東京理科大学 Ⅰ 部化学研究部 2016 年度秋輪講書ウリ科植物におけるアルコール分解酵素含有量の比較 2016 年火曜班 Eguchi,N.(1K),Kikuchi,E.(1OK),Taketomi,H.(1K),Naradate,M.(1K),Fukushima,M.(1K), Sugawar

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あきたけなつ
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1 東京理科大学 Ⅰ 部化学研究部 2016 年度秋輪講書ウリ科植物におけるアルコール分解酵素含有量の比較 2016 年火曜班 Eguchi,N.(1K),Kikuchi,E.(1OK),Taketomi,H.(1K),Naradate,M.(1K),Fukushima,M.(1K), Sugawara,A.(2C),Tanaka,M.(2K),Baba,H.(2K),Sato,M.(2K) 1. 背景大学の部活やサークル活動の一環として, また職場の仲間と親睦を深めるために, など我々は日常の様々な場面で飲酒をする機会がある. しかし, 日本人のおよそ半数がアルコール分解酵素であるアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ ( 以下,ALDH) が低活性型もしくは非活性型であり, 生まれつきお酒に弱いか全く飲めない体質であると言われており, 肝機能を高めたり二日酔いを軽減したりする製品は需要が高く, 特にウコンやシジミを初めとする肝機能を高めるとされる食品が多く含まれた製品が販売されている. そのような製品がある一方, キュウリはお酒と共に摂取すると二日酔いが軽減できるといわれている. 果実に含まれるアルコール分解酵素であるアルコールデヒドロゲナーゼ ( 以下,ADH),ALDH が体内でアルコールおよびアセトアルデヒドを分解することによって二日酔いの軽減に関与するものと考えられる. 胃や肝臓に多くのアルコール分解酵素が存在することによりアルコールを効率的に分解することができる. 他にアルコール分解酵素を持つことが分かっているキュウリと同じウリ科植物としてヘチマ, ニガウリ, トウガン, シロウリがある 1) が, その他のウリ科植物については分かっていない. 他のウリ科植物としてはスイカやメロンなど身近な果実も多いため, ヘチマやニガウリに比べて飲酒の際に摂取しやすくお酒に弱い人たちの一助となると思われる. また, ウリ科植物の果実を用いた新しい健康食品の開発に役に立つことも考えられる. よって本実験では他の様々なウリ科植物を用いて, アルコール分解酵素を発見し, その活性を評価することにした. 2. 目的各種ウリ科植物に含まれるアルコール分解酵素 ADH,ALDH の活性の有無, 及び活性の評価をする.

2 3. 原理 3.1. アルコール分解酵素 1) ADH は, アルコール代謝の律速酵素である.ADH による反応は, 可逆的で, 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド ( 以下,NAD) を特異的な酵素として利用し,1 式で表せる. C 2H 5OH+NAD + CH 3CHO+NADH+H + 1 エタノール代謝により生成したアセトアルデヒドは ALDH によって分解される. ALDH は 2 式に従い, アセトアルデヒドを酢酸に不可逆的に酸化する. CH 3CHO+H 2O+NAD + CH 3COOH+NADH+H + 2 一般に ADH 及び ALDH 活性が高いほど, アルコールは効率的に分解される. よって本実験では生成された NADH の濃度を吸光度測定により測定することで ADH 及び ALDH 活性を調べ, アルコール分解効果を評価する紫外可視分光光度計 (UV-vis) 2) ランベルト-ベールの法則この法則は, 紫外可視吸光度測定法, 原子吸光光度法, 蛍光光度法, 赤外吸収スペクトル測定法, 旋光度測定法と, 多くの分光分析法にあてはまる重要な法則である. 入射光の強度 (I 0) と透過光の強度 (I) の比を透過度 (t) といい, それを % で表したものを透過率 (T) という. 吸光度 (A) とは, 透過度の逆数の常用対数である. 透過度の値が減少すると, 吸光度の値は増加する. 透過度が 1 のとき, 吸光度は 0 であり, 透過度が 0.1 のとき吸光度は 1 になる. t=i o/i 3 T= t 100= I o/i A=log I o/i 5 ランベルト-ベールの法則は, 吸光度は層長の長さに比例するというランベルトの法則と, 吸光度は試料の濃度に比例するというベールの法則を合体させたものである. 層長 (l) と濃度 (c) との積に定数であるモル吸光定数 ε, または比吸光度 E を乗じたものが, 吸光度 (A) になる.

3 A=εcl 6 A=Ecl 紫外可視吸光度測定法 3) 基本構成は, 光源分光部試料部測光部, 記録部である. 特定波長の光を, 試料中の分子に照射してどのくらい吸収されたかを調べる装置になっている. 光源は通例, 紫外線 (200~400 nm) を出すためには重水素放電管を使用し, 可視光線 (400~800 nm) を出すためにはタングステンランプやハロゲンタングステンランプを使用する. 分光部はプリズムや回折格子が利用されることが多い. 簡易的にフィルターを使ったものは光電光度計と呼ばれ, 取り出す波長が幅広く精密な測定には不向きである. 試料は通常,1 cm 1 cm の角型の二面が透明の容器に入れる. また, ガラスは紫外線を通さないため, 紫外線での測定の場合, 石英製のセルを使用しなければならない. 測光部で光強度を光電子増倍管で電気強度に変換して, コンピュータで処理し吸光スペクトルを製作する. 4. 実験 4.1. 試薬エタノール 4) ethanol 分子式 :C 2H 5OH 分子量 :46.07 融点 : 沸点 : 引火点 :13 危険性 : 引火性用途 : 基質無色, 特有の芳香を有する揮発性の液体で可燃性. 水, ジエチルエーテルなどと任意の割合で混和.

4 ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド 5) nicotinamide adenine dinucleotide 分子式 :C 21H 27N 7O 14P 2 分子量 : 融点 :160 沸点 : 無引火点 : 不燃性危険性 : 無用途 : 反応溶液中の補酵素白色粉末. 吸湿性. 水に易溶. 一般に酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド ( 以下,NADH) は酸性で比較的安定. アルカリ性で不安定.NAD はこの逆. 多くの脱水素酵素の補酵素として, 生体酸化還元系で水素原子伝達をする. グリシン 6) glycine 分子式 :NH 2CH 2COOH 分量 :75.07 融点 : ( 分解 ) 沸点 : 無引火点 : 不燃性危険性 : 無用途 : 緩衝溶液水に易溶, ピリジンやエタノールに微溶, ほかの有機溶媒に不溶. 水酸化ナトリウム 7) sodium hydroxide 分子式 :NaOH 分子量 :40.0 融点 :318 沸点 :1388 引火点 : 不燃性危険性 : 腐食性用途 : 緩衝溶液常温では無色, 斜方晶系固体. 潮解性を示す. 溶解に伴い発熱する.

5 ピラゾール 8) pyrazole 分子式 :C 3H 4N 2 分子量 :68.08 融点 :67-70 沸点 : 引火点 : 不燃性危険性 : 無用途 : 反応溶液中 ADH 阻害剤ピリジン様臭のある針状晶またはプリズム晶. 水, エタノール, エーテル, ベンゼンに易溶. 水溶液は中性.pKa=2.5. EDTA( エチレンジアミン四酢酸 ) 9) ethylenediaminetetraacetic acid 分子式 :C 10H 16N 2O 8 分子量 : 融点 :250 ( 分解 ) 沸点 : 無引火点 : 不燃性危険性 : 刺激性用途 : 反応溶液中キレート剤白色結晶性粉末. 水に微溶, 有機溶媒には不溶. 二ナトリウム塩は水に易溶. 窒素, 酸素配位の五座ないし六座配位子として働き, 多くの金属イオンときわめて安定な金属キレート化合物をつくる. このとき, 金属と EDTA が結合するモル比は常に 1:1 である. 金属間で選択性が小さい. ピロリン酸ナトリウム( 二リン酸ナトリウム十水和物 ) 10) sodium diphosphate decahydrate 組成式 :Na 4P 2O 7 10H 2O 分子量 : 融点 :79 沸点 :94 ( 分解 ) 引火点 : 不燃性危険性 : 有害 ( 経口 ), 皮膚刺激用途 : 緩衝溶液白色粉末. 水に可溶で, アルカリ性を呈する. 水溶液は煮沸により次第に加水分解して Na 2HPO 4 を生じる. 十水和物は単斜晶系晶.

6 アセトアルデヒド 11) acetaldehyde 分子式 :C 2H 4O 分子量 :44.05 融点 :-123 沸点 :20.2 引火点 :-38 危険性 : 引火性, 発がん性, 有害 ( 経口, 経皮, 蒸気吸入 ) 用途 : 基質特有の刺激臭を有する液体. 水, エタノール, エーテルなどと任意に混和. 重合しやすく, 低温で塩化水素を作用させれば重合度の高いメタアルデヒドとなる. 塩酸 12) hydrochloric acid 化学式 :HCl 分子量 :36.46 沸点 :100 危険性 : 金属腐食性, 皮膚腐食性 / 刺激性, 目に対する重篤な損傷性, 呼吸器感作性, 特定標的臓器毒性 ( 単回暴露 ), 特定標的臓器毒性 ( 反復暴露 ), 水生環境有毒性 ( 急性 ) 用途 : 酵素の酸耐性評価のため塩化水素の水溶液. 実験室では NaCl に硫酸を加え, 加熱して発生した塩化水素ガスを水に溶かして得られる. 多くの金属と反応して水素を発生し, 塩化物をつくる. 気密容器に入れ保存する. 各種ウリ科植物キュウリ, カボチャ, メロン, スイカ, ズッキーニ 4.2. 器具ホームミキサー, ビーカー, 遠心分離機, フィルター, 液体窒素, コニカルビーカー, ホールピペット, マイクロピペッター, ヨーグルトメーカー ( 恒温槽として用いる ), 俎板, 包丁

7 4.3. 実験操作 ADH 活性測定 (1) 各種ウリ科植物の果実 20 g を予め冷却し, 冷やしたイオン交換水 ( 以下, 冷水 )80 cm 3 を加えてミキサーで粉砕した. その後, 遠心分離 (10000 rpm,30 分 ) を行った. その後, 上清を吸引濾過して得られた濾液をウリ科植物果実エキスとした. (2) 希釈した果実エキス 0.1 cm 3 および反応溶液 ( 終濃度で 2.4 mmol dm -3 NAD を含む 0.1 mol dm -3 グリシン-NaOH 緩衝液,pH10)1.8 cm 3 を混和し,25 で 3 分間プレインキュベートした. (3) 基質 (660 mmol dm -3 エタノール溶液 ) を加える前の溶液をブランク, 基質 0.1 cm 3 を加えたものをサンプルとして, 分光光度計を用いて 340 nm の吸光度を測定した ALDH 活性測定 (1) (1) と同様にウリ科植物果実エキスを作製した. (2) 希釈した果実エキス 0.1 cm 3 および基質以外の反応溶液 ( 終濃度で 4 mmol dm - 3 NAD,0.1mmol dm -3 ピラゾール及び 1 mmol dm -3 EDTA を含む 32 mmol dm - 3 ピロリン酸ナトリウム緩衝液,pH8)0.8 cm 3 を混和し,37 で 3 分間プレインキュベートした. (3) 基質 (80 mmol dm -3 アルデヒド溶液 ) を加える前の溶液をブランク, 基質 0.05 cm 3 を加えた溶液をサンプルとして, 分光光度計を用いて 340 nm の吸光度を測定した酸耐性評価 (1) 1 mol dm -3 塩酸を果実エキスに添加 ( 添加した体積については後述 ) し,20 分間温置したものを酸処理溶液とした. (2) 未処理のウリ科植物果実エキスに対する酸処理溶液の残存活性により, 酸耐性を評価した NADH 水溶液の検量線の作成 (1) 3 種類の異なる濃度 (0.107,0.092,0.046 mmol dm -3 ) の NADH 水溶液 ( 以下, NADHaq) を作製し, 吸光度測定をした. (2) 同量のイオン交換水の吸光度測定を行い, ブランクとした.

8 4.5. 夏休み以降の実験操作の変更点前期の実験では, 実験を 2 週に分けて行っていたため果実エキスの保存のために瞬間冷却を行っていたが, 夏休み中の実験から,1 日で果実エキスの作製から吸光度測定までを終えられるように計画を変更したため, 瞬間冷却を行わずにそのまま反応溶液, 基質との混和および吸光度測定の操作を行った. また, 前期の実験では ADH 活性測定, ならびに ALDH 活性測定の (1) の操作において吸引ろ過に Sterifilip-GP( 吸引ろ過用の滅菌済みフィルター付きの容器 ) を使用していたが, 夏休み以降は Sterifilip-GP を使用できなかったためサンプルの汚染を防ぐために吸引ろ過の操作も行わず, 遠心分離後の上清を果実エキスとして用いた. 5. 実験結果 5.1. ADH 活性測定時間と吸光度の変化を Table にまとめた. 果実名の後の数字は,4.3.1.ADH 活性測定 (2) における希釈倍率を表している. また, 希釈倍率が 1( 希釈を行っていない ) のサンプルに関しては瞬間冷却を行っていないサンプルである. Table ADH 活性測定における吸光度変化時間 /min. ブランクカボチャカボチャカボチャカボチャスイカスイカズッキーニメロンキュウリよって, どのサンプルも 60 分まで吸光度が上昇しているため,60 分での吸光度からブランクの値を引いた値を吸光度変化量とすると Table のようになる.

9 Table ADH 活性測定での吸光度変化量サンプル名吸光度変化量カボチャカボチャカボチャカボチャスイカスイカズッキーニメロンキュウリ ALDH 活性測定 5.1.ADH 活性測定と同様に時間と吸光度の変化を Table にまとめた. Table ALDH 活性測定における吸光度変化時間 /min. ブランクカボチャカボチャカボチャカボチャスイカスイカズッキーニメロンメロンキュウリキュウリ ALDH 活性測定においては分までほとんど吸光度の変化が見られない. よって 30 分での値からブランクの値を引いたものを吸光度変化量とすると Table のようになる.

10 Table ALDH 活性測定での吸光度変化量サンプル名吸光度変化量カボチャカボチャカボチャカボチャスイカスイカズッキーニメロンメロンキュウリキュウリ酸耐性評価 5.1., 5.2. と同様に酸処理溶液の残存活性について Table にまとめた. Table 酸処理溶液の ADH 活性測定における吸光度変化時間 /min. ブランクカボチャメロンキュウリなお酸耐性評価において,Table のサンプルのうちカボチャとメロンは果実エキスと 1 mol dm -3 塩酸が体積比 1:9, キュウリは 1:1 で混合している. 60 分の値からブランクの値を引いたものを吸光度変化量とし,Table にまとめた. Table 酸処理溶液の ADH 活性測定での吸光度変化量サンプル名吸光度変化量カボチャメロンキュウリ 0.002

11 吸光度 /ABS 5.4. NADH の検量線の作成 4.4.(1) よりそれぞれの溶液の吸光度をブランク処理した値を Table にまとめた. Table NADHaq の吸光度濃度 /mmol dm -3 吸光度以上より, 検量線は Fig のようになった y = x R² = 濃度 /mmol dm -3 Fig NADHaqの検量線この検量線を用いて, 酵素の分解反応により生成した NADH の濃度を求める. 5.1.ADH 活性測定,Table から求めた NADH 濃度を Table に示す. Table ADH 活性測定での NADH 濃度サンプル名 NADH 濃度 /µmol dm -3 カボチャカボチャカボチャカボチャ

12 スイカズッキーニメロンキュウリ Table を棒グラフの形にまとめたものが Fig である. なお, カボチャ 1 に関してはほとんど同様の値となったため, 平均を取っている. 300 NADH 濃度 /µmol dm Fig ADH 活性測定での NADH 濃度サンプル名同様に 5.2.ALDH 活性測定,Table より NADH 濃度は Table のようになる. Table ALDH 活性測定での NADH 濃度サンプル名 NADH 濃度 /µmol dm -3 カボチャカボチャカボチャカボチャスイカスイカズッキーニメロンメロン

13 キュウリキュウリ Table の結果を Fig にまとめた. なお,Fig と同様にカボチャ 1 に関しては 2 サンプルの平均を取った. 240 NADH 濃度 /µmol dm Fig ALDH 活性測定での NADH 濃度サンプル名 5.3. 酸耐性評価,Table より酸処理溶液の ADH 活性測定における NADH 濃度を求め Table にまとめた. Table 酸処理溶液の ADH 活性測定での NADH 濃度サンプル名 NADH 濃度 /µmol dm -3 カボチャメロンキュウリ考察まず,ADH 活性測定に関して,5.4.NADHaq の検量線,Table より生成した NADH の濃度を比較すると一番高い値となったサンプルはメロン 5 の µmol dm -3 であった. ただし, 同じ希釈倍率でもカボチャ 1 では 0.66 µmol dm -3 の差が生じており, 同種の果実を用いたサンプルでも, 果実の収穫時期や果実の使用部位によって含まれるアルコール分解酵素量に差が生じてしまう可能性が考えられる. よって本実験においてメロンのサンプルから高い値が得られたからといって一概にメロンに含まれるアルコール分解酵素量が多いとは言い難い.

14 また, カボチャのサンプルに関しては NADH 濃度が. カボチャ 1<カボチャ 10< カボチャ 5 となった. 希釈濃度が大きくなると酵素量が少なくなり,NADH 濃度も低くなると予想されるが, それと異なる結果となってしまった. カボチャ 1 に関しては 4.5. 夏休み以降の実験操作における変更点で述べた通り, 瞬間冷却および遠心分離後の吸引濾過を行っていないため特に吸引濾過を行っていないことによる不純物の混入などが考えられる. 次に,ALDH 活性測定に関しては希釈倍率が小さくなると NADH の生成量が少なくなっており濃度も NADH が生成したと言えるものはかなり少ない. また, サンプルによっては吸光度の値自体が ADH 活性測定に比べて小さいものも多い. 希釈倍率が小さくなると酵素量は増えるはずで,ALDH 活性が低下することは考えにくい. 本実験では時間の都合上, 行うことが出来なかった果実エキスの濃縮を行うことで ALDH 活性が確認される可能性がある. また, 酸耐性評価についてカボチャ, メロン, キュウリの 3 種について実験を行ったが, どのサンプルにおいても残存活性は確認されなかった. スイカについては実験を行った時期の都合上, 入手が不可能であったため行うことが出来なかった. また, 今回の酸耐性評価では予算の関係上, 先行研究で用いられていた生体酵素を含む人工胃液を作製できず 1 mol dm -3 塩酸を用いたため, 実際のヒトの体内で同じように残存活性が無くなるかどうかは不明である. ADH,ALDH 活性測定に多くの時間を割いてしまい, 酸耐性評価のサンプル数をあまり確保できず, 果実エキスと酸溶液の混合割合について最適なものを見つけられなかった. また, 実験で用いる試料果実の調達に関して大量の野菜果実の保存が出来なかったために産地や収穫時期を統一したものを用意することができなかった. 希釈倍率の振り方と試料果実の調達方法を工夫することでより良い結果が得られると思われる. 7. 結論ウリ科植物であるキュウリ, カボチャ, スイカ, メロンについてアルコール分解酵素 ADH が含まれていることが分かった.NADH の生成量で比較した場合, メロンの値が一番高い, という結果が得られた, しかし実際にどの果実に多く含まれているかについては産地や時期, 旬など多くの要素によって影響を受ける可能性があり, 一概には言えないと考える. また ALDH については活性が確認されないサンプルが多く, その原因の特定に至らなかった. 果実エキスの濃縮を行うことで活性が確認される可能性がある. また, 酸耐性評価についても本実験では残存活性ゼロ, という結果になったが, 実際にヒトの体内で同様の結果が得られるか不明である.

15 8. 展望同産地で収穫時期も同じころと見込まれる試料果実を大量に購入し, 保存する方法の確立, および人工胃液を用いた酸耐性評価を行うことによってより正確に果実中の酵素活性について評価できると思われる. 参考文献 (1) 南方資源利用技術研究会, 沖縄県産ウリ科植物に含まれるアルコール及びアルデヒド分解酵素を利用した健康食品の開発, 取得 (2) 金子希代子, 川原正博, 神崎愷, 小林茂樹, 定金豊, 馬渡健一, 中込和哉, 秋澤俊史, 分析化学 Ⅱ 機器分析編, 朝倉書店,2008,p (3) 中田宗隆, なっとくする機器分析, 講談社,2007,p (4) 大木道則他, 化学大辞典, 東京化学同人, 第 7 刷 2003,p165 (5) 化学大辞典,p (6) 化学大辞典, p384 (7) 化学大辞典, p704 (8) 化学大辞典, p1174 (9) 化学大辞典, p172 (10) 化学大辞典,p1038 (11) 化学大辞典, p25 (12) 吉村壽次, 化学辞典第 2 版, 森北出版,2009,p202 謝辞春輪講にあたり, 多くの意見をくださった先輩方, 遠心分離および瞬間冷却の操作に協力いただいた東京理科大学理学部第一部応用化学科鳥越研究室の皆さま, 夏休み以降の実験において全面的にご協力いただいた東京理科大学理学部第一部教養学科武村研究室の深谷先輩に深く御礼申し上げます.

東京理科大学 Ⅰ 部化学研究部 2016 年度春輪講書ウリ科植物におけるアルコール分解酵素含有量の比較 2016 年火曜班 Tanaka,M.(2K),Baba,H.(2K),Sato,M.(2K) 1. 背景酒は百薬の長という言葉の通り, 少量の飲酒は血液の脂質代謝を改善し, 冠動脈疾患 (

東京理科大学 Ⅰ 部化学研究部 2016 年度春輪講書ウリ科植物におけるアルコール分解酵素含有量の比較 2016 年火曜班 Tanaka,M.(2K),Baba,H.(2K),Sato,M.(2K) 1. 背景酒は百薬の長という言葉の通り, 少量の飲酒は血液の脂質代謝を改善し, 冠動脈疾患 ( 東京理科大学 Ⅰ 部化学研究部 2016 年度春輪講書ウリ科植物におけるアルコール分解酵素含有量の比較 2016 年火曜班 Tanaka,M.(2K),Baba,H.(2K),Sato,M.(2K) 1. 背景酒は百薬の長という言葉の通り, 少量の飲酒は血液の脂質代謝を改善し, 冠動脈疾患 ( 狭心症心筋梗塞 ) の危険性を下げるという調査結果がある. しかし日本人はアルコール分解酵素である

東京理科大学 Ⅰ 部化学研究部 2016 年度秋輪講書 ウリ科植物におけるアルコール分解酵素含有量の比較 2016 年火曜班 Eguchi,N.(1K),Kikuchi,E.(1OK),Taketomi,H.(1K),Naradate,M.(1K),Fukushima,M.(1K), Sugawar

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