Microsoft Word - ボツリヌス病原体検査マニュアル docx

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りさこしろみず
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2 I II PCR III IV V VI <<>> PCR

3 I (botulism) (Clostridium botulinum) [botulinum neurotoxin, (BoNT)] I IV A G Cato, 1986; Hatheway, 1992I A B FII E B FIII CD IV IV Clostridium argentinense (Suen, 1988)E Clostridium butyricum F Clostridium baratii / I II III IV 1 C. butyricum C. baratii A, B, F B, E, F C, D G (E) (F) / D C. sporogenes C. novyi C. subterminale 1 IVC. argentinensesuen,1988 2

4 (1) Foodborne botulism (2) Infant botulism (3) Wound botulism (4) Adult intestinal toxemia botulism (5) : (Inhalational botulism / Iatrogenic botulism) EC C C D

5 (1) 1897Van Ermengem BE 1951 E A 2B E1969 B 1976A A B E 1985 A2012 A 1998 B p

6 2A ( ) E E E A A E E E B A B A A A E A A A A A B

7 2B A E B E E A E E E E E A E A E E E A E E B A A A A E B A A

8 1 ND, 2 E Clostridium butyricum

9 (2) BabyBig ( ,419 20(0.8%) (Koepke, 2008) A1,079B 1, % %(Koepke, 2008) 1986A A21B5 C (Oguma, 1990) EClostridium butyricum (Abe, 2008) (3) 4 18

10 AB1994 (4) 1 (Brook, 2006) (5) 4 Botox CDC treatment-related botulism << >> (1) (2)

11 E A E F E A E B A B A B A 2012 A A B 6.6% E (5.7%) A B C E F

12 II. 2 <<>>. (1)

13 10 15 ml3 ml ml 25g 50g 1g

14 100g mg 2010%

15 0.1M (NaOH) 0.5% (5,000 ppm)(naclo ) M 0.5 (5,000 ppm) 10 NaOH <<>> Bacillus 0.1% (1,000 ppm) (Oie, 2011)

16 .

17 pg PCR in vitro 1 pg 4 1,000 ml ph U 0.5mg/mL 1: N 2mg/mL I A B F II B E F E 500

18 A B F 1 IU 10,000 ipld 50 50% E 1 5,000 ipld 50 (Hatheway, 1994) A F 15 20g 1) 2) 10g 3,000 rpm µm 1/ ) ,000 rpm µm

缶詰や容器包装詰食品が膨張している場合金属製のパンチなどでガス抜きを行った後に開缶開封するこれらの操作は安全性に配慮して安全キャビネットの中で実施する 4) 菌の培養液糞便や食品など検査検体の培養液は撹拌した後卓上遠心機の最高回転数で 5 10分間遠心し菌体が完全に沈殿した後上清を採取する上清を 0.

19 缶詰や容器包装詰食品が膨張している場合金属製のパンチなどでガス抜きを行った後に開缶開封するこれらの操作は安全性に配慮して安全キャビネットの中で実施する 4) 菌の培養液糞便や食品など検査検体の培養液は撹拌した後卓上遠心機の最高回転数で 5 10分間遠心し菌体が完全に沈殿した後上清を採取する上清を 0.45µm のメンブランフィルターでろ過しろ過液を試料とする必要に応じてゼラチン希釈液で 5倍希釈したものを試料原液とするまた糞便検体と同様にトリプシン処理群無処理群を用意する３マウス試験ボツリヌス毒素が含まれる検体をマウスに接種するとマウスには中毒症状が生じるボツリヌス中毒の特有な症状は筋弛緩による腹部の陥没腹壁の振動後肢麻痺呼吸困難などでる写真１写真１ボツリヌス中毒症状を起こしたマウス 19

20 ipld ipld A B E C D F

21 (1-10 IU/mL) ml 0.7 ml ml 0.7 ml ml - A 0.7 ml ml - B 0.7 ml ml - E 0.7 ml ml - C 0.7 ml ml - D 0.7 ml ml - F 0.7 ml ml 1g 1mL 14 ipld 50 Hatheway, ) Difco 1.5g 12 ml 12 ml ) GAM CW GAM CW GAM CW

22 10 20mL IIIGAM 0.1 ph ABEGAM CW CW CD CDGAM I CBI Dezfulian, 1981 CBI CWGAM D- 250 µg/ml 76 µg/ml 4 µg/ml 0.45µm 50 3) LV Lecitho vitellin agarcowan, ,000mL 25g 4 1,000rpm 10 Whatman R DE81LV LV 100mL mL 1.43mg/L 20mL LV 1 20 G (lipase) C. sporogenes C. novyi E Boticin E

写真２リパーゼ反応 A型ボツリヌス菌62A株の卵黄加ブルセラHK培地上のコロニー寒天平板の表面に光があたるようにするとコロニー周辺の真珠様層(pearly- layer)を観察しやすい２ボツリヌス菌の分離ボツリヌス菌は偏性嫌気性菌であるために寒天平板培地の培養には嫌気パウチまたは嫌気ジャーの使用あるいは嫌気チャンバーの使用による嫌気培養が必須である 1)

23 写真２リパーゼ反応 A型ボツリヌス菌62A株の卵黄加ブルセラHK培地上のコロニー寒天平板の表面に光があたるようにするとコロニー周辺の真珠様層(pearly- layer)を観察しやすい２ボツリヌス菌の分離ボツリヌス菌は偏性嫌気性菌であるために寒天平板培地の培養には嫌気パウチまたは嫌気ジャーの使用あるいは嫌気チャンバーの使用による嫌気培養が必須である 1) 増菌培養ボツリヌス毒素の検出検査 (2)検体の調製 2 糞便の過程で遠心分離した沈渣 0.5mL 1mLを増菌培地 3本の深部にパスツールピペットあるいは駒込ピペットで静かに移植し 1本目はそのまま 2本目は 60 で10 15分 3本目は 80 で10 30分間加熱後それぞれ 30 で 4 ７日間培養する加熱処理は芽胞の発芽を促進するとともに非芽胞性の混在菌を除く効果がある培養 4日目および 7日目に培養液中のボツリヌス毒素の有無を調べるマウス試験ボツリヌス毒素が検出されればボツリヌス菌陽性としボツリヌス菌の分離を行うこの際 80 で 15 30分間加熱後培養した増菌培地以外の培養液中に毒素が検出されても沈渣中のボツリヌス毒素の移行が推測されるので供試材料中にボツリヌス毒素が証明された検体では考慮を要する 2) 分離培養毒素が証明された培養試験管の深部液を分離培地に画線し 30 で 48時間嫌気培養する芽胞非形成菌が多い場合には増菌培養液 2mLに等量のエタノールを添加し 25 で１時間処理する方法も有用である Johnston, 1964 ボツリヌス菌はリパゼを産生 G型菌は非産生するため卵黄添加寒天培地上で卵黄中の脂肪を分解し培地上のコロニの周りに限局して pearly layer あるいは oil-on-water と呼ばれる真珠色の光沢リングを呈するボツリヌス菌が疑われる集落をなるべく多く釣菌してブドウ糖デ 23

24 S rrna [PFGE (pulsed-field gel electrophoresis) MLST (Multi locus sequence typing) MLVA (Multi-locus variable-number tandem-repeat analysis) ] <<>> LVmL A A A Vol.25 (10), p PT TEL: mt7n-skm@asahi-net.or.jp 1) LV 3 L-0.1% LV ) 1 mllv 15 ml LV

25 ( PCR ) PCR B A(B) PCR PCR 1) TPGY ) 0.2 ml 1.5 ml 12,000 rpm 410 3) 0.2 ml TE-0.1% Tween 20 4) ) 12,000 rpm 4 10 PCR <<NOTE>> TE-0.1% Tween PCR PCR

26 <<>> PCR (Takeshi, 1996) A 280 bp F : 5'- TGC AGG ACA AAT GCA ACC AGT -3' R : 5'- TCC ACC CCA AAA TGG TAT TCC -3' B 320 bp F : 5'- CCT CCA TTT GCG AGA GGT ACG-3' R : 5'- CTC TTC GAG TGG AAC ACG TCT -3' C 290 bp F : 5'- ATA CAC TAG CTA ATG AGC CTG -3' R : 5'- TGG AGT ATT GTT ATT CCC AGG -3' D 500 bp F : 5'- GTG ATC CTG TTA ATG ACA ATG -3' R : 5'- TCC TTG CAA TGT AAG GGA TGC -3' E 270 bp F : 5'- CAG GCG GTT GTC AAG AAT TTT A -3' R : 5'- ATT AGC TTT TGA CAG TTC TTC -3' F 330 bp F : 5'- CAA TAG GAA CGA ATC CTA GTG -3' R : 5'- ATC AGG TCC TGC TCC CAA TAC -3' TaKaRa DNAPCR Positive Control Template 2011 C-13 DNA G G F : 5'- TAG TAA TTT AAC TAT AAA TT-3' R : 5'- TTT ATA AAA GAC AGT ATT GT-3'

27 G (GenBank Accession No. X87972) bp A B E F Lindström, 2001 Multiplex PCR Takeshi C D C/D D/C Takeda, 2005 PCR C D C D DNA

28 Clostridium botulinum C. butyricum C. baratii

32 1. Cato, E. P., George, W. L. and Finegold, S. M. : Genus Clostridium Prazmowski 1880, 23, In Sneath, P. H. A., Mair, N. S., Sharpe, M. E. and Holt, J. G. (eds.), Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 2. p , Williams & Wilkins, Baltimore (1986) 2. Hatheway, C. L. Clostridium botulinum and other Clostridia that produce botulinum neurotoxin. In Hauschild, A.H.W. Dodds. K.L. eds. Clostridium botulinum : Ecology and Control in foods. New York, Marcel Dekker Inc. p Suen, J.C., Hatheway, C.L., Steigerwalt, A.G., Brenner, D. J. Clostridium argentinense sp. nov.: a genetically homogeneous group composed of all strains of Clostridium botulinum toxin type G and some nontoxigenic strains previously identified as Clostridium subterminale or Clostridium hastiforme. Int J Syst Bacteriol 38: (1988) Koepke, R., Soebel, J., Arnon, SS. Global occurrence of infant botulism, Pediatrics 122:e73-e82 (2008) 7. Centers for Disease Control and Prevention : Botulism in the United States, Handbook for epidemiologists, Clinicians, and laboratory workers. p Oguma, K., Yokota, K., Hayashi S., et al. Infant botulism due to Clostridium botulinum type C toxin. Lancet 336, (1990) 10. Abe, Y., Negasawa, T., Monma, C., and Oka, A. Infantile botulism caused by Clostridium butyricum type E toxin. Pediatr Neurol 38:55-59 (2008) 11. Brook, I. Botulism: the challenge of diagnosis and treatment. Rev. Neurol. Dis. 3, (2006) 12. Oie S, Obayashi, A., Yamasaki, H., et al. Disinfection methods for spores of Bacillus atrophaeus, B. anthracis, Clostridium tetani, C. botulinum and C. difficile. Biol Pharm Bull. 34: (2011) 13. Hatheway, C. and Dang, C. In Ch. 8, Immunogenicity of the neurotoxins of C. botulinum. pp in Therapy with Botulinum Toxin, Jankovic, J. and Hallet, M. eds., Marcel Dekker, NY/Basel/Hong Kong (1994) 14. Cowan, S. T. and Steel, R.J. :Manual for the identification of medical bacteria. Cambridge, 119

33 Dezfulian, M., McCrosky, L.M., Hatheway, C.L. and Dowell, V.R. Selective medium for isolation of Clostridium botulinum from human feces. J. Clin. Microbiol. 13, Johnston, R., Harmon, S., and Kautter, D. Method to facilitate the isolation of Clostridium botulinum type E. J. Bacteriol. 88: (1964) 17. Takeshi, K., Fujinaga, Y., Inoue, K. et al. Simple method for detection of Clostridium botulinum type A to F neurotoxin genes by polymerase chain reaction. Microbiol. Immunol. 40:5-11 (1996) 18. Lindström, M., Keto, R., Markkula, A., et al. Multiplex PCR assay for detection and identification of Clostridium botulinum types A, B, E, and F in food and fecal material. Appl. Environ. Microbiol. 67: (2001) 19. Takeda, M., Tsukamoto, K., Kohda, T. et al. Characterization of the neurotoxin produced by isolates associated with avian botulism. Avian Dis. 49: (2005)

2

2 3 4 TTT TCT TAT TGT TTC TCC TAC TGC TTA TCA TAA TGA TTG TCG TAG TGG CTT CCT CAT CGT CTC CCC CAC CGC CTA CCA CAA CGA CTG CCG CAG CGG ATT ACT AAT AGT ATC ACC AAC AGC ATA ACA AAA AGA ATG ACG AAG AGG GTT