VitaFast○R

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ゆきいいはた
5 years ago
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1 VitaFast ビオチン ( ビタミン B7) キット取扱説明書メーカーコード P1003 アヅマックスコード 1273P ( ) ( 抄訳版 : 必ず原文をご確認ください万一本書が原文と異なる場合原文を正としますなお仕様価格は予告なく変更される場合があります ) 概要本品は食物飼料医薬品中のビオチン総量 ( 強化および天然のビオチン ) を微生物学的に定量するマイクロプレートタイプのキットですキット内には検査に必要な試薬と標準がすべて同梱されており 96 検体 ( 参照標準を含む ) を 3 回に分けて試験できます結果判定には ELISA 用のマイクロプレートリーダー (610~630nm あるいは 540~550nm) が必要です本品は乳幼児用ベビーフードシリアルビタミン錠剤ビタミン粉末果汁および乳の分析用として AOAC RI で PTM( 性能検証済み試験法 ) の認証を受けました試料の調製液体試料希釈滅菌ろ過固体試料ホモジナイズ抽出 ( 遠心操作 ) 希釈天然ビオチンを含む試料の調製固体試料ホモジナイズ酵素処理抽出 ( 遠心操作 ) 希釈所要時間操作 ( 前処理 ) 結果判定インキュベート時間標準液の範囲定量限界検出限界約 1 時間 2 分間暗所 37 で44~48 時間 0.08~0.72μg/100g(mL) 0.08μg/100g(mL) 0.013μg/100g(mL) 回収率 90~105% 変動係数試験室内 10% 未満 ( 標準液において ) 試験室間 10% 未満 1. 目的 VitaFast ビオチン ( ビタミン B7) マイクロプレートテストは食物動物飼料医薬品中のビオチン総量 ( 添加および天然のビオチン ) を微生物学的方法で定量するものですこの微生物学的試験システムは国際規準と調和しています試験法の原理ビオチンを試料から抽出希釈しますあらかじめ試験菌として Lactobacillus. plantarum を固相化したマイクロプレートのウェルに希釈済み試料液とビオチン検査用培地を滴下します試験菌の増殖はビオチンの供給量に依存します標準液または試料としてビオチンが添加され培養がはじまると試験菌がビタミンを消費して増殖します培養は暗所で 37 44~48 時間行います抽出されたビオチンによる代謝あるいは増殖の強度を濁度によって測定しこれを標準検量線と比較して定量します測定は ELISA 用マイクロプレートリーダー 610~630nm( あるいは 540~550nm) により行います 2. キット内試薬このキットで 96 検体 ( 参照標準含む ) の試験が可能です 96 穴マイクロプレート L. plantarum が固相にコーティングされています 1 枚蒸留滅菌水(30mL) 3 本検査用培地参照標準の調製と抽出試料の希釈に用いますビオチン検査用培地( 固体 ) 3 本ビオチン( ビタミン B7) 標準試料 ( 固体 ) 3 本粘着シート 3 枚マイクロプレート用ホルダー 1 個注意 : 有効期限を過ぎたキットの品質は保証できません 3. お客様にご準備いただくものクリーンベンチ ( 無菌操作をお勧めします ) ELISA 用マイクロプレートリーダー 610~630nm 波長 ( または 540~550nm) 1

2 インキュベーター ( 内部 = 暗所設定 =37 ) ウォーターバス (95 に加温可能なもの ) ph メーター遠心機 ( 約 8,000 g 以上 )( 試料抽出液が濾過できない時に必要 ) マイクロピペット (20~200μL 用および 100~1000μL 用 ) と滅菌済みチップスクリューキャップ付き遠心管 ( 滅菌済み目盛付き )(15mL および 50mL 容量 ) とスクリューバイアル ( mL) 500mL 容ねじぶた付きガラス容器と 1L 容メスフラスコ滅菌フィルター ( ポリエーテルスルホン孔径 :0.2μm) と滅菌済みシリンジ蒸留水または脱イオン水 ( 試料抽出用 ) 水酸化ナトリウム溶液 1M および 0.1M 天然由来ビオチン試験用試薬タカジアスターゼ ( コウジカビ Aspergillus oryzae 由来 ) 希硫酸 2 規定水酸化ナトリウム液 (100mL の純水に 40g を溶かしたものおよび 100mL の純水に 8g を溶かしたもの ) 希塩酸 1.0mol/L および 0.1mol/L クエン酸緩衝液 ph4.5( 調製法 : クエン酸一水塩 1.5g をはかり取り 100mL 容のビーカーに入れ 50mL の蒸留水または脱イオン水にマグネチックスターラーで撹拌しながら溶解しますそれに 1M 水酸化ナトリウム溶液を 12mL( または固体の水酸化ナトリウム 0.48g) 入れ ph4.5 に調整します (0.1M 塩酸で修正する ) それを 100mL 容メスフラスコに入れ蒸留水または脱イオン水を加えて 100mL に調整します ) これは 2-8 で 3 日間保存が可能です 4. 使用上の注意分析用培地には粘膜眼皮膚への刺激作用の可能性があります試験終了後使用済みストリップは規則を遵守して廃棄してください ( オートクレーブ処理等 ) 5. 保存方法キット及び試薬は 2~8 で保存してください調製した試薬類 ( 参照標準培地等も含む ) はただちに使用し使用後は廃棄して下さい 6. 試料の調製栄養強化製品など試料中に存在する遊離型ビオチンの検出には多くの場合熱水抽出で十分です栄養強化飲料の場合は希釈したものを直接試験に供することが可能ですしかしながら熱水抽出では天然ビオチンの一部のみしか測定されませんトータルビオチン ( 天然型および遊離型 ) を定量するためには試料を酵素で加水分解処理する必要があります試料は遮光して 4 で保管してください参照標準と試料は各 3 点で試験を実施してください未知のマトリクス試料の場合は抽出試料をさらに希釈した 2 段階の試料とともに試験を実施してください試料抽出はホモジナイズした試料 1g または 1mL について蒸留水あるいは抽出溶液 40mL を用いて行うので希釈ファクターは 40 となりますこの希釈ファクター 40 はすでに標準検量線の濃度に勘案されています ( 同封の Quality Assurance Certificate: 品質保証書を参照のこと ) ビオチン濃度が低い場合は最大 5g または 5mL の試料を用いて試験して下さい ( この場合希釈ファクターが変わります ) 試験を妨害する物質が試料中にあるか否かを確かめるために添加回収試験を実施することもあります抽出前の試料に既知量のビオチンを添加します正しい結果を得るためには添加量は一般的に予想されるビオチン量と等量のビオチンを加えます低い回収率が得られた場合阻害物質の存在が示唆されますその場合阻害の影響を除くために試料をもっと希釈して下さい無菌の試料抽出液またはその希釈液でなければマイクロプレートに入れてはなりません希釈はキットにある滅菌水で希釈して下さいそれゆえ試料を抽出した後は無菌の環境の下で滅菌した器具で以後の操作をして下さい以下の試料には試料や試料の抽出液の無菌濾過が常に必要になります抽出工程で加熱しない果汁や健康飲料のような試料ただしウォーターバスで分間加熱するものを除く - ハーブやスパイスを含んだ試料蜂蜜や茶 - ビタミンミックスビタミンプレミックス錠剤 ( ビタミン強化剤 6.3 を参照のこと ) ただしウォーターバスで分間加熱するものを除く - 高度に着色された低いビタミン含量の試料 ( 濾過で色が薄くなるので ) 2

3 - 粒子や濁りがあるために濾過出来ないときは無菌濾過の前に 8000xg 以上で 5 分間遠心分離してください試料が 95 で 30 分間加熱されていれば無菌濾過は不要ですそれでも抽出された試料はキットにある滅菌水で希釈しなければなりません ( アッセイ培地は常に濾過されなければなりません ) 抽出試料の希釈倍率の計算例たとえばビオチン 80μg/100g と濃度が記載された固体試料の場合抽出液の希釈は値が標準曲線の中間になるようにしなければなりませんそこで濃度期待値を参照標準液 2 の濃度値で割ることで得ることができます計算 80μg 0.24μg = 333 よって 300 倍希釈 300 倍希釈の方法 : a) 10 倍希釈 ( 抽出液 0.1mL+ キット中の滅菌水 0.9mL) してさらに b) 10 倍希釈 ( a) から 0.1mL+ キット中の滅菌水 0.9mL) c) 3 倍希釈 ( b) から 0.2mL+ キット中の滅菌水 0.4mL) 6-1. 液体試料 ( ビタミン強化ジューススポーツドリンクなど ) 50mL 容量の滅菌済み遠心管に試料 1mL を入れ水を 40mL まで正確にメスアップして加えよく混和します抽出液 1.0~1.5mL を滅菌フィルター ( 孔径 :0.2μm) でろ過します ( または試料を 95 のウォーターバスで 30 分間加熱し急速に 30 に冷却します ) 必要に応じ滅菌した試薬バイアル (1.5mL または 2.0mL 容 ) の中でキット付属の滅菌水を用いて希釈します 6-2. ビオチンを添加したフルーツガムおよびキャンディー 15-20g のフルーツガムまたはキャンディーを量り取り 50mL 容の滅菌済み遠心管に入れ約 40mL の蒸留水または脱イオン水を加えウォーターバスで 95 に加熱し溶かします 30 に急速に冷却し 100mL 容のメスフラスコに入れ蒸留水または脱イオン水をさらに加えて 100mL に調整しますそれから 1g に相当する容量 ( 注 ) を 50mL 容の遠心管に入れ蒸留水または脱イオン水で 40mL にし振とうし無菌濾過をします ( または 95 で 30 分間加熱して急速に 30 に冷まします ) 試料の濃度によってはキットの 1,5mL( または 2.0mL) バイアルでさらに希釈します ( 注 ): 例 : フルーツガム 17g をとって 100mL の抽出液を調整したら 100mL/17g = 5.88mL/g 1g の試料は 5.88mL の抽出液に相当するのでそれを 50mL 容遠心管に入れる 6-3. カプセルまたは錠剤型のビタミン剤またはビタミンミックスまずカプセルまたは錠剤を秤量します ( 平均 5~10 錠のカプセルまたは錠剤 ) 錠剤は乳鉢またはミキサーでホモジナイズしますカプセルはその中の顆粒を抽出に用います試料サイズが 1g で前抽出が必要な場合ホモジナイズした試料 ( 錠剤ビタミンミックスプレミックスカプセル内容物 )1 g を 500mL 容のねじぶた付きガラス容器に入れさらに 400mL の蒸留水または脱イオン水を入れよく振とうします希塩酸と水酸化ナトリウム溶液で ph を 8.0+/-0.2 に調整しますそれを 95 のウォーターバスに 30 分間漬けておきますこの間そのガラス容器を少なくとも 5 回よく振とうして下さい急速にそれを 30 以下に冷却し 1000mL のメスフラスコに移し蒸留水または脱イオン水で 1000mL に合わせますこの抽出液 1mL をとって 50mL 容の滅菌遠心管に入れ蒸留水または脱イオン水で正確に 40mL に合わせますその後振とうし滅菌フィルターで濾過します ( または試料を 95 のウォーターバスで 30 分間加熱し急速に 30 に冷却します ) 濃度が濃い場合は得られた液をキット中の滅菌バイアルに入れてキット中の滅菌水でさらに希釈します注意 : 結果を換算するときには試料 1g を 1000mL に希釈したので希釈ファクター 1,000 をかけなければなりません抽出液.1mL を 40mL に希釈した操作は標準曲線の作成時に計算されていますのであらためて希釈ファクターを考慮する必要はありません試料サイズが 0.2g の場合ホモジナイズした試料 ( 錠剤ビタミンミックスプレミックスカプセル内容物 ) 0.2g を 50mL 容の遠心管に入れそれに 30mL の蒸留水または脱イオン水を入れ良く振とうし希塩酸と水酸化ナトリウム溶液で ph を 8.0+/-0.2 に調整しさらに蒸留水または脱イオン水を入れて正確に 40mL にしますそれを 95 のウォ 3

4 ーターバスに 30 分間漬けておきますこの間そのガラス容器を少なくとも 5 回よく振とうして下さい振とうする際は遠心管のフタが確実に閉まっているか確かめて下さい急速にそれを 30 以下に冷却しそれをキットの分析に使用します濃度が濃い場合は得られた液をキット中の滅菌バイアルに入れてキット中の滅菌水でさらに希釈します注意 : 計算するときは試料の重さを考慮して下さい 6-4. ビタミン強化シリアル / ベビーフード / 小麦粉の粉末 50mL 容の遠心管に破砕ホモジナイズした試料 1g を入れ蒸留水または脱イオン水約 30mL を入れ希塩酸と水酸化ナトリウムで ph8.0+/-0.2 に調製しよく振とうした後蒸留水または脱イオン水で正確に 40mL に合わせますそれを 95 のウォーターバスに 30 分間漬けておきますこの間そのガラス容器を少なくとも 5 回よく振とうして下さい急速にそれを 30 以下に冷却し滅菌フィルターで濾過し濾液をキットの分析に使用します濃度によってはさらにキット中の滅菌水で希釈します 6-5. 乳製品ベビ - フード中のトータルビオチン含量 ( 天然および強化ビオチン ) 非遊離型天然ビオチンの抽出および非強化試料中における定量に際しては酵素処理を伴う抽出が必要です 50mL 容の滅菌済み遠心管に破砕ホモジナイズした試料 1g を入れ蒸留水または脱イオン水 20mL を入れよく振とうし希塩酸を加え ph を 4.5 に調整しますまたは蒸留水の替わりにクエン酸緩衝液 20mL を使用されても構いませんその場合 ph 調整は不要です次に 300mg のタカジアスターゼを加えよく混和し 37 で 1 時間適宜振とうしながらインキュベートし蒸留水または脱イオン水で正確に 40mL に合わせますそれを 95 のウォーターバスに 30 分間漬けておきますこの間そのガラス容器を少なくとも 5 回よく振とうして下さいこの時遠心管の栓が堅く閉じられていなければなりません急速にそれを 30 以下に冷却しキットの分析に使用します濃度によってはさらにキット中の滅菌水で希釈します 6-6. シリアル中のトータルビオチン含量 ( 天然および強化ビオチン ) 非遊離型天然ビオチンの抽出および非強化試料中における定量に際してはオートクレーブ中で酸処理をする必要があります 50mL 容の滅菌した遠心管に破砕ホモジナイズした試料 1g を入れ 0.5M の希硫酸をさらに加えて 30mL にしよく振とうしますそれをで 30 分間オートクレーブで加熱した後 30 以下に急冷します水酸化ナトリウム水溶液を加えて ph を 4.5 にします蒸留水または脱イオン水を加えて 40mL にしますそれを遠心分離し上清液をキットの分析に使用します濃度によってはさらにキット中の滅菌水で希釈します 6-7. 酵母および酵母製品のトータルビオチン含量 ( 天然および強化ビオチン ) 50mL 容の遠心管に破砕ホモジナイズした試料 1g を入れ 2 規定硫酸を 30mL 入れ良く振とうしますそれを 95 のウォーターバスに 120 分間漬けておきますこの間そのガラス容器を少なくとも 5 回よく振とうして下さいこの時遠心管の栓が堅く閉じられていなければなりません急速にそれを 30 以下に冷却し ph を 2M の水酸化ナトリウム溶液で 6.0~7.0 に調整しますさらに蒸留水または脱イオン水を加えて 40mL にしますこれを無菌濾過するかあるいは 95 のウォーターバスに 30 分間漬けた後に急速に 30 以下に冷却し遠心分離します得られた液をキットの分析に使用します濃度によってはさらにキット中の滅菌水で希釈します 7. 検査の実施 7-1. 検査の準備滅菌水ボトル : 色つきのフタを押し上げボトルの縁のほうに引っ張りフタ全体を回して取りはずします参照標準 : ビオチン参照標準はそれぞれ 3 ウェルに滴下するのに十分な量が入っています試験の都度新しく調製したものを使用してくださいビオチン参照標準のボトルを開封しフタは開口部を上にして置く 4

5 Quality Assurance Certificate: 品質保証書と標準液のラベルを参照してキット付属の滅菌水を所定量参照標準のボトルに加えピペットで数回混和して溶解し参照標準濃縮液とします 6 本の滅菌済みバイアル (1.5~2mL 容量 ) を用意し溶解させた参照標準濃縮液から下表の要領で各濃度の参照標準液を調製します検量線濃度 μg/100g(ml) 滅菌水 μl 参照標準濃縮液 μl 総量 μl ブランク : = 900 参照標準 1: = 1000 参照標準 2: = 500 参照標準 3: = 500 参照標準 4: = 500 参照標準 5: = 500 検量線濃度において試料の抽出時における希釈係数の 40 は勘案済みです検査用培地 : ビオチン検査用培地 1 個はストリップ 6 本分に十分な量です試験の都度新しく調製したものを使用してください検査用培地のビンを開封しピンセットを用いて乾燥剤を取り除きます ( 乾燥剤は廃棄 ) キット付属の滅菌水 10mL をビオチン検査用培地のビンに加えてください検査用培地のボトルを慎重に閉め十分に振とう混和してください検査用培地のボトルを 95 のウォーターバスで 5 分間加温してくださいこの間最低 2 回は内容を混和し常にボトルのフタがしっかり閉まっていることを確認してくださいその後直ちに 30 以下の室温まで冷却して下さい培地を孔径 0.2μm のフィルターでろ過し 15mL の滅菌済み遠心管にとってください 7-2. 検査手順キット付属の滅菌水で希釈した滅菌試料のみをマイクロタイタープレートに入れて下さい必要本数のマイクロストリップを取り出し付属のホルダーにセットします使用しないストリップは乾燥剤とともにホイルバッグに戻し確実に密封し 2-8 で保管しますビオチン検査用培地 150μL を全ウェルに滴下します各標準液あるいは希釈した試料各 150μL を所定のウェルに滴下します ( 滴下後はピペッティングにより十分に混釈します ) 検査用培地を入れた後で標準液または試料液を入れて下さい順番が重要ですストリップ / ホルダーを粘着シートで覆います ( 粘着シートを保護シートからはがしストリップ上に水平に置き手でしっかりのばししっかりと密着させます重要シートがウェルにしっかりと密着しているかどうかを確認してください特にホルダー付近のウェルには注意してください暗所 ( インキュベーター内 ) にて 37 で 44~48 時間培養して下さい 7-3. 吸光度値測定粘着シートを一度強く押し付けてからプレートを逆さまにしますテーブル上でプレートをよく振とうし菌を完全に懸濁させますプレートを元に戻しシートを右上のほうから斜め方向にはがしますシートは粘着力が強いのではがすときは注意深くして下さい片手でシートを右上のほうから斜め方向にはがすときもう一方の手で必ずしっかりとフレームを押さえて下さいウェル内容液の表面の泡をチップか針などでつぶしてください ELISA 用マイクロプレートリーダーを用いて 610~630( あるいは 540~550)nm の波長で濁度を測定します注意 44~48 時間のインキュベート後冷蔵では最大 48 時間まで保管できその後に測定します休祭日の出勤を避けるために時間後にインキュベーターをタイマーオフにセットして 60 時間後に測定することも可能です 8. 解析データ解析には 4 パラメータ回帰式による解析をお勧めします R-Biopharm 社製品共通の解析ソフト RIDA SOFT Win がございますお問合せ下さい 5

6 この試験では以下の条件を満たす必要がありますブランクの吸光度値が参照標準液 1 の吸光度値よりも小さいこと参照標準液 5 の吸光度値が超であること試料抽出時の希釈係数 40 は検量線濃度において勘案済みです抽出液の追加希釈や試料重量のみが考慮される必要があり下記の式となります R-Biopharm は代替品を提供いたしますこの製品の商品性およびいずれの目的に対する適合性を保証するものではありません R-Biopharm はこの製品の使用により生じる直接あるいは間接の費用や特別あるいは甚大な損害を含むあらゆる損害に対してその責任を負うものではありません以上はその輸入販売を行う場合も同様ですビオチン (μg/100g 中 ) (μg/100ml 中 ) = 検量線から得られた濃度希釈ファクター試料重量 g(ml) 製造元 :Ifp Institut für Produktqualität GmbH( ドイツ ) 発売元 :R-Biopharm AG( ドイツ ) 輸入国内販売元 : アヅマックス株式会社例 ) 試料重量 :1g 試料抽出時の希釈ファクター :40( ここでは計算に入れる必要なし ) 抽出後の希釈ファクター :300( 計算に入れる必要あり ) 検量線から測定された濃度 :0.24μg/100g = 72μg 1 試料 100g 中のビオチン量カプセル剤錠剤ビタミンミックスの計算法ビオチン量 (μg)/ 錠剤またはカプセル 1 個 = 検量線から得られた濃度希釈ファクター x 錠剤またはカプセルの重量 (g) 試料重量 g x 100 R-Biopharm はその製品が標準の品質であること以外には何ら明示的にも示唆的にも保証するものではありません製品に不具合があればなおご不明な点ご注文などがございましたら下記にご連絡くださいアヅマックス株式会社東京営業所東京都中央区日本橋茅場町鉄鋼会館 5F TEL FAX sales@azmax.co.jp 本社千葉県市原市玉前西ご注意吸飲したり皮膚と接触したりすると有害である試薬類が含まれています使用前に取扱説明書等をよくお読みいただき注意事項をお守りください責任ある管理者の指導のもとに保護手袋保護メガネ等を着用して取り扱ってください開封後は各容器を密閉して取扱説明書とともに保管してください廃棄する場合には衛生面環境面に十分配慮し法規を遵守してください身体に異常を感じた場合はただちに医師の手当てを受けてくださいテスト結果の判断と運用はすべてお客様自身の責任で行ってください 6

7 保証についてアヅマックスは販売製造後 1 年以内あるいは記載有効期限のいずれか短い時間内にキット添付の取扱説明書に基づき使用された場合において製造物流保管等作業の不具合等による部材等の瑕疵に対してのみ補償いたします取扱説明書ユーザーガイド検査手順およびアプリケーションは購入者のためのガイドラインとしてのみを目的として作成されておりますので購入者の皆様には各検査手順やそれぞれのアプリケーションにおいての妥当性を自ら検証していただくようお願いいたしますテスト結果の判断と運用はすべてお客様自身の責任によるものでこの商品の使用によるすべての直接的および間接的な結果としての経済的損失や財産の損害などあらゆる損害に対し明示的にも暗示的にも一切補償するものではありませんまた何ら特定目的への適合性や商品性の保証も致しておりません補償に関する唯一の義務は有効期限内において作業の不具合等による部材等の瑕疵が証明され弊社にすみやかに告知された場合のみであり購入品あるいはその一部に対し交換か返金がなされます 7

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VitaFast○R VitaFast ビタミン B12( シアノコバラミン ) キット取扱説明書メーカーコード P1002 アヅマックスコード 1272P 110601-111221 ( 抄訳版 : 必ず原文をご確認ください万一本書の内容が原文と違う場合は原文を正としますなお仕様価格は予告なく変更される場合があります ) 製造元 :IFP GmbH ( ドイツ ) 販売元 :R-Biopharm AG ( ドイツ