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よしじろうままだ
5 years ago
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1 1 五十嵐研雑誌会 No 新井博之 Thiomicrospira における低 CO 2 応答

2 語句説明 2 Thiomicrospira crunogena: グラム陰性 γ プロテオバクテリア深海熱水噴出口付近に生息し ( ただし中温菌 ) 硫黄化合物 (hydrogen sulfide, thiosulfate, elemental sulfur 等 ) をエネルギー源として好気呼吸により生育する H 2 をエネルギー源として生育できない Hydrogenovibrio marinus MH-110 と類縁菌 DIC: Dissolved inorganic carbon, CO 2 + HCO 3- + CO 3 2- RubisCO: Ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase カルビンサイクルにおける炭酸固定酵素 CO 2 に対する親和性が低く O 2 が CO 2 の競合基質として oxygenase 活性も持つため酵素としての効率が悪いカルボキシソーム : タンパク質の殻で出来たファージ様の多面体構造体らん藻や Thiobacillus などの一部の化学独立栄養細菌で形成される内部に RubisCO と carbonic anhydrase 活性がある陰イオン (HCO 3-, RuBP, PGA) のみ透過し CO 2, O 2 を透過しないため結果的に oxygenase 反応を抑え CO 2 が濃縮されて carboxylase 反応が進行する CCM: Carbon concentrating mechanism 細胞膜の HCO 3- トランスポーターとカルボキシソームからなる CO 2 濃縮機構

3 16S rrna の系統樹 3 Hydrogenovibrio marinus MH-110 は Thiomicrospira, Thioalkalimicrobium と類縁である Tourova, T.P. et al. Microbiology 152, (2006) 全ゲノムが公開されている (unpublished) 全ゲノムが公開されている Scott, K.M. et al. PLoS Biology 4:e383 (2006) 当研究室で単離した MH-110 株

4 4 カルボキシソーム Yeates, T.O. et al., Nature Rev. Microbiol. 6, (2008)

5 CO 2 2% 5 Hydrogenovibrio marinus の CO 2 濃縮機構 (CCM) CO 2 HCO nm CO % CO 2 HCO 3 - CA HCO 3 - carboxysome CA O 2 RuBP RuBP RubisCO CO 2 2 3PG 3PG 100 nm

6 Hydrogenovibrio marinus MH-110 の RubisCO 発現制御機構吉沢洋一博士論文 (2005) 豊田晃一博士論文 (2006) RubisCO を 3 種類 (CbbM, CbbLS-1, CbbLS-2) 持っている Type Enzyme (gene) Ω value Form I CbbLS-1 (cbbls-1) 26.6 Form I CbbLS-2 (cbbls-2) 33.1 Form II CbbM (cbbm) cbbr1 cbbls-1 cbbq1 cbbo1 orf1 1 kb orf90cbbrm cbbls-2 cbbm carboxysome genes csos2 csos3 orf csos1 bfr orf2- A B C A B 11,12 cbbqm cbbom can

7 Hydrogenovibrio marinus MH-110 の RubisCO 発現制御機構 7 気相の CO 2 濃度 0.15% 以下でカルボキシソームを形成する 15% 2% 0.15% 0.03% 0.5 µm 0.5 µm 0.5 µm 0.5 µm Yoshizawa, Y. et al. J. Bacteriol., 186, (2004)

8 Hydrogenovibrio marinus MH-110 の RubisCO 発現制御機構 8 2-D gel electrophoresis High (15%) CO 2 Low (0.15%) CO 2 4 pi 7 4 pi 7 MW CbbM CbbS-2 CsoS1C CsoS1A CsoS1B

9 Hydrogenovibrio marinus MH-110 の RubisCO 発現制御機構 9 RubisCO の発現は転写レベルで制御される Western blotting qrt-pcr CO 2 concentration (%) cbbls-1 cbbls-2 cbbm csos1b + CbbLS-1 CbbLS-2 CbbM CO 2 concentration 15% 2% 0.15% 0.03% Yoshizawa, Y. et al. J. Bacteriol., 186, (2004)

10 Hydrogenovibrio marinus MH-110 の RubisCO 発現制御機構 10 3 種の RubisCO の発現パターンまとめ RubisCO High [CO 2 ] Low (Ω value) 15% 2% 0.15% 0.03% CbbLS-1 (26.6) + + CbbLS-2 (33.1) + + CbbM (14.8) Carboxysomes + +

11 Hydrogenovibrio marinus MH-110 の RubisCO 発現制御機構 cbbls1とcbbm の転写はそれぞれの上流にコードされる調節因子 CbbR1, CbbRmよって特異的に制御される ( ゲルシフト変異株の解析から ) 11 CbbR1 cbbr1 cbbl-1 cbbs-1 cbbq1 cbbo1 cbbl-2 cbbs-2 csos2 csos3 ORF csos1 bfr orf2- ABCAB 11, 12 cbbrm cbbm cbbqm cbbom can CbbRm Toyoda, K. et al. Microbiology, 151, (2005)

12 Hydrogenovibrio marinus MH-110 の RubisCO 発現制御機構 cbbls-2 と carboxysome 遺伝子は CbbR2 によって制御される ( 未発表データ ) Low CO 2 CbbR2??? Intermediate?? 12 orf2-17 Carboxysome shell peptides CbbLS-2 CsoS2 CsoS3 Orf CsoS1 A B C A B Bfr?? cbbls-2 csos2 csos3 A B C A B bfr orf2-11,12 ham1 orf2-14 cbbr2 ndhf mrna Orf RubisCO Glycosylation? CA peptidase-like? Carboxysome CbbLS-2 RubisCO

13 Thiomicrospira crunogena の特徴 13 全ゲノム解読済 2.4 Mb (Scott et al. ( 計 43 名 )PLoS Biology 4:e383, 2006) RubisCO は MH-110 と同様に 3 種類 cbbm と cbbls1 の遺伝子群は逆向きに隣接しているカルビンサイクル酵素遺伝子はゲノム上にバラバラに存在する ( 通常通性独立栄養細菌ではオペロンになっている ) Caronic anhydrase (CA)-like gene は 4 種 (CsoSCA, α-ca, β-ca, γ-ca-like) ただし γ-ca-like には CA 活性はない CCM に関与している Carboxysome は CsoSCA のみ (by qpcr) (Dobrinsli et al., AEM, 76, , 2010) 外界の DIC が変動しても細胞内の DIC は高く保たれ 20μM 以下の DIC でも生育可能細胞内の DIC は 100 倍以上になる DIC に対する whole cell affinity (K DIC ) は低 DIC 生育時は 26μM 高 DIC 時は 660μM (Dobrinsli et al., J. Bacteriol., 186, , 2005) 末端酸化酵素は cbb 3 タイプのみ H 2 では生育しないが hydrogenase 遺伝子とアクセサリー遺伝子を持つ

14 Thiomicrospira crunogena の RubisCO (cbb) 遺伝子群 14 (Tcr_0421~0431) ( -CA) can Om Qm M Rm R1 L1 S1 Q1 O1 (Tcr_0838~0852) (CsoSCA) L S2 carboxysome related genes R2 ( 遺伝子名は H. marinus HM-110 のもの )

15 DIC を下げた時の DIC 取り込みと炭酸固定の経時変化 15 縦に並べる転写阻害剤 (rifampin) により DIC の取り込みと CO 2 固定が抑制される DIC uptake は転写レベルで制御される ( ラン藻では転写と翻訳後修飾の両方で制御されている ) 炭酸固定反応は DIC 取り込みよりも遅れて始まる

16 DIC を下げた際のカルボキシソーム形成の経時的変化 16 high DIC low DIC (w/o Rif) low DIC (with Rif)

17 17 マイクロアレイ実験培養条件 : Chemostat, dilution rate 0.1 h -1 Low DIC: 2 mm DIC, 13 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 3.1 mm PO 4 -x (reservoir) ~0.1 mm DIC (growth chamber) sparged with pure O 2 High DIC: 50 mm DIC, 0.8 mm (NH4) 2 SO 4, 3.1 mm PO 4 -x (reservoir) ~50 mm DIC (growth chamber) sparged with 0.5 % CO 2 in O 2 マイクロアレイ : CombiMatrix CustomArray 12K microarray 各遺伝子につき 2~3 個のプローブ

18 転写 - 翻訳系呼吸鎖関連の遺伝子は変動しない 18

19 Low DIC で upregulate される遺伝子 19 CbbLS-2 とカルボキシソームの遺伝子群機能未知遺伝子

20 Low DIC で downregulate される遺伝子 20 CbbM CbbLS-1 NH 4 + 濃度変化による制御 (Table 2)

21 機能未知遺伝子の qrt-pcr 21 Low DIC で誘導 CCM の構成要素と予想 Tcr_1019: ペリプラズムタンパクデータベースに相同遺伝子は 2 種のみ (Nitrobacter winogradskyi, Thioalkalivibrio sp. K90) Tcr_1315: 外膜タンパク相同遺伝子は海洋性 /autotroph に多く存在 (Fig. 6) Low NH 4+ で誘導両方ともペリプラズムタンパク proteobacteria に広く存在

22 Tcr_1315 に相同な遺伝子 22 HTH1758

23 Hydrogenobacter thermophilus TK-6 における HTH1758 の転写パターン CO 2 濃度変化 Growth phase 5 L 7 L % 0.25% CO 2 濃度 OD540 HTH1758 は対数増殖期特異的に発現する

24 24 まとめと展望 DIC 濃度により制御される遺伝子の数は意外に少ないカルボキシソーム形成には特異的なシャペロンなどは不要? カルボキシソームの大腸菌等での異種発現が可能かもしれない ( バクテリアルナノコンパートメントエンジニアリング ) cbbomqm, cbbo1q1, can (β-ca) cbbr2 は転写量変化少ない cbbm, cbbls-1 とはオペロンではない? DIC 濃度変化に応じて発現量が変化する未知遺伝子は 2 つだけ Tcr_1019 ペリプラズムタンパクデータベースに相同タンパクは 2 種のみ Tcr_1315 外膜タンパク TK-6 では対数増殖期特異的に発現

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Microsoft PowerPoint - 雑誌会 pptx 石井研雑誌会 No. 1148 2014. 1. 17 新井博之 Neisseria gonorrhoeae における cbb 3 oxidase の CcoP サブユニットと cytochrome c 2 を介した微好気呼吸と脱窒のリンク背景 1 Neisseria gonorrhoeae (gocococcus, 淋菌 ) -proteobacteria の病原性菌末端酸化酵素は cbb 3