GC/MS法によるエストロゲン類抱合体の分析法の検討

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1 1 (2) 2 下水処理におけるエストロゲンの挙動 ~ 処理方式による比較 ~ 施設管理部環境管理課宮島潔 今井美江 相馬英雄 関口郁子 石井実 1. はじめに平成 9 年 9 月 シーア コルボーン博士らの著した 奪われし未来 が日本語に翻訳 刊行された これを契機として 内分泌かく乱化学物質 いわゆる環境ホルモンによる生態系への影響に関する話題が新聞等のマスメディアに取り上げられるようになり 社会問題化した 下水道分野においても精力的な調査が行われ 調査対象とした物質の多くについて 下水処理場は ある程度の低減効果を有していることが明らかになった 1) しかしながら 環境ホルモンを下水処理過程で完全に除去できるわけではないので 流入した物質の一部は 放流水に含まれ河川等の公共用水域に移動している 和波らは 多摩川等での調査研究により 内分泌かく乱化学物質のなかで魚類の生殖異変を起こす可能性の高い物質は天然エストロゲン ( 女性ホルモン ) であって そのほとんどは下水処理場 ( 水再生センター ) から排出されていることを報告した 2 ) また 塩田らは 下水処理水を 2 倍濃縮した試験区において遺伝的オスメダカの 6% が機能的なメスに性転換した実験結果を報告している 3) 現在 環境ホルモンに関する社会的関心は沈静化した状況となっている しかし 近年 水生生物の生息環境を保全する機運が高まりつつあり 放流水中の微量物質を考慮した維持管理が求められる可能性がある このような背景から エストロゲン様物質の除去と水処理条件について把握することを目的として 本調査を実施した 2. エストロゲンの経時変化天然のエストロゲンには 17β-エストラジオール () エストロン() 及びエストリオール () がある これらのエストロゲンは 大部分がグルクロン酸や硫酸等の抱合体として不活化された形態でヒトから排泄される 4) 図 1 に 遊離体のエストロゲン ( ) 及び主な抱合体の構造式を示した 抱合体では 3 位または 17 位等に グルクロン酸などが結合している これらの抱合体 遊離体については 遺伝子組換え酵母を用いる検査方法により 女性ホルモンとしての作用強度 ( エストロゲン様活性 ) が報告されている 5) その中で の活性値を1としたときの抱合体の比活性値は 1 分の 1 未満の値とされている 下水に含まれるエストロゲンは 下水管渠内の流下過程においてその一部が脱抱合されて活性の高い遊離体に戻ると考えられている のグルクロン酸抱合体に関しては 活性汚泥処理により一部が脱抱合されて を生成し その後 の一部は に さらに生成した は他の未知物質に分解することが報告されている 4) また 当局の調査においては 第二沈殿池での固液分離後に が増加する現象が観測されている 6) 本来 エストロゲンの水処理過程での挙動を探るためには 遊離体だけでなく抱合体を含めて分析し 評価することが望ましい 当課では 外因性内分泌攪乱化学物質調査暫定マニュアル環境庁水質保全局水質管理課平成 1 年 1 月 ( 以下 マニュアルと記す ) に準拠して抱合体分析の検討を行ったところ 本法では十分な回収率が得られないことを

2 図 1 エストロゲン遊離体 及び主な抱合体の構造式 確認することができた 7 ) ただし 分析方法を確立するまでには至っていない そこで エストロゲン遊離体だけの分析結果により 放流水の影響を大まかに把握できるかどうかを検討した 下水管渠内で起こるといわれている エストロゲン抱合体から遊離体への脱抱合反応が 処理過程及び処理水についてもみられるのかどうか机上実験を行った 2.1 実験方法中野水再生センター第二沈殿池越流水を遮光性のガラスねじ口瓶 ( 容量 3 リットル ) にほぼ満水とし アスピレーターにて 5 分間 脱気処理を行った その後 密栓してマグネチックスターラーによる攪拌のみの放置条件と 試料をステンレス容器 ( 容量 5 リットル ) に移してボールフィルターにより曝気する ( 酸素供給 ) 条件の 2 条件を設定した 実験開始時 5 時間経過後及び 24 時間後の試料を得るため ねじ口瓶及びステンレス容器を試料数と同じ数量だけ準備して 各時間経過後のエストロゲン濃度 ( ) を測定した なお 分析手順はマニュアルに準拠し ガスクロマトグラフ質量分析計を用いて分析を行った また 反応槽最終回路で採取した活性汚泥混合液について 攪拌のみの放置による経時変化を調べた なお 実験に用いた活性汚泥混合液は 各時間経過後に遠心分離 及びろ過を行い 得られたろ液を測定対象とした 2.2 結果及び考察各時間経過後のエストロゲン測定結果を図 2 に示す 処理水の試料では 攪拌のみで酸素供給のない条件 曝気条件のいずれも 濃度の総量は上昇せず 5 時間経過までに 1 割 7 程度減少した後 安定していた ここには示していないが 別報 ) において処理水中の硫酸抱合体 1 物質 (-3S) が遊離体 () とほぼ同量含まれることを確認している 一方 活性汚泥混合液の場合 攪拌のみの条件においてろ液中のエストロゲン濃度が増加した これは 第二沈殿池での固液分離後に が増加する現象 6) と類似している 処理水と活性汚泥混合液との結果から 放置によりエストロゲンが増大する反応は 活

3 性汚泥に起因していると考えられること から 活性汚泥をほとんど含まない処理 水に関しては 24 時間の範囲内でエスト ロゲンの増加は起こらないと推測された 水再生センター放流口周辺は 一般に コンクリート水路である コンクリート 水路においては 放流水のごく一部が付 着藻類等の微生物と接触するだけであり 微生物の働きによる脱抱合反応は顕著で ないと考えられる このことから 放流 口周辺では 放流水中の DO が運転条件 等により低下したとしてもエストロゲン が増大する可能性は低い したがって 遊離体だけの測定であっ ても放流口周辺に生息する生物へ与える 影響を表現できる可能性があると考え 次項の実態調査を行った 3. 処理方式の異なる系列におけるエストロゲン濃度エストロゲンの除去率は 生物反応槽での滞留時間と関係があり 処理時間が長くなると除去が進む傾向にあると報告されている 1 ) そこで 同じが 処理方式の異なる生物反応槽に分配される水再生センターを選定し 水処理条件の違いによりエストロゲン濃度に差があるのかどうか調べた エストロゲン濃度 (ng/l) エストロゲン濃度 (ng/l) エストロゲン濃度 (ng/l) 経過時間 ( 時間 ) (a) 処理水 ( 攪拌のみの条件 ) 5 24 経過時間 ( 時間 ) (b) 処理水 ( 曝気条件 ) 5 24 経過時間 ( 時間 ) (c) 活性汚泥混合液ろ液 ( 攪拌のみの条件 ) 図 2 放置時間とエストロケ ン濃度との関係 3.1 調査方法 (1) 調査施設 及び調査日 中川水再生センター調査日 : 平成 18 年 12 月 18~19 日試料 : 標準系列処理水 A 2 O 系列処理水 多摩川上流水再生センター調査日 : 平成 19 年 1 月 15~16 日試料 : 標準系列処理水 A 2 O 系列処理水 三河島水再生センター調査日 : 平成 19 年 1 月 15~16 日試料 : AO 系列処理水 担体添加ステップ A 2 O 系列 ( 以下 担体系列 と略す ) 処理水

4 (2) 採取方法 及び測定手順各試料は 自動採水装置により 調査第 1 日目の午前 11 時から 2 時間ごとに 12 回採水した後 流量比例となるように必要量を混合した 調製した混合試料は クーラーボックスに入れて速やかに中野水再生センター内の試験室に持ち帰り 前処理作業を行った なお 事前に自動採水装置のサンプル瓶 ( ポリプロピレン製 ) からエストロゲンが溶出していないことを ガラス容器との比較試験 ( 各容器に超純水を満たして 24 時間放置後に分析 ) により確認している 測定項目には 遊離体のエストロゲン ( ) だけでなく 試料のエストロゲン作用を総合的に測定できるエストロゲン様活性 ( 遺伝子組換え酵母 Two-Hybrid 株 ) を併用することとした エストロゲン様活性の測定方法は 標準プロトコル 8) にしたがった 3.2 結果及び考察各センターの運転状況 エストロゲン測定結果をそれぞれ表 1 図 3 に示す エストロゲン濃度の総量に注目すると いずれのセンターにおいても に比べて処理水の方が大きかった これは 生物反応槽において脱抱合したエストロゲンが処理水中で検出されたと推測されるが 詳細な検討を行っていないため原因は不明である 各センターにおいて系列の異なる処理水を比較すると 中川 多摩川上流のどちらも エストロゲン濃度は反応槽滞留時間の長い A 2 O 系列の方が標準系列に比べて低濃度であった このことから 反応槽の滞留時間がエストロゲンの低減効果に寄与していると考えられた 一方 三河島については 担体系列のエストロゲン濃度が対照となる AO 系列のそれに比べて高濃度であった 担体系列では 硝化担体によって反応槽内の生物量を AO 表 1 調査時の運転状況 及び一般項目の水質分析結果 最終回路 ( 計測器 ) 平均 MLSS 平均 DO NH3-N T-N T-P 対照系列標準系列 調査系列 A 2 O 系列 最終回路 ( 計測器 ) 平均 MLSS 平均 DO NH3-N T-N T-P 対照系列標準系列 調査系列 A 2 O 系列 最終回路 ( 計測器 ) 平均 MLSS 平均 DO 中川水再生センター 反応槽滞留時間 (hrs) 多摩川上流水再生センター 反応槽滞留時間 (hrs) 三河島水再生センター 反応槽滞留時間 (hrs) *1) 好気槽滞留時間 (hrs) 好気槽滞留時間 (hrs) 好気槽滞留時間 (hrs) *1) NH3-N *2) 水質 *2) 水質 *2) 水質 T-N T-P 対照系列 AO 系列 調査系列担体系列 *1) 担体添加系列ではをステップ流入させているが 滞留時間の欄には 槽の容量を 処理水全量で除して求めた値を記載した *2) NH3-N T-N T-P は それぞれアンモニア性窒素 総窒素 総りんを表す

5 系列よりも高めて処理時間の短縮を図っている 採水日の処理水量と反応槽の容量から計算した担体系列の反応槽全体の滞留時間 (8. 時間 ) は AO 系列のそれ (7.8 時間 ) とほぼ同じであったものの 好気槽滞留時間 (2.7 時間 ) は AO 系列のそれ (6.8 時間 ) に比べると小さかった 担体系列は アンモニア性窒素 総窒素が AO 系列よりも低く ( 表 1) 短い処理時間で硝化脱窒を促進できる処理法である 窒素等の分析結果だけでは明確なことはいえないが 硝化担体に由来する生物は硝化を効率良く促進する働きがあるものの エストロゲン除去に関しては効果的に働くわけではない ということが示唆された 遺伝子組換え酵母を用いたエストロゲン様活性の測定結果を図 4 に示す センターごとに結果を見ると 各試料の相対的な大小は GC/MS で測定したエストロゲンの合計値と同様の傾向を示していた しかしながら このエストロゲン様活性値は GC/MS により得た 及び 濃度とそれぞれの比活性値 ( :1 :.4 :.1) 9) から算出したエストロゲン強度の総和とは隔たりがあった 酵母法 (Two-Hybrid 株 ) では 下水試料の場合 酵母の増殖阻害による測定妨害の事例が報告されており 1) これが GC/MS の結果から算出した値よりも小さくなった一因ではないかと推測した エストロゲン濃度 (ng/l) 標準系 A2O 系処理水 エストロゲン様活性 (ng-/l) 標準系 A2O 系処理水 (a) 中川水再生センター (a) 中川水再生センター エストロゲン濃度 (ng/l) 標準系 A2O 系処理水 (b) 多摩川上流水再生センター エストロゲン様活性 (ng-/l) 標準系 A2O 系処理水 (b) 多摩川上流水再生センター エストロゲン濃度 (ng/l) AO 系担体系処理水 エストロゲン様活性 (ng-/l) AO 系担体系処理水 (c) 三河島水再生センター (c) 三河島水再生センター 図 3 生物処理前後のエストロゲン濃度 図 4 生物処理前後のエストロケ ン様活性

6 4. まとめ処理水中のエストロゲンの経時変化について机上実験を行った後 水再生センターにおいて実態調査を行った その結果 以下のことがわかった (1) 処理水中の遊離エストロゲンは 曝気条件下 酸素供給のない攪拌条件下のいずれの場合も 実験開始から 24 時間経過後までに濃度の上昇は認められなかった (2) 反応槽滞留時間の長い A 2 O 系列では 標準系列と比べて処理水のエストロゲン濃度が低下していた 参考文献 1) 国土交通省都市 地方整備局下水道部, 平成 12 年度下水道における内分泌攪乱化学物質に関する調査報告書 ( 案 ), 平成 13 年 3 月. 2) 和波一夫ら, 多摩等の環境ホルモン問題に関する研究 ( その 1), 東京都環境科学研究所年報 2, pp.66-73, 平成 14 年 12 月. 3) 塩田勉ら, 下水処理水中の化学物質がメダカに及ぼす影響, 東京都環境科学研究所年報 2, pp.9-96, 平成 14 年 12 月. 4) 松井三郎ら, 天然および人工エストロゲンの下水道と環境中での挙動, 化学総説, NO.5, pp.86-92, 1. 5) 中田典秀ら, 下水および河川水試料に含まれるエストロゲン様物質の探索手法の検討, 環境化学,Vol.16, No. 3, pp , 6. 6) 松木正浩, NCI-GC/MS を用いた下水中のエストロゲン分析法の検討及び実態調査, 東京都下水道局技術調査年報 5 (CD-ROM). 7) 今井美江ら, GC/MS 法によるエストロゲン抱合体の分析, 東京都下水道局技術調査年報 7 (CD-ROM). 8) 西川淳一, エストロゲン様物質の検出系, ファルマシア, 35, 3, pp.241~245 (1999). 9) 島津暉之ら, 多摩川等の環境ホルモン問題に関する研究 ( その 3), 東京都環境科学研究所年報, pp , 平成 12 年 12 月. 1) 宮本宣博ら, 遺伝子組み換え酵母法による下水中のエストロゲン様活性の測定, 土木技術資料, 44, 7, pp.22~27 (2).