身に着けよう!微生物検査の基本スキル 用手法による同定法

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1 東京都臨床検査技師会 微生物検査研究班研修会 グラム陽性球菌の同定 身に着けよう 微生物検査の基本スキル グラム陽性球菌 用手法による同定法 グラム陽性球菌 カタラーゼ試験 グラム陰性桿菌 確認培地による同定 コアグラーゼ試験 PYR試験 カタラーゼ 6.5 NaCL( グルコース発酵 Micrococcus sp. 腸内細菌科 抗血清スライド凝集試験 ランスフィールド分類 カタラーゼ 6.5 NaCL 胆汁エスクリン 6.5 NaCL(ー グルコース非発酵 Enterococcus sp. コアグラーゼ コアグラーゼ ー S. aureus バシトラシン() オプトヒン(ー) 胆汁溶解(ー) CMPテスト( ) 谷道由美子 S. agalactiae カタラーゼ試験 バシトラシン(ー) S. pyogenes α-streptococcus S. pneumoniae 日本大学医学部附属板橋病院 γ溶血 γ-streptococcus オプトヒン() 胆汁溶解() CMPテスト 溶血性 β溶血 α溶血 CNS 胆汁溶解試験 オプトヒンテスト 6.5 NaCL 胆汁エスクリン CMPテスト(ー) β-streptococcus コアグラーゼ試験 試験管法 目的 過酸化水素分解酵素 カタラーゼ の産生の有無を検査 目的 遊離コアグラーゼの検出 原理 過酸化水素を加水分解する菌は発泡する 原理 コアグラーゼは菌が増殖過程に菌体外に分泌されるタンパク質で ヒ トや動物の血漿中に含ませるプロトロンビン類似物質(CRF)に作用し て血漿凝固を起こさせる 方法 3 過酸化水素水に被検菌を爪楊枝等で混合する 判定 陽性 気泡が発生 陰性 無反応 数十秒後の微細な気泡は陰性とする 陽性 Staphylococcus 属 Micrococcus 属 Bacillus 属 Cynebacterium 属 Listeria monocytogenes 陰性 Streptococcus 属 Enterococcus 属 Clostriium 属 Lactobacillus 属 rcanobacterium/trueperella 注意点 血液成分によって偽陽性になる 方法 試験管にウサギ血漿.5mLを分注し被検菌を混濁させる 37 で3時 間培養後 試験管を傾けフィブリン形成の有無を確認する 陰性の場 合は4時間まで延長し判定する 判定 陽性 血漿凝固あり またはフィブリン形成あり 陰性 血漿凝固なし またはフィブリン形成なし 注意点 ウサギプラズマ 栄研 栄研化学 は乾燥プラズマの溶解に滅菌生理 食塩水7mLを用いるが BHI brothを用いると微弱産生菌の検出も可能 との報告がある 長時間37 におくと凝固物が再び溶解する場合がある 反応時間が4時間を超えると非特異的な凝固がみられることがある コアグラーゼ試験 ラテックス凝集 目的 クランピング因子とプロテインの検出 原理 種類あり ①フィブリノーゲンとクランピング因子 プロテインに対する抗体(IgG) をラテックス粒子に感作させた試薬を用いた凝集法 ②フィブリノーゲン クランピング因子 プロテイン およびS. aureus の莢膜多糖体血清型5 と血清型8 に対するモノクローナル抗体を感作さ せたラテックス粒子を用いた凝集法 方法 メーカー添付書に従い実施する ① スタフォレックス 三菱化学 スタフィロL デンカ生研 PS ラテックス 栄研化学 ② Pastrex Staph plus BioRa ドライスポットスタフィテクトプラス 関東化学 判定 陽性 凝集が認められる 陰性 凝集が認められない 注意点 ①は陰性コントロールが無く②は陰性コントロール有 まれにS.aureus で凝集が認められない株がある コアグラーゼ陽性菌 コアグ ラーゼ ラテッ クス PYR S. aureus subsp. aureus ヒト 動物 S. intermeius ⅾ ハト S. pseuintermeius イヌ ネコ ヒト S. schleiferi subsp. coagulans イヌ ネコ S. hyicus ⅾ ブタ ニワトリ S. lugunensis ヒト ハト イヌ ネコ ヒト S. schleiferi subsp. schleiferi 9 以上陽性 分離源 9 以上陰性 89 が陽性 Manual of clinical microbiology th eition より一部抜粋および改変

2 PYR試験 ランスフィールド分類 目的 ピロリドニルアリルアミダーゼ (PYR) の産生の有無を検査する 目的 レンサ球菌 主に溶連菌 を群別により分類する 原理 PYR産生菌はL-ピロリドニル-βナフチルアミドを分解しβナフチルアミンを生成する 原理 方法 細胞壁多糖体を血清型により分類したもの 抗血清を用いたラテックス凝集法の検査キットが市販されてる メーカー添付書に従い実施する 方法 試薬(p-ジメチルアミノシンナムアルデヒド)と結合すると紫色に発色する 判定 陽性 濃ピンク 紫色を呈する 陰性 無色 薄いピンク 陽性 Streptococcus pyogenes Enterococcus 属 NVS(biotrophia/Granulicatella) 陰性 Streptococcus agalactiae Streptococcus equisimilis Streptpcoccus bovis group Streptococcus anginosus group robacter 属 Salmonella 属 Escherichia coli など多くの連鎖球菌 判定 凝集が認められた血清型を陽性と判定する ランスフィールド分類 Streptococcus agalactiae B G C G C G F 凝集() D Streptococcus ysgalactiae subsp. equisimilis Streptococcus canis Streptpcoccus anginosus group Enterococcus spp. 注意点 検査には非選択培地を用いる 胆汁溶解試験 オプトヒンテスト 目的 肺炎球菌とそれ以外のα-streptococcus属を鑑別 目的 肺炎球菌とそれ以外のα-streptococcus属を鑑別 原理 肺炎球菌は胆汁成分により自己融解する 原理 肺炎球菌はオプトヒンに対して感受性を示す 方法 ①試験管法 ml生理食塩水に被検菌を濃厚に浮遊させ等分する 方法 被検菌を血液寒天培地に塗布し5µgオプトヒンディスクを置く 片方に デオキシコール酸Na溶液を数滴滴下 もう片方に生理 食塩水を数滴滴下し 35 3分反応させる 35 5 CO環境下で一晩培養後 阻止円径を計測する 判定 陽性 阻止円径 4mm 肺炎球菌 ②迅速推定法 血液寒天培地上の被検菌のコロニーに デオキシコール 酸Na溶液を滴滴下 35 5分反応させる 判定 ①陽性 デオキシコール酸Naを添加した試験管が透明化 陰性 変化なし 好気条件下の培養では S. pseuopneumoniae の判定ができない 注意点 試験管法の場合コンタミネーションに注意(透明化が不十分になる) オプトヒンテスト 栄研化学 6.5mm 5µg 判定が紛らわしい場合は胆汁溶解試験を実施する CMPテスト メーカーによる比較 OP 含有量 稀にオプトヒン耐性株がある 判定基準がメーカーによって異なる 陰性 変化なし ディスク 直径 陰性 阻止円径 4mm 肺炎球菌以外のα-streptococcus属 注意点 各メーカーの添付書の培養条件に CO環境下 の記載がない ②陽性 コロニー消失 メーカー PYR Streptococcus pyogenes 目的 細菌のサイクリックMP(cMP)因子の産生の有無を検査する 培養条件 判定基準 陽性 3mm 8 4時間 陰性 mm 陽性 8mm 6 4時間 陰性 4mm 35± 陽性 4mm 4時間 陰性 4mm 原理 cmp因子産生菌はs. aureusが産生するβ-ヘモリジンと相乗的に作 用してヒツジ赤血球の溶血を増強させる 方法 ヒツジ血液寒天培地の中央にS. aureus (β-ヘモリジン産生株)と一直 線に塗布 さらにS. aureus に触れないように被検菌を直角に一直線 日水製薬 日本BD 8mm 6mm µg 5µg 5 7mmの場合 イヌリン分解能 胆汁 溶解試験等で総合的に 判定する 阻止円6 4mmの間 は胆汁溶解能が認めら れた場合肺炎球菌と推 定 炭酸ガス培養では発育 促進するが阻止円が小 さくなる 柄澤利子 臨床と微生物 vol より引用 に塗布 35 で一晩培養後判定 判定 陽性 矢じり状の溶血帯の増強あり 陰性 溶血帯の増強無し 陽性 Streptococcus agalactiae Listeria monocytogenes 陰性 S. agalactiae 以外の溶連菌 注意点 Staphylococcus aureus TCC 593を用いるとよい α-ヘモリジン産生の強いs. aureus では判定が紛らわしい場合がある

3 CMP反応とCMP抑制反応 CMP反応とCMP抑制反応 S. agalactiae L. monocytogenes CO環境下一晩培養後 S. aureus S. aureus TCC593 TCC593 冷蔵で一晩放置後 rcanobacterium haemolyticum 腸内細菌同定のフローチャート IP( ) 確認培地 多目的培地 Proteus spp. () Proviencia spp. Mganella mganii ( ) Salmonella Typhi robacter freunii Ewarsiella tara ② ( ) lebsiella spp. Serratia spp. Enterobacter spp. ③ () Escherichia coli robacter spp. Salmonella Paratyphi Yersinia spp. Plesiomonas shigelloies ④ () ① 培地 LIM培地 微生物検査ナビ第版 IP の菌 (産生3 GS P. mirabilis 分解菌は より画像引用 Proteus mirabilis インドール()菌は 栄研化学 IP の菌 選択枝 Proteus vulgaris Proteus penneri rcanobacterium haemolyticum 培地 L培地 IL培地 ( ) IP() S. agalactiae L. monocytogenes アルカリ化 酸性化 株によって異なる GS IP H S インドール 分解 85 5 P. mirabilis P. mirabilis Manual of clinical microbiology 8 th eition より一部抜粋

4 IP の菌 IP の菌 選択枝 Proviencia spp. Mganella mganii Proteus penneri 非産生7 インドール()菌は GS P. rettgeri M. mganii Proviencia spp. M. mganii アルカリ化 Proviencia spp. シモンズクエン酸()菌は 酸性化 株によって異なる GS IP インドール P. rettgeri Proviencia M. mganii 9 M. mganii Manual of clinical microbiology 8 th eition より一部抜粋 IP の菌 選択枝 Salmonella Typhi IP の菌 ) GS S. Typhi w robacter freunii Ewarsiella tara C. freunii E. tara ) Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi インドール()菌は アルカリ化 酸性化 株によって異なる Ewarsiella tara robacter freunii リジン()菌は Salmonella Typhi しっかり性状を覚える 乳 糖 白 糖 GS S. Typhi C. freunii E. tara Manual of clinical microbiology 8 th eition より一部抜粋 Salmonella 属の性状 Salmonella Typhi Salmonella Paratyphi 性状 IP の菌 特徴 3類感染症 運動性() 産生量は微量 オルニチン() Vi抗原 O9群 運動性 ガス産生 オルニチン O抗原とH抗原の組み合 わせにより多数の血清 型が存在 3類感染症 運動性 産生菌は ガス産生 オルニチン O群 選択枝 lebsiella spp. ( ) Serratia spp. Enterobacter spp. Escherichia coli Salmonella Paratyphi robacter spp. () Yersinia spp. Plesiomonas shigelloies ) Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi

5 IP の菌 IP の菌 選択枝 lebsiella spp. (. pneumoniae. oxytoca) GS Serratia spp. (S.marcescens).pneumoniae Enterobacter spp. (E.aerogenes E. cloacae).oxytoca S.marcescens E.aerogenes E.cloacae 運動性()菌は lebsiella spp. アルカリ化 インドール()菌は lebsiella oxytoca リジン()菌は Enterobacter cloacae 酸性化 株によって異なる GS 55 E.aerogenes E.cloacae pneumoniae.oxytoca E. aerogenes とS. marcescens の鑑別は どんな培地を使えばいい S.marcescens Manual of clinical microbiology 8 th eition より一部抜粋 IP の菌 IP の菌 選択肢 Escherichia coli Salmonella Paratyphi robacter spp. C. koseri ) Y. enterocolitica Y. pseuotuberculosis GS E. coli S. Paratyphi C. koseri P. shigelloies アルカリ化 Plesiomonas shigelloies オキシダーゼ()菌は シモンズクエン酸()菌は リジン()菌は P. shigelloies C. koseri P. shigelloies GS E. coli S. Paratyphi E. coli 5 4 P. shigelloies 8 Manual of clinical microbiology 8 th eition より一部抜粋 Shigella 属の性状の違い ② GS 性状 S. ysenteriae S. ysenteriae B S. flexneri S. flexneri C S. boyii D S. sonnei ( ) ( ) 特徴 3類感染症 (直ちに届出) S. ysenteriae S. boyii または ( ) 遅れて陽性 血清型のみが志賀毒 素(Stx)を産生する S. flexneri 血清型6 菌株 血清型 によって反応が異なることがある 血清型の分類 亜群 9 以上陰性 C. koseri 9 以上陽性 株によって異なる Shigella 属の性状の違い ① 亜群 酸性化 S. boyii 血清型3と 血清型 O抗原 A群 3血清型 B群 6種類の型抗原と3組の群抗原の組み 合わせにより決定 C群 8血清型 D群 血清型は一つ Ⅰ相 Ⅱ相あり 既存の血清型で分類できない 新血清型赤痢が5年以降 9例 輸入例5例 国内例 4例 報告されている S. flexneri S. sonnei 4は少量のガス産生株 あり S. sonnei 遅分解 日目以降に 遅れて分解

6 抗血清を用いたスライド凝集試験 Yersinia spp. の培養温度による性状の違い 温度 Y. enterocolitica Y. pseuotuberculosis 37 GS (D群以外) 日常検査で凝集試験を行う可能性がある 準備と注意点 Salmonella 属 非選択培地から試験を行う Shigella 属 適正な抗血清を使用する 下痢原性大腸菌 Shigella 属と性状が似ているが鑑別は容易 Yersinia 属は遅発育菌 至適発育温度5 8 有効期限 保存状態の確認 生菌を使う場合は感染に注意する 菌の加熱はなぜ必要 易熱性の莢膜抗原 抗原 の影響を除去し 耐熱性の菌 体抗原 O抗原 を検出することが目的である ウレアーゼ陽性 Yersinia pestisは陰性 抗血清を用いたスライド凝集試験 抗血清を用いたスライド凝集試験 菌の加熱処理の方法 凝集方法 生理食塩水に濃厚菌液を作製後 加熱処理 5分または 6分 をする 9 ℊで分遠心分離し上清を捨て沈査に少量の生理食 塩水を加え混和したものを加熱菌試料とする 凝集試験に用いる滴下量は マイクロピペットで5 µl. スライドグラスをバーナーであぶる ガラス鉛筆で枠を作製 または分画 グラスを使用 下痢原性大腸菌 加熱菌で凝集試験を行う Salmonella 属 生菌で凝集試験を実施後 必要に応じて 加熱処理を行う Vi抗原に凝集した場合 複数の抗血清に凝集した場合 Shigella 属 生菌で凝集試験を行う 加熱処理の必要性は見解が異なる. 生食と被検菌を混和し自然凝集が無 いことを確認する 抗血清滴下 生食 菌苔または菌液(5 µl) 混和 3. 抗血清と被検菌を混和する 菌濃度は下の字がみえる程度 混和時 次の抗血清に移るときに白 金線の滅菌は不要 4. 蛍光灯下または自然光下で凝集を観 察する 通常は分以内に明瞭な凝集 を呈する 頭上にかざして判定を 行っては 危険行為 ( ) 判定時 生食に凝集が無 いことを再度確認する

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