Polyoxometalateが有するcysteine検出能の検討及びジスルフィド結合形成反応への展開

Size: px

Start display at page:

Download "Polyoxometalateが有するcysteine検出能の検討及びジスルフィド結合形成反応への展開"

かずゆきおなか
6 years ago
Views:

1 チオールを特異的に酸化し発色する山形大学理工学研究科バイオ化学工学専攻准教授今野博行

対カチオン等を制御することで様々な機能性を付与できる可能性酸触媒ナノマテリアル酸化剤フォトクロミック材料医薬品 (癌 HIV

2 金属酸化物クラスターアニオンポリオキソメタレート Polyoxometalate (POM) 金属元素に酸素が6個配位した MO6を基本骨格とする金属酸化物 1 nm クラスターアニオン MO6 (octahedron) ( PxMyOz )n 構造構成元素対カチオン等を制御することで様々な機能性を付与できる可能性酸触媒ナノマテリアル酸化剤フォトクロミック材料医薬品 (癌 HIV アルツハイマー病) Putaj, P., et al., Coordination Chemistry Reviews 2011, 255 (15-16),

3 本研究の背景 2013 年 POM の細胞膜破壊作用を並河らが発見 * POM の抗菌活性試験を行った結果グラム陽性菌のブドウ球菌に対し MIC ( 最小阻害濃度 ) = 100 μg/ml の抗菌活性ブドウ球菌培養液が青色に呈色 After 3 h Concentration of α-k 6 [P 2 W 18 O 62 ] nh 2 O (μg/ml) * Nabika, H., et al., RSC Adv. 2013, 3,

4 本研究の背景ブドウ球菌表面上で酸化還元反応が進行したと仮定 Red. [P 2 W 18 O 62 ] 6- [P 2 W 18 O 62 ] 7- Ox. チオール含有アミノ酸である cysteine 水溶液に POM を添加したところ青色に呈色 POM L-cysteine この呈色反応は速やかに進行し極めて視覚的であるにも関わらず先行研究はほとんど行われていない

5 本研究の目的 1 POM の cysteine 検出能の検討 2 ジスルフィド結合形成反応への展開

H3[PMo12O40] nh2o リンモリブデン酸アンモニウム (NH4)3[PMo12O40] nh2o Dawson type POM6.

6 本実験で使用したPOM Keggin type POM1. POM2. POM3. POM4. POM5. メタタングステン酸アンモニウム (NH4)6[H2W12O40] nh2o ケイタングステン酸 H4[SiW12O40] nh2o リンタングステン酸 H3[PW12O40] nh2o リンモリブデン酸 H3[PMo12O40] nh2o リンモリブデン酸アンモニウム (NH4)3[PMo12O40] nh2o Dawson type POM6. リンタングステン酸カリウム α-k6[p2w18o62] nh2o POM7. 1欠損リンタングステン酸カリウム α-k10[p2w17o61] nh2o POM8. 3欠損リンタングステン酸ナトリウム α-na12[p2w15o56] nh2o Keggin type Dawson type Blue octahedrons : W or Mo Red dots : O [PW12O40]3- [P2W18O62]6-

POM の作製法 85% H 3 PO 4 KCl Na 2 WO 4 H 2 O reflux 100, 8h Na + P 2 W 18 O 62 6-1)

7 POM の作製法 85% H 3 PO 4 KCl Na 2 WO 4 H 2 O reflux 100, 8h Na + P 2 W 18 O ) recrystallization 100, H 2 O 2) cooling 5, 1 day XRD pattern of POM6 washing K 6 [P 2 W 18 O 62 ] 10H 2 O

Absorbance POM を用いた cysteine の検出 (1) POM1 8 を用いた cysteine の検出 After 24 h POM1 Mixture of 10 mg/ml L-cysteine (500 µl) and 10 mg/ml POM1-8 (100 µl) 3 2 1 POM2 POM3 POM4 POM5 POM6

8 Absorbance POM を用いた cysteine の検出 (1) POM1 8 を用いた cysteine の検出 After 24 h POM1 Mixture of 10 mg/ml L-cysteine (500 µl) and 10 mg/ml POM1-8 (100 µl) POM2 POM3 POM4 POM5 POM6 POM7 POM8 After 24 h, 700 nm 0 POM1 POM2 POM3 POM4 POM5 POM6 POM7 POM8 Fig. 1. Absorbance of L-cysteine and POM1-8 mixture Cysteine に対して H 3 [PMo 12 O 40 ] nh 2 O (POM4) が最も高い反応性

9 POM を用いた cysteine の検出 (2) H 3 [PMo 12 O 40 ] nh 2 O (POM4) を用いた cysteine の検出 After 10 min Gly Ala Val Leu Ile Phe Cys Ser Pro Met Asn Gln Thr Tyr Trp Asp Glu His Arg Lys Mixture of 10 mg/ml L-amino acid (100 µl) and 10 mg/ml H 3 [PMo 12 O 40 ] nh 2 O (20 µl) H 3 [PMo 12 O 40 ] nh 2 O は cysteine のみを選択的に検出

10 (thousandths) POM を用いたジスルフィド結合の形成 abundance u [PMo 12 O 40 ] 3- [PMo 12 O 40 ] X : parts per Million : Proton 1 チオールの酸化に伴うジスルフィド結合の形成 2 酸化還元状態の変化に伴う POM の呈色反応 Fig H-NMR spectra of L-cysteine and POM mixture (3 days) X : parts per Million : Proton

11 Absorbance POM を用いた cysteine の検出範囲 After 2 h 100 mm 10 mm 1 mm 100 μm 10 μm 1 μm control Mixture of L-cysteine (500 µl) and 20 mm H 3 [PMo 12 O 40 ] nh 2 O (500 µl) 2 After 2 h, 700 nm Detection limit 100 mm* 10 mm* 1 mm 100 μm 10 μm 1 μm Control Final concentration of L-cysteine Fig. 3. Transition of absorbance by concentration of L-cysteine

12 POM を用いた保護 cysteine の検出 After 24 h Fmoc-Cys-OH Boc-Cys-OH Z-Cys-OH H-Cys-OBn H-Cys-OMe Mixture of 10 mg/ml protected cysteines (1 ml, DMSO) and 10 mg/ml H 3 [PMo 12 O 40 ] nh 2 O (200 µl) 保護基の立体障害が POM との反応性に大きく影響する

13 mv mv POM を用いた glutathione の検出 GSH H 3 [PMo 12 O 40 ] nh 2 O H 2 O, r.t., 24 h After 10 min GSH GSSG GSSG t R = 5.72 t R = Addition of H 3 [PMo 12 O 40 ] nh 2 O (1.8 mg) to 10 mm glutathione aqueous solution (1 ml) Time (min) Time (min) Fig. 4. HPLC profile of glutathione and POM mixture

14 Absorbance POM を用いた pentapeptide の検出 Table 1. Reaction of pentapeptides with POM entry sequence with POM 3 After 24 h, 700 nm 2 1 Ac-Ser-Cys-Ala-Phe-Ile-NH 2 2 Ac-Ser-Gly-Ala-Cys-Ile-NH 2 3 Ac-Ser-Phe-Cys-Phe-Ile-NH 2 4 Ac-Ser-Gly-Cys-Gly-Ile-NH Cys Fig. 5. Absorbance of pentapeptides and POM mixture Mixture of 10 mg/ml pentapeptides (800 µl) and 10 mg/ml H 3 [PMo 12 O 40 ] nh 2 O (200 µl) ペプチドのアミノ酸配列により POM との反応性は大きく異なる

15 Oxytocin の合成 (1) H 3 [PMo 12 O 40 ] nh 2 O DMSO, r.t., 24 h Oxytocin

16 mv mv Oxytocin の合成 (2) Oxytocin linear peptide 950 t R = [M+H] + = Oxytocin Time (min) 950 t R = [M+H] + = Time (min) Fig. 6. HPLC profile of oxytocin and POM mixture Fig. 7. ESI-MS of oxytocin

17 Bactenecin の合成 (1) H 3 [PMo 12 O 40 ] nh 2 O 0.1M HCl aq./dmso (1:2) r.t., 24 h Bactenecin

18 mv Bactenecin linear peptide mv Bactenecin の合成 (2) 170 t R = Time (min) [M+H] + = Bactenecin 170 t R = [M+H] + = Time (min) Fig. 8. HPLC profile of Bactenecin and POM mixture Fig. 9. ESI-MS of Bactenecin

19 POM の cysteine 検出能結論 Keggin 型 Polyoxometalate の H 3 [PMo 12 O 40 ] nh 2 O が cysteine と選択的に反応し青色に呈色 POM の cysteine 検出能は保護基の有無やペプチドのアミノ酸配列により大きく変化ジスルフィド結合形成反応への展開 POM を用いたチオールの酸化によるジスルフィド結合性環状ペプチドの生成を確認

20 従来技術とその問題点グルタチンシステインホモシステインなどに代表とされる生体チオールは生体酸化還元ホメオスタシスを維持し代謝を司る重要物質の一つである酸化ストレスや疾患への関与が示唆されている特定のチオールを検出する手法として分光学的な方法が用いられるエルマンズ試薬 (DTNB 法 ) DTNB (λ max = 325 nm) 難水溶性チオール以外の攻撃を受けやすい 5-Mercapto-2-nitro benzoic acid (λ max = 412 nm) Mixed disulfide On/off シグナル比が低い洗浄単離を必要とする

21 新技術の特徴従来技術との比較エルマンズ試薬 POM 水溶性低い高い有機溶媒溶解性高い低い安定性様々な求核攻撃を受ける加水分解を受けやすいチオール特異的 >ph9 で分解する後処理洗浄単離が必要必要としない価格 5,200 円 /1 g ( 同仁化学 ) 7,600 円 /100 g ( 東京化成 )

22 想定される用途本技術の特徴はその手軽さにある市販の高額な試薬と比較して感度 ( シグナル比 ) が十分でないためその効果的な用途を模索中である生体内検査試薬のみならず水質検査など環境測定分野への応用も視野に入れて検討しているチオールの架橋反応を基盤にしているのでバイオコンジュゲート ( 蛋白質と蛍光分子等 ) 試薬としての用途を想定している

23 実用化に向けた課題現在アミノ酸ペプチドについて集中して検討しているさらに蛋白質中のチオールの検出蛋白質のバイオコンジュゲート試薬としての可能性を追求する今後他の生体分子 ( 核酸糖鎖脂質など ) チオール系低分子への検討が必要である POM の構造改変による感度の向上にも取り組み必要がある

24 企業への期待本方法論を適用可能フィールドの提供講演者は大学創薬研究有機合成などの狭い世界しか知らないため本技術が真に活躍できる場所がどこにあるかはっきりと見定めができていない

25 本研究に関する知的財産権発明の名称 : チオール検出剤及びチオール検出方法出願番号 : 出願人 : 国立大学法人山形大学発明者 : 今野博行並河英紀鵜浦啓

26 産学連携の経歴 2006 年 2007 年地域イノベーション創出事業重点地域研究開発プログラムシーズ発掘試験に採択 2011 年年第 2 回 A-STEP FS 探索タイプに採択 2017 年年地域産学バリュープログラムに採択 : セルスペクト社と共同研究

27 お問い合わせ先山形大学国際事業化センター知的財産部門事務担当馬場 TEL FAX Mail

Perl + α. : DNA, mrna,,

2009 Perl + α. : DNA, mrna,, DNA .. DNA A C G T DNA 2 A-T, C-G DNA NH 2 NH 2 O - O O N P O - O CH 2 O N N O - O P O CH 2 O N O - O O P O NH 2 O - O - N CH 2 O N O OH OH OH DNA or RNA (U) (A) (G) (C)