小角散乱を用いて多機能タンパク質の 機能発現の分子機構を探る

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1 PF 研 究 会 / 多 機 能 タンパク 質 の 機 能 発 現 の 機 構 解 明 における 小 角 散 乱 の 役 割 Role of small-angle scattering in unraveling the recognition mechanism by a multifunctional protein 山 形 大 院 理 工, Yamagata Univ., Human SAFE 和 泉 義 信, Yoshinobu Izumi yizumi@yz.yamagata-u.ac.jp

2 Calmodulin (CaM) Central linker C-lobe N-lobe +TP N C-lobe 免 疫 細 胞 の 生 理 機 能 細 胞 の 活 性 化 からアポートーシス シグナル 伝 達 経 路 N-lobe C dumbbell Flexibility of central linker Patches Flexibility Globular (Hydrophobic Interaction) TP: -helix Anchoring residue Position 1-(5)-8-14 : Motif

3 HIV-gp41: Solution structure of Ca 2+ /calmodulin complexed with a lentivirus lytic peptide 1 reveals a novel mode of molecular recognition, Y.Izumi, A.Amano, T.Saito, Y.Jinbo: J.Appl. Cryst. (2007) 40, S179-S183. Peptide name Primary sequence MLCK22 KKRWKKNFIAVSAANRFKKISS Canonical TP/ -helix 1W,5F,8V,14F:anchoring residues, if W at 7, no globular structure LLP1: 1 14 HV1A2 10 DRVIEVVQGAYRAILHIHRR HV1B1 10 DRVIEVVQGAYRAIRHIPRR HV1H2 10 DRVIEVVQGACRAIRHIPRR HV1H2W 10 DRVIEVVQGWCRAIRHIPRR HV1rA2 10 RRHIHLIARYARQAVEIVRD Abbreviations for the amino acids residues are: A, Ala; C, Cys; D, Asp; E, Glu; F, Phe; G, Gly; H, His; I, Ile; K, Lys; L, Leu; M, Met; N, Asn; P, Pro; Q, Gln; R, Arg; S, Ser; T, Thr; V, Val; W, Trp; and Y,Tyr.

4 解 析 1 Guinier Region (4 2 R g2 s 2 /3 1) I(s,c) = I(0,c)exp{-4 2 R g (c) 2 s 2 /3} In the dilute limit, Kc/I(0,c) = 1/M + 2A 2 c +, R g (c) 2 = R B if c + 分 子 量 (M), 回 転 半 径 (R 0 ), 相 互 作 用 パラメータ (A 2, B if ) Kratky Region Kratky plot (KP: Shape); P(r), d max I(s)/I(0) instead of I(s)

5 KP a) CaM (red); CaM/MLCK22 (black); CaM/HV1A 3 (blue); CaM/HV1A2 10 (green); CaM/HV1rA 10 (magenta) b) CaM (red); CaM/MLCK22 (black); CaM/HV1B1 10 (blue) c) CaM (red); CaM/MLCK22 (black); CaM/HV1H2 10 (blue); CaM/HV1H2W 10 (green) Ca 2+ /CaM adopts a dumbbell-shaped structure, while the Ca 2+ /CaM/MLCK22 complex adopts a compact globular shape. The data points for the three types of LLP complexes are almost superimposed on those for the Ca 2+ /CaM/MLCK22 complex, indicating that these complexes adopt almost the same globular structure as that of the Ca 2+ /CaM/MLCK22 complex, suggesting each peptide adopts an -helical conformation in the complex.

6 Globular TP: -helix Anchoring Residues Motif N C N C RS20 MLCK22 HV1rA RRKWQKTGHAVRAIGRLSSS KKRWKKNFIAVSAANRFKKISS RRHIHLIARYARQAVEIVRD N N C C LLP1: HV1A2 10 HV1B1 10 HV1H2 10 HV1H2W 10 DRVIEVVQGAYRAILHIHRR DRVIEVVQGAYRAIRHIPRR DRVIEVVQGACRAIRHIPRR DRVIEVVQGWCRAIRHIPRR A polarity opposite!!

7 HIV-MA(p17) Solution X-ray scattering Reveals a Novel Structure of Calmodulin Complexed with a Binding Domain Peptide from the HIV-1 Matrix Protein p17: Y.Izumi, H.Watanabe, N.Watanabe, A.Aoyama, Y.Jinbo, and N.Hayashi, Biochemistry 2008, 47, TP Peptide name p17n p17c p17t Primary sequence GELDRWEKIRLRPGGKKK KKKYKLKHIVWASRELERFAVN GELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAVN MLCK22 KKRWKKNFIAVSAANRFKKISS

8 P(r) (GNOM) Green: A, Blue: B, Red: C KP Shape (DAMMIN) A: Ca 2+ /CaM/p17N at 1:2 B: Ca 2+ /CaM/p17C at 1:1 C: Ca 2+ /CaM/p17T at 1:1 形 態 の 多 様 性 を 実 証!

9 解 析 2 : Tertiary structural prediction Sequential morphs: Ca 2+ /CaM/RS20 (ff0, 1cdl), Ca 2+ /CaM (ff17, 1cll) (ff11, ff13, and ff15) Target docking: Ca 2+ /CaM/M13 (2bbn) p17 protein (1tam) Discover 3 module of Insight II 2000 (Accerlys):energy min. & MD 解 析 3 : Calculation of SAXS profile of known tertiary structures Extension of the Debye s formula H 2 O Cube size=0.5å, r H2O =1.4Å I(s)/I(0) instead of I(s): C B A No adjustable parameter

10 SAXS profile & KP of Ca 2+ /CaM/p17T A reasonable fitting of data points except the deviation beyond s>0.043 Å -1. Such a deviation was also observed for both Ca 2+ /CaM and Ca 2+ /CaM/skMLCK22 complex. No instrumental bias! No adjustable parameter! (Biochemistry 2008, 47, )

11 Flexibility of central linker green:1cll, blue: 1cdl, magenta: ff15 (Biochemistry 2008, 47, ) Model for the complex of Ca 2+ /CaM/p17T yellow: Ca 2+ /CaM green: p17t 139E C lobe of CaM 139E p17t: GELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAVN 74R 78D 82E 47E50D 56D 54E /67E N lobe of CaM (Electrostatic Interaction)

12 Ca 2+ /CaM/HIV_LLP1 CaMはLLP1と 結 合 し, 球 状 構 造 をとる LLP1の 極 性 はM13, RS20 複 合 体 と 逆 になる: (1) 3 種 の 異 なるHIV-1のCaM 結 合 部 位 がCaMと 球 状 の 複 合 体 を 形 成 する, (2) 極 性 を 反 転 させたLLP1を 用 いても 球 状 構 造 をとる, (3) アンカー 残 基 と 隣 接 する7 位 の 残 基 が 嵩 高 い 場 合 でも 球 状 構 造 をとる CaMの 結 合 により, gp41の3 量 体 形 成 が 阻 害 される Ca 2+ /CaM/HIV_p17T CaMの 各 ロブの 構 造 は 複 合 体 形 成 により 変 化 しない 複 合 体 の 全 体 構 造 は 伸 びた 構 造 をとり, 回 転 半 径 は20.5A で,ドメイン 間 距 離 は34.2A である CaM/p17T 複 合 体 の 構 造 は, 主 として 静 電 的 相 互 作 用 により 安 定 化 されている CaMの 疎 水 性 パッチは, p17のn 末 のミリスチル 基 を 隔 離 する 役 割 を 担 う CaMは, HIV-1に 対 して, 抑 制 因 子 として 作 用 している! 小 角 散 乱 は 蛋 白 質 分 子 の 機 能 解 析 に 有 用 である!

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2. 背景タンパク質を構成するアミノ酸には L-アミノ酸と D-アミノ酸の 2 つの鏡像異性体が存在します ( 図 1) これまで生物は L-アミノ酸のみを選択的に利用していると考えられてきました ところが分析技術の進歩と共に 生物の体内に少量ながらも D-アミノ酸が存在することが分かってきました 国立研究開発法人海洋研究開発機構 国立大学法人京都大学 深海にひろがる鏡の向こうの微生物世界 D アミノ酸を好む深海微生物を発見 1. 概要国立研究開発法人海洋研究開発機構 ( 理事長平朝彦 以下 JAMSTEC ) 海洋生命理工学研究開発センターは 国立大学法人京都大学と共同で 有人潜水調査船 しんかい 6500 無人探査機 ハイパードルフィン 等により深海から採取した堆積物から D-アミノ酸を好んで食べて増殖する微生物を発見しました

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