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きみのしんかやぬま
5 years ago
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1 ショットガンプロテオミクスが解き明かす修飾シグナル東京大学医科学研究所疾患プロテオミクスラボラトリー尾山大明

2 シグナル複合体のショットガンプロテオミクス解析

3 Methodology for sample preparation towards proteomic analysis Protein complex mixture Conventional sample preparation Easy-Step sample preparation SDS-PAGE Gel slicing In-gel digestion In-solution digestion Sample loss Peptide Recovery Low Analysis throughput High

4 従来法電気泳動による複合体構成因子群の分離各ゲルバンドスポットの切り出しタンパク質同定

5 Methodology for Easy-Step sample preparation towards high-throughput shotgun proteomic analysis Protein complex mixture Conventional sample preparation Easy-Step sample preparation SDS-PAGE Gel slicing In-gel digestion In-solution digestion Sample loss Peptide Recovery Low Analysis throughput High

6 高感度ショットガン同定法タンパク質複合体を丸ごと酵素消化包括的タンパク質同定

7 プロテオミクス解析に向けたサンプル調製の方法論 [1] 質量分析によるタンパク質同定に向けた予備検討まず銀染色キットなどによって量的な見積もりを行うこの時量が既知の標準タンパク質 ( 例 :10, 50, 100 ng の BSA) を同時に泳動し解析対象であるタンパク質量のオーダーをきちんと確認する [2] タンパク質複合体を構成するタンパク質群の包括的同定解析 1 発現系を利用する場合は標的タンパク質に FLAG タグを付与し抗 FLAG 抗体によって複合体の精製を行う抗体からの溶出は 1 FLAG ペプチドを用いる 2 抗体による内在性複合体の精製を行う場合は 0.1 M グリシン酸性溶液 (ph 1.0~3.0) によって溶出を行い 1 M Tris-HCl 溶液 (ph 9.0) で中和する

8 共同研究を行う場合の基本的な流れ 1. 予備検討結果を基に調製法の改善が必要か否かに関して十分な打ち合わせを行い本測定サンプルに関する調製法の詳細を決定する 2. 別途スケジュールを設定し東京大学医科学研究所疾患プロテオミクスラボラトリーにて各研究課題の実験担当者に分析サンプルの調製を行って頂く作成したサンプルは質量分析担当者の方で一時保存する 3. 質量分析測定及びタンパク質同定解析を行い結果がまとまり次第各研究課題の担当者に報告する

9 高精度定量プロテオミクス技術に基づく時系列動態解析

intensity ヒト扁平上皮癌 A431 細胞における時系列チロシンリン酸化プロテオーム解析 Human epithelial A431 cells High EGFR expression EGF treatment triggers loss of cell-cell junction, leading to epithelial-mesenchymal transition 12 C6

10 intensity ヒト扁平上皮癌 A431 細胞における時系列チロシンリン酸化プロテオーム解析 Human epithelial A431 cells High EGFR expression EGF treatment triggers loss of cell-cell junction, leading to epithelial-mesenchymal transition 12 C6 14 N4-Arg 13 C6 14 N4-Arg 13 C6 15 N4-Arg Ligand stimulation time sets 0 min 1 min 0.5 min 0 min 1 min 2 min 0 min 1 min 5 min 0 min 1 min 10 min 0 min 1 min 15 min 0 min 1 min 20 min 0 min 1 min 25 min 0 min 1 min 30 min m/z

11 Fold Activation Fold Activation Fold Activation Fold Activation 上皮成長因子刺激によるヒト A431 細胞内チロシンリン酸化エフェクター群の時系列活性動態解析 Stimulation Time (min) EGFR PLCγ1 Vav 2 SHP Stimulation Time (min) Integrin β4 Junction Plakoglobin Catenin δ1 Plakophilin 3 Cadherin Collagen XVII Villin 2 Actinin α4 Catenin α1 Caveolin 1 α-tubulin AHNAK nucleoprotein cytoplasmic FMR1 interacting protein 1 NCK-associated protein 1 Rho GEF 5 Stimulation Time (min) Stimulation Time (min) (Oyama et al., Mol. Cell. Proteomics, 2009)

12 シグナル阻害剤を用いた情報伝達ネットワークに関する定量的活性変動解析 Human epithelial A431 cells 12 C6 14 N4-Arg 13 C6 15 N4-Arg EGF 1 min No perturbation Perturbation with 5 μm PP2 (1, 4, 9, 14 min) Combine cell lysates in equal ratio Quantification of perturbation effect by nanolc-ms/ms

13 PP2 EGFR (Src Interactor) PP2 Catenin δ1 (Src Interactor) Src ファミリー阻害剤 PP2 による各 EGF エフェクターの時系列活性変動プロファイル PP2 Caveolin 1 (Src Interactor) PP2 Villin :EGF-induced profile :PP2-perturbed profile

14 PP2 による EGF シグナルネットワークの定量的摂動解析 (Oyama et al., Mol. Cell. Proteomics, 2009)

代表的 EGF エフェクター群に関する PP2 依存的活性変動プロファイル Receptor Internalization Cell adhesion Cell structure Classical cascades EGFR 0.69 SHC 0.54 Grb 2 0.44 MAPK1 0.79 Cbl Cbl b Eps 15 Endofin Hrs 0.23 0.14 0.23 0.03 0.

15 代表的 EGF エフェクター群に関する PP2 依存的活性変動プロファイル Receptor Internalization Cell adhesion Cell structure Classical cascades EGFR 0.69 SHC 0.54 Grb MAPK Cbl Cbl b Eps 15 Endofin Hrs Other EGFR effectors Vav 2 PTPN Integrin β4 Cadherin 1 Catenin β1 Junction Plakoglobin Plakophilin 3 ZO1 ZO2 Catenin δ Collagen XVII Caveolin 1 Caveolin 2 Catenin α1 Moesin Villin 2 Beta actin Tubulin α Tubulin β PLCγ Underlined italics : Molecules annotated as c-src interactors in HPRD

16 時系列プロテオミクスデータに基づく数理システム解析

17 プロテインマイクロアレイを用いた EGF 受容体チロシンリン酸化部位と SH2/PTB ドメインタンパク質群との網羅的相互作用解析 ErbB1 ErbB2 ErbB3 ErbB4 Yamamoto et al., InTech, 2011 Jones et al., Nature, 439: , 2006

18 EGFR Y992F 変異による EGF シグナル伝達系の制御システム解析 Identify aberrant signaling pathways Pathway Analysis Predict causative mechanisms Quantitative Phosphoproteomics Computational Simulation (Tasaki et al., PLoS ONE, 2010)

Tyrosine phosphorylation EGFR Y992F 変異による EGF シグナル伝達系の定量リン酸化プロテオーム解析 3.0 2.0 catenin, delta 1 1.5 1.0 epidermal growth factor receptor isoform a 1.5 1.0 1.5 1.0 phospholipase C, gamma 1 1.0 0.5 0.

19 Tyrosine phosphorylation EGFR Y992F 変異による EGF シグナル伝達系の定量リン酸化プロテオーム解析 catenin, delta epidermal growth factor receptor isoform a phospholipase C, gamma heat shock protein Cdc42 binding protein kinase beta epidermal growth factor receptor pathway substrate HGF-regulated tyrosine kinase substrate Casitas B-lineage lymphoma b cytoplasmic FMR1 interacting protein fer protein kinase mitogen activated protein kinase tensin src homology 2 domaincontaining transforming protein C target of myb1-like tubulin, alpha 1 WT Y992F tubulin, alpha zinc finger, FYVE domain containing 16 EGF stimulation time (min)

20 EGF 刺激依存的リン酸化活性変動に関するパスウェイ解析 Phosphorylation amount (Y992F/WT) Decrease Increase EGFR and some adaptor proteins The downstream molecules of EGFR

21 時系列パターン変化に関するパスウェイ解析 Temporal pattern deviation (WT-Y992F) No-changed Changed WT Y992F The molecules related to EGFR degradation pathway The upstream molecules of Erk

22 Fold Activation チロシンリン酸化ダイナミクスデータに基づくパラメータ推定 Model 0.0 Parameter estimation EGF stimulation time (min) Data

23 EGF 刺激依存的チロシンリン酸化シグナル伝達系に関する数理モデル解析 Y992F 変異体 EGF シグナル伝達系を規定する生化学反応パラメータ 1. EGFR のユビキチン化 Grb2 との解離 2. Gab1 Shc PLCγ1 Shp2 のリン酸化 3. EGFR Grb2 Shp2 Gab1 Cbl Src のタンパク質量 (Tasaki et al., PLoS ONE, 2010)

24 リン酸化プロテオミクスと遺伝子発現情報に基づく統合オミクス解析

25 ヒト乳癌細胞におけるリン酸化プロテオームと遺伝子発現情報の統合システム解析 Analysis target: wild type MCF-7 (WT), tamoxifen-resistant MCF-7 (TamR) (0, 1, 2, 5, 10, 30, 60 min) (0, 1, 2, 3, 6, 12, 24, 48 hr) (Oyama et al., J. Biol. Chem., 2011)

intensity 抗チロシンリン酸化抗体と Phos-Tag を用いた時系列リン酸化プロテオーム解析 SILAC-encoded cells 12 13 C6 14 N4-Arg C6 14 N4-Arg 13 C6 15 N4-Arg ligand stimulation time 0 min t 1 min t 2 min Combine cell lysates in equal

26 intensity 抗チロシンリン酸化抗体と Phos-Tag を用いた時系列リン酸化プロテオーム解析 SILAC-encoded cells C6 14 N4-Arg C6 14 N4-Arg 13 C6 15 N4-Arg ligand stimulation time 0 min t 1 min t 2 min Combine cell lysates in equal ratio Affinity purification with anti-ptyr antibodies Tryptic digestion nanolc-ms/ms analysis 1:4:2 Tryptic digestion Affinity purification with Phos-tag agarose 1:5:3 1:1:1 Protein identification and quantification by nanolc-ms/ms m/z

27 癌化シグナル依存的にリン酸化活性が変動した 286 種類の情報伝達因子群に関する相互作用ネットワーク (Oyama et al., J. Biol. Chem., 2011)

28 癌化シグナル依存的に発現レベルが変動した 1,603 種類の遺伝子群に関する階層的クラスタリング (Oyama et al., J. Biol. Chem., 2011)

29 ヒト乳癌薬剤耐性細胞におけるリン酸化シグナル因子群と遺伝子発現関連転写因子群の活性相関 E2 刺激 HRG 刺激 MAPK AP-1 GSK3β CREB (Oyama et al., J. Biol. Chem., 2011)

Disease-free survival (%) Breast cancer-specific survival (%) 乳癌患者組織検体を用いた phospho-gsk3β (Ser 9) に関する免疫組織化学的解析 phospho-gsk3 (S9) immunoreactivity phospho-gsk3 (S9) immunoreactivity 100 + (n = 48) 100

30 Disease-free survival (%) Breast cancer-specific survival (%) 乳癌患者組織検体を用いた phospho-gsk3β (Ser 9) に関する免疫組織化学的解析 phospho-gsk3 (S9) immunoreactivity phospho-gsk3 (S9) immunoreactivity (n = 48) (n = 48) (n = 34) (n = 34) P = P = Month after operation Month after operation (Oyama et al., J. Biol. Chem., 2011)

31 RNA 配列情報を基盤とする大規模リン酸化プロテオミクス解析

32 膠芽腫患者由来細胞に関するショットガンリン酸化プロテオーム解析 Human glioblastoma initiating cells (GB2) 12 C6 14 N4-Lys 13 C6 14 N4-Lys No stimulation EGF stimulation for 15 min Combine cell lysates in equal ratio Tryptic digestion Phopshopeptide enrichment through TiO 2 columns Quantification of stimulation effect on GB2 phosphoproteome by high-resolution nanolc-ms/ms

33 膠芽腫患者由来細胞から同定された 6,073 種類のリン酸化ペプチド情報に基づく大規模シグナルパスウェイ解析 ERK/MAPK signaling mtor signaling 赤 :EGF 依存的リン酸化レベル上昇緑 : EGF 依存的リン酸化レベル減少グレー : 変動無

34 神経幹細胞マーカー Nestin に関する新規リン酸化部位の発見 (Kozuka-Hata et al., PLoS ONE, 2012)

35 ヒト RNA 配列からの新規リン酸化タンパク質コード領域の探索高精度質量分析システムによる大規模リン酸化プロテオームデータの取得 Human Protein DB Human RNA DB Transcriptome P P P Novel ORF : Known CDS : (Oyama et al., Genome Res., 2004) (Oyama et al., Mol. Cell. Proteomics, 2007)

36 Relative Abundance Relative Abundance Supervillin-like (LOC645954) 非コード RNA 由来新規リン酸化 EGF エフェクターの発見 -EGF +EGF -EGF +EGF z= z= z= m/z 子宮頸がん細胞 z= z= z= z= z= z= z= z= z= m/z 膠芽腫患者由来細胞 z= z=2 (Kozuka-Hata et al., PLoS ONE, 2012)

の活性化が背景となるヒト悪性腫瘍の治療薬開発につながる図4 研究である研究内容私たちは図3に示すようなyeast two hybrid 法を用いて AKT分子に結合する細胞内分子のスクリーニングを行ったこの結果これまで機能の分からなかったプロトオンコジン TCL1がAKTと結合し多量体を形

の活性化が背景となるヒト悪性腫瘍の治療薬開発につながる図4 研究である研究内容私たちは図3に示すようなyeast two hybrid 法を用いて AKT分子に結合する細胞内分子のスクリーニングを行ったこの結果これまで機能の分からなかったプロトオンコジン TCL1がAKTと結合し多量体を形 AKT活性を抑制するペプチド阻害剤の開発野口昌幸北海道大学遺伝子病制御研究所教授広村信北海道大学遺伝子病制御研究所ポスドク岡田太北海道大学遺伝子病制御研究所助手柳舘拓也株式会社ラボ研究員ナーゼAKTに結合するタンパク分子を検索しこれまで機能の分からなかったプロトオンコジンTCL1がAKTと結合し AKT の活性化を促す AKT活性補助因子であることを見い出し