸着したタンパク質に結合している水和水重量も合わせた wet mass(γqcm) を得ることができる.

4 18 吸着タンパク質の電荷検出と配向評価た結果とを比較して, タンパク質の吸着挙動を定量的定性的に評価する手法を新たに見出した 3).SPR 信号は吸着分子の誘電率を反映していることから吸着量のmolar (dry)mass(γspr) を見積ることができる.QCMは吸着したタンパク質に結合している水和水重量も合わせた wet mass(γqcm) を得ることができる. 一般的に, 両者の比 (ΓQCM/ΓSPR) は吸着したタンパク質フィルム層の膨潤度と定義できる. 両センサーともにセンシング深さは基材表面から100 nm 以上となることから, タンパク質の積層化や多層吸着に関しても鋭敏に応答する一方, 吸着分子の配向などを決定することは基本的に困難である. また,FET 信号は電荷量を反映しており, 吸着量の molar massを表すことから,spr 信号と比較することにより吸着タンパク質の接着面近傍の局所的な電荷の偏りを評価できる. 図 2にウシ血清アルブミン (BSA) とウシ血漿由来フィブリノーゲン (fibrinogen) の各濃度におけるC11 自己組織化単分子膜 (SAM) への吸着量をそれぞれ測定した結果の相関を示す.BSAに関しては, 広い濃度領域 (3.9 μg/ml ~ 1 mg/ml) において,FETより見積もった吸着量 (ΓFET) とSPRより求めた吸着量とが非常によく一致した (ΓSPR/ΓFET = 1). これはBSA 分子が球形に近いグロビュール形状であるうえに, マイナス電荷が比較的均等に分布していることによるものであると考えられる. 一方で, 棒状の巨大分子であるfibrinogenにおいては, 濃度領域に応じて特徴的な相関がみられた. 低濃度領域においてFETセンサーは吸着量を過小評価し (ΓSPR/Γ FET > 1), 中濃度領域では過大評価し (ΓSPR/ΓFET < 1), 高濃度領域では一致した (ΓSPR/ΓFET 1). 低濃度領域では吸着 fibrinogenの接着面は疎水性ドメインであることが伺える. つまり, 初期接着過程では材料表面と主に疎水性相互作用によって吸着し, 中濃度領域ではマイナス電荷が豊富なドメインが接着面に配向し, 高濃度領域では分子がランダムに配向して吸着しているものと考えられる. これらの説明はSPRとQCMのデータを比較した結果と矛盾しない. また,FETとQCMのデータを比較した結果はSPRとQCMのそれとよく合致している. これはFET 信号が吸着量のmolar massを反映するためである. その他 4 種類のタンパク質を用いて同様の測定をおこなったところ,IgGとmyoglobinはfibrinogenと同様の振る舞いを示した. また,β-caseinはBSAと同様に, 全濃度領域においてΓSPR/ΓFET = 1に近い関係性がみられた. 以上,ΓFETとΓSPRあるいはΓQCMとのプロファイルを比較することで吸着タンパク質の定量的定性的な情報が得られることが明らかとなった. 4.FET QCM 一体型センサーによるタンパク質吸着の速度論的解析次に, これらのセンサーを統合し, 同一のセンサー表面におけるタンパク質吸着現象に対して, 電荷と質量のシグナルが同時に得られるFET-QCM 一体型デバイスの開発をおこなった ( 図 3) 4). 電荷とwet massのそれぞれに由来する経時的シグナルを用いてタンパク質の吸着脱着過程におけるキネティックス解析をおこなったところ, 両者に顕著な違いが見られた. 吸着過程においては,QCMはFETよりもやや敏速に応答した. 脱着過程においては,FETは大きなシグナル変化をもたらしたのに対し,QCMのシグナル変化はごく微量であった. それぞれの経時変化シグナルからk-on,k-off,KDを求めたところ, ほとんどの場合,k-onはQCMのほうがFETよりも高い値を示した. これは, 接着面に疎水性ドメインが来ていることを意味しており, 主に疎水性相互作用によ図 3 FET-QCM 一体型センサーの構造図 (a) とその経時的シグナル応答 (b). 生体材料工学研究所年報

5 合田達郎, 宮原裕二 19 ってタンパク質の非特異的吸着が起こったものと考えられる. 一方,k-offはFETがQCMより高い値を示すものがみられた. これは見かけ上,FETが脱着過程を過剰に見積もっていることを表しており, 疎水性相互作用によって吸着タンパク質が経時的に変性し, 電荷を有する親水性ドメインが界面の電気二重層の外に移動しているためであると解釈できる. こうしたタンパク質の活発な高次構造変化は, タンパク質との親和性が比較的の低いとされる表面において観察された. 逆に, タンパク質との親和性が高い ( 疎水性 ) 表面においては,FETとQCMにおいてk-offの違いが見られなかった. これはタンパク質が表面と多点で強固に結合しているために, 高分子の高次構造変化が抑制されたためであると考えられる. また, QCMにおいてのみk-onは通常の結合過程に加えて二段階目の遅い変化を示した. これはFETとQCMとのセンシング深さの違い ( それぞれ1 nmと100 nm) に起因すると考えられる. 5. 結論タンパク質の生来有する電荷を電気的に検出することで, 固体表面に吸着したタンパク質の配向や高次構造を定量的定性的に評価できることがわかった. これは, 生理学的なイオン強度においてタンパク質の電荷が遮蔽される原理を逆手にとって, 接着面近傍の電荷のみを選択的に検出することによって達成されるものである. このラベルフリー型電荷検出技術は, 特異的なタンパク質 - リガンド認識反応や, タンパク質の翻訳後修飾の検出などへの応用が考えられ, 新たなバイオセンシング技術として期待される. 参考文献 1) Goda T, Miyahara Y. Detection of Microenvironmental Changes Induced by Protein Adsorption onto Self-Assembled Monolayers using an Extended Gate-Field Effect Transistor. Anal Chem. 82(5): , ) Goda T, Miyahara Y. Molecularly Engineered Charge-Conversion of Proteins for Sensitive Biosensing. Anal Chem. 82(21): , ) Goda T, Miyahara Y. Interpretation of Protein Adsorption through Its Intrinsic Electric Charges: A Comparative Study Using a Field-Effect Transistor, Surface Plasmon Resonance, and Quartz Crystal Microbalance. Langmuir. 28(41): , ) Goda T, Maeda Y, Miyahara Y. Simultaneous Monitoring of Protein Adsorption Kinetics Using a Quartz Crystal Microbalance and Field-Effect Transistor Integrated Device. Anal Chem. 84(17): , Vol. 46(2012)

コロイド化学と界面化学

コロイド化学と界面化学環境表面科学講義 http://res.tagen.tohoku.ac.jp/~liquid/mura/kogi/kaimen/ E-mail: mura@tagen.tohoku.ac.jp 村松淳司分散と凝集 ( 平衡論的考察! 凝集! van der Waals 力による相互作用! 分散! 静電的反発力凝集分散! 粒子表面の電位による反発分散と凝集考え方! van der Waals