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のぶみつひろき
5 years ago
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1 Ⅳ. サルモネラの検査法サルモネラは医学および獣医学における重要な病原菌である本菌は腸内細菌科 (Enterobacteriaceae) に属するグラム陰性無芽胞桿菌で一般に周毛性の鞭毛を有し運動性を示す病原性の面からサルモネラをみるとヒトにチフス症を起こすものと胃腸炎を起こすものに大別されるサルモネラは家畜や家禽およびイヌネコ小鳥等のペット動物さらにカメヘビなどの爬虫類の腸管内に保菌されているばかりでなく下水河川水などの環境に広く分布しているこのため各種の食品が本菌に汚染される機会は多いなかでも食肉類や卵などの汚染率が高く食品衛生上問題となる 1. 分類サルモネラは2 菌種 6 亜種に分類される ( 表 1) その鑑別性状を表 2に示す表 1 サルモネラの分類菌名亜種略号血清型 Salmonella enterica Salmonella bongori subsp. enterica Salmonella I 約 1500 種 ( 固有名あり ) subsp. salamae Salmonella II subsp. arizonae Salmonella IIIa subsp. diarizinae Salmonella IIIb 約 1000 種 subsp. houtenae Salmonella IV subsp. indica Salmonella VI Salmonella V サルモネラの正式菌種名は長いので便宜上略号で記されることが多いが Salmonella (S.) bongori は当初 S. enterica の亜種として分類されその略号としてⅤが用いられたため番号の逆転現象が生じているこれらのうちヒトに病原性を有し患者あるいは保菌者から分離されるのは Salmonella I が主でごく稀に Salmonella IIIa が分離されるサルモネラは保有する O 抗原と H 抗原の種類によって約 2500 種の血清型に分類され Salmonella Iの約 1500 種は各々に固有名が付けられているサルモネラの記載例学術論文 ( 国際誌 ) 等の菌種名表記 1)Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis 2)Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium IV.1

2 通常の検査や疫学調査成績等は血清型で表記する 1)Salmonella Enteritidis または S. Enteritidis 2)Salmonella Typhimurium または S. Typhimurium 保健所や検査機関等での表記通常 H 抗原は決定しないので記載は 1) サルモネラ O9 群 2) サルモネラ O4 群等がよい表 2 サルモネラの菌種および亜種の鑑別性状 S. enterica S.bongori 性状テスト Ⅰ Ⅱ Ⅲa Ⅲb Ⅳ Ⅵ Ⅴ マロン酸 KCN 培地における発育 β-ガラクトシダーゼ d D-ガラクトウロン酸ズルシット d ソルビットサリシン d ヒト及び温血動物からの分離ヒトにおける病原性 +++? +???? ( 数字は陽性菌の %) 2. サルモネラの検査手順 ( チフス菌パラチフス A 菌を除く ) 1) 急性胃腸炎症状を示す患者便からの菌分離菌量が多いことが予想されるので直接分離培養を行う ( 図 1) すなわち便を分離培地 (SS 寒天 DHL 寒天等 ) に数白金耳量塗抹し 37 1 夜培養する中心部黒色周辺部が無色透明な集落を釣菌して確認試験を行うサルモネラの検出のみを目的とする場合最近開発された分離培地クロモアガーサルモネラは感度特異性利便性において優れている 2) 回復期患者保菌者からの菌分離サルモネラの菌数が少ないことが予想される検体は増菌培養を併用する ( 図 1) 増菌培地にはセレナイトシスチン培地 RV 培地 TT 培地等がある増菌効果はセレナイトシスチン培地が最も高いが毒性の強い試薬を用いるので安易に使用するべきでない通常中試験管に 10 ml ずつ分注したRV 培地あるいはTT 培地に検体を約 1ml(g) 入れ 42 18~20 時間培養後よく撹拌しその1 白金耳量を分離 IV.2

3 培地に塗抹し 2.1) と同様に分離培養する 3) 食品あるいは拭取り材料からの菌分離通常食品あるいは拭取り材料のサルモネラ汚染菌量はごく僅かであるため直接分離培養による本菌の検出は行わず増菌培養からはじめる ( 図 2) 1 前増菌培養加工食品中のサルモネラは加熱乾燥凍結および放射線処理等によって損傷を受けているかまたは休眠状態にあるこのような場合増菌培養に先立つ前培養が必要である前培養には選択性のほとんどないEEMブイヨン BPW 等を使用する試料 25g(ml) を前増菌培地 225 ml に入れ 37 1 夜培養するこの操作はストマッカーバッグで行うと便利である 2 増菌培養損傷菌を考慮する必要のない検体は直接増菌培養から開始できる増菌培地には 2.2) に記した培地の他にSBGスルファ培地などがあるこれらのうちセレナイトシスチン培地は卵および卵製品には適さないいずれも検体 25g(ml) を増菌培地 225 ml に入れ 42 18~20 時間培養する前増菌培養を行った場合は培養液 0.1 ml を増菌培地 10 ml( セレナイトシスチン培地は 15 ml) の入った試験管に接種し培養する 3 分離培養増菌培養の1 白金耳量を分離培地に塗抹し2.1) と同様に分離培養する糞便直接分離培養増菌培養残りは凍結保存 DHL 寒天等 RV 培地等 37 1 夜 42 18~20 時間分離培養 DHL 寒天等 37 1 夜疑わしい集落確認培養 (TSI LIM 等 ) O 群血清型別検査衛生研究所へ (H 抗原薬剤感受性等の検査 ) IV.3

4 図 1 糞便のサルモネラ検査法食品 BPW 等 10% 乳剤サルモネラの定量前増菌培養一般細菌数等の検査菌数算出 37 1 夜増菌培養 RV 培地等 42 18~20 時間分離培養 DHL 寒天等 37 1 夜疑わしい集落確認培養 (TSI LIM マロン酸培地等 ) O 群血清型別検査衛生研究所へ (H 抗原薬剤感受性等の検査 ) 図 2 食品のサルモネラ検査法 4) 分離培地の観察 1SSおよびDHL 寒天 Salmonella I の大部分の株は本培地上で硫化水素を産生し中心部黒色周辺部無色半透明の集落を作る稀に硫化水素産生能が弱く黒色が観察されない株がある一般にSS 寒天よりDHL 寒天の方が菌の発育がよく観察しやすい 2クロモアガーサルモネラ Salmonalla I は赤紫の大コロニーを形成し他の腸内細菌との識別が容易である 5) サルモネラの確認試験サルモネラの同定は生化学性状を優先させる分離培地上のサルモネラが疑われる集落を TSIおよびLIM 培地に接種し 37 1 夜培養後に以下の性状を示したものをサルモネラと判定する TSI 斜面 : 乳糖および白糖非分解のため赤色高層 : ブドウ糖分解により黄色を示すが通常は硫化水素産生のため黒色であるガス産生のため亀裂がみられる株もある IV.4

5 LIM リジン : 陽性紫色運動性 : 培地の混濁が認められるインドール : 陰性 Kovacs 試薬を添加しても色の変化はない 6) サルモネラの血清学的テスト生化学性状でサルモネラであることが確認された菌についてサルモネラ診断用血清を用いO 抗原の型別をする市販のO 群多価血清の1 滴をスライドグラス上にとり TSI 斜面からかき取った少量の菌とよく混和する 30 秒以内に凝集が認められた場合を陽性とする微弱な反応 1 分以上経過して現れる反応は擬陽性とし確認検査をする対照として生理食塩水をおくと良い陽性の株はさらにO 群の個々の血清について同様の操作を行い O 群血清型を決定する 7) サルモネラの定量培養直接平板塗抹法による定量検体の 10 倍希釈系列を作り各系列の 0.1 ml をクロモアガーサルモネラ寒天培地にコンラッジ棒で広げる培養後コロニー数を測定する汚染菌量が少ない食品 (10 cfu/g) の場合はMNP 法により定量する 3. チフス症の検査手順ヒトにチフス症を起こす菌はチフス菌 (S. Typhi) とパラチフスA 菌 (S. Paratyphi A) があり 3 類感染症に分類されるチフス菌は食物水などとともに体内にとり込まれ回腸下部に付着しそこで感染増殖するとともにリンパ管を介してリンパ節に侵入しついで胸管を経て血流中に入り脾臓肝臓骨髄腎臓など身体各部に伝播する * 腸チフスの経過と菌の検出潜伏期 :5~14 日平均 7~8 日この期間は菌が腸リンパ節で盛んに増殖しているがそこから糞便中に排出される菌数は少ない初期 ( 第 1 週 ) : リンパ節からリンパ管血流を介して菌が各臓器に伝播されはじめる体温が徐々に上昇し 4~5 日で 40 台に達するこの期間は菌が血中に濃厚に存在する ( 血液培養 ) 極期 ( 第 2 週 ) : 発熱が続く尿便中にはあまり菌は認められないバラ疹も著明となる緩解期 ( 第 3 週 ): 脾臓肝臓腎臓などの病巣の菌が尿中に排出されるため尿の培養を行なう ( 尿培養 ) 肝臓に侵入した菌はそこで増殖し胆汁とともに腸管内に排出 IV.5

6 されるので第 2 週の終わり頃より菌は糞便からも検出されるようになる ( 血液尿便培養 ) 徐々に回復期に入る尿中の菌が減少し菌の排出は糞便への経路が主体となる ( 便培養 ) 1) 培養方法 1 血液直接培養 : 数白金耳量を血液寒天 DHL 寒天等に塗抹し分離培養する増菌培養 : 抗凝固剤を用いずに採取した血液の1~2ml をカルチャーボトルで培養する 37 1~10 日間培養し血液寒天 DHL 寒天等で毎日分離培養する 2 糞便通常のサルモネラと同様に分離培養する増菌培養する場合はセレナイトシスチン培地を用いる 3 尿直接培養 :50~100ml を遠沈管に移し rpm 30 分遠心し沈渣をDHL 寒天等で分離培養する増菌培養 : 沈渣をセレナイトシスチン培地で増菌後 DHL 寒天等で分離培養する 2) 分離培地の観察 1DHL 寒天チフス菌および大部分のパラチフスA 菌は本培地上で硫化水素非産生で無色半透明集落を作る 2クロモアガーサルモネラチフス菌およびパラチフスA 菌はその他の Salmonella I と同様赤紫の集落を作るがチフス菌の集落はやや小さい 3) 確認培地の観察チフス菌パラチフスA 菌が疑われる場合にはTSIおよびLIM 培地の他にシモンズクエン酸培地を使用するチフス菌 TSI 斜面 : 乳糖および白糖非分解のため赤色高層 : ブドウ糖分解により黄色を示す硫化水素は産生されるが高層上部または凝固水部分が僅かに黒色となるのみであるガス非産生 IV.6

7 LIM リジン : 陽性紫色運動性 : 培地の混濁が認められるインドール : 陰性 Kovacs 試薬を添加しても色の変化はないシモンズクエン酸培地の色調が変化しない ( 緑色 ) パラチフスA 菌 TSI 斜面 : 乳糖および白糖非分解のため赤色高層 : 黒変なしガス産生 LIM リジン : 陰性黄色運動性 : 培地の混濁が認められるインドール : 陰性 Kovacs 試薬を添加しても色の変化はないシモンズクエン酸培地の色調が変化しない ( 緑色 ) 4. チフス菌パラチフスA 菌の血清学的テストチフス菌 :Vi 血清 O 血清を用いてスライド凝集反応を行なう Vi 血清にのみ凝集するかあるいはVi 血清に凝集ししかも O 因子血清 (O9) にも凝集するときは被検菌はVi 抗原を持つ菌であると判定する Vi 抗原は易熱性抗原であるから ~30 分加熱後加熱死菌がVi 血清に凝集しなくなることを確認する加熱死菌は O9には凝集する稀にVi 抗原を持たない株があることに注意するパラチフスA 菌 :O2に凝集する表 3 鑑別培地の性状一覧 TSI LIM クエン酸血清斜面高層カス H 2 S リシン運動性イントール Vi O2 O9 チフス菌 w(-) + +(-) - - +(-) - + ハラチフス A 菌 (w) 他のサルモネラ * * IV.7

Microsoft Word - SalmonellsST

Microsoft Word - SalmonellsST サルモネラ属菌標準試験法 NIHSJ-01-ST4 (090218) (090623 一部修正 ) (091014 一部修正 37 対応 ) 0 サルモネラ試験法はじめに本サルモネラ試験法は食品からの微生物標準試験法検討委員会 (http://www.nihs.go.jp/fhm/kennsahou-index.html で情報公開中 ) が作成したサルモネラ属菌標準試験法を基に作成されたこの委員会では