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なぎさらぶり
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細胞数7 白血病細胞マーカー分析 ( 白血病タイピング ) はじめに - 目印 ( マーカー ) の効用血球はすべて骨髄中の造血幹細胞を起源としてそれぞれの細胞系統 (cell lineage) に分化します幹細胞から分化した細胞はそれぞれの細胞系統に固有の分化段階を経て成熟し末梢血に放出されます分化成熟に伴う形態学的機能的変化を反映して細胞表面には各種のタンパク分子 (

1 細胞数7 白血病細胞マーカー分析 ( 白血病タイピング ) はじめに - 目印 ( マーカー ) の効用血球はすべて骨髄中の造血幹細胞を起源としてそれぞれの細胞系統 (cell lineage) に分化します幹細胞から分化した細胞はそれぞれの細胞系統に固有の分化段階を経て成熟し末梢血に放出されます分化成熟に伴う形態学的機能的変化を反映して細胞表面には各種のタンパク分子 ( 細胞表面抗原 ) が発現または消失しますしたがってこのような分子を目印 ( マーカー ) にして白血病細胞がどのような細胞表面抗原を発現しているかを調べることで細胞系統や分化成熟段階を推測できますこれが白血病タイピングですフローサイトメトリーの原理フローサイトメトリー ( 略して FCM) とは細胞あるいは細胞成分を浮遊液の状態にして流体系の中を高速で通過させそこにレーザ光線等を照射して各細胞から得られる光学的情報を検出部を通して電気信号に変換しさらにコンピュータを使って各細胞の生物学的特徴を研究解明していく分野として定義されていますこのための装置を総称してフローサイトメーターと呼びますフローセル中の細胞にレーザが照射されると前方散乱光 (FS; 細胞の大きさと関連 ) 側方散乱光(SS; 細胞の内部構造と関連 ) および蛍光を検出することができます白血球の前方側方散乱光を 2 次元でプロットすると ( サイトグラム ) リンパ球単球顆粒球分画が得られます分析したい領域にゲートを設定するとその領域内にある細胞の蛍光強度分布ヒストグラムが得られます設定したゲート内における蛍光陽性群の占める割合 = 抗体の陽性率 Air-cooled Argon Ion Laser Side Scatter Red Solidstate Laser FL3 FL4 リンパ球単球顆粒球 FL5 FS FL2 Flow Cell FL1 Forward Scatter ゲート内の細胞について蛍光強度分析 SS 蛍光陰性リンパ球蛍光陽性リンパ球蛍光強度

2 タイピング抗体の選択 Ⅰ. 特異性と感度細胞を分類するためのマーカーは特定の細胞系統または分化段階に限って発現し他には発現しない ( 特異性 ; specificity) 特定の細胞系統または分化段階には必ず発現する ( 感度 ;sensitivity) の両方を満たすことが要求されますしかし現実には特異性と感度を同時に満たす細胞表面抗原はほとんど存在しません例えば T 細胞マーカーでは pan-t 細胞マーカーとされる CD2 CD5 CD7 はいずれも感度の面では申し分ありませんが T 細胞以外の細胞系統にも発現がみられます一方で T 細胞に特異的な CD1a や CD3 はいずれも T 細胞の分化成熟段階の特定のステージにしかみられません ( 表 1) 表 1: T 細胞マーカーの特異性と感度マーカー未熟 T 細胞中間型 T 細胞成熟 T 細胞 B 細胞 NK 細胞骨髄細胞 CD /- - CD /+ - - CD / /+ CD1a CD したがって T 細胞系統を特定するにはこれらのマーカーを複数用いて総合的に判断を下す必要があります同じことが他の細胞系統にもいえますこのため主として表 2 に掲げた細胞表面マーカーから 15~20 種類程度を選択して組み合わせた抗体パネルを用いて白血病タイピングが行われています今後はこのほかにも腫瘍細胞の薬剤耐性をみる上でも有用な MDR1(P-glycoprotein)( 文献 1) フィラデルフィア染色体陽性の ALL 細胞に発現する KOR-SA3544( 文献 2) などの染色体異常に関連したマーカーも抗体パネルに追加されていく可能性があります表 2: 白血病タイピングで用いられる細胞表面マーカー T 細胞系 B 細胞系骨髄系赤芽球系巨核球系その他 CD1a CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 TCRαβ TCRγδ CD19 CD20 CD22 CD23 FMC-7 Ig-κ Ig-λ CD11c CD13 CD14 CD15 CD33 CD64 CD65 CD117 CD235a (Glycophorin A) CD41 CD42b CD61 CD10 CD25 CD34 CD36 CD38 CD45 CD56 CD71 HLA-DR Ⅱ. 標識蛍光色素の選択近年のフローサイトメトリーの進歩特に PE 標識抗体が普通に用いられるようになり従来は検出できなかったレベルの細胞表面抗原でも解析できるようになっています白血病タイピングにおいても発現の弱いマーカー例えば CD10 CD13 CD19 CD33 CD34 CD117 などに PE 標識抗体を用いればより高感度にマーカーを検出することができます 2

細胞表面マーカー分析のポイント一般に白血病タイピングはリンパ球サブセット分析に比べて難しいと考えられていますがこれは主に次のような理由によります検体が骨髄液だったり細胞数が異常に多い ( あるいは少ない ) などサンプルに特別の前処理を要することが多い FCM のサイトグラム上で解析する細胞集団の位置 ( ゲーティング領域 ) が決まってない

3 細胞表面マーカー分析のポイント一般に白血病タイピングはリンパ球サブセット分析に比べて難しいと考えられていますがこれは主に次のような理由によります検体が骨髄液だったり細胞数が異常に多い ( あるいは少ない ) などサンプルに特別の前処理を要することが多い FCM のサイトグラム上で解析する細胞集団の位置 ( ゲーティング領域 ) が決まってない蛍光ヒストグラムのパターンが一定でなく ( しばしば蛍光強度が低かったり抗体の非特異的反応が強い ) 検体中の白血病細胞の割合も様々なためデータの解釈が難しいすなわちこれらが白血病タイピングのキーポイントでありこれらの要因をクリアできれば白血病タイピングはそれほど難しいアプリケーションではないということができます Ⅰ. 検体 ( サンプル ) の前処理白血病タイピングに用いるモノクローナル抗体試薬の至適細胞数はおおむね 0.3~1x10 6 個 / テストです ( 製品ラインにより異なりますので添付文書またはデータシートを参照して下さい ) したがって白血球数の異常に多い検体 (WBC が 10,000/μL 以上 ) は希釈し異常に少ない検体 (WBC が 1,000/μL 未満 ) はバフィーコートに濃縮しますまた白血病検体ではしばしば Fc レセプタを介した非特異的反応が強くみられることがありますので分離単核球を検体とするときは必ず Fc レセプタのブロッキング操作を行ってください Ⅱ. サイトグラム上での白血病細胞のゲーティングリンパ球サブセット分析の場合は解析ゲートを常にリンパ球領域に設定すればよいのですが白血病タイピングでは白血病細胞が分布する領域にゲートを設定しなければなりません白血病タイピングに用いる検体はしばしば検体中の腫瘍細胞の割合が少ない ( 正常血球の割合が高い ) ことがあります白血病細胞の割合が少ないほどサイトグラムでは白血病細胞以外の正常リンパ球単球顆粒球等の集団の比率が大きくなるため正しいゲーティングが困難になります骨髄液では赤芽球の混入も考慮しなければなりませんこのように白血病細胞の割合の少ない検体では解析ゲートの設定や結果の解釈が困難となる場合があります散乱光のサイトグラムは細胞の大きさと内部構造 ( 顆粒密度など ) を反映しますのでリンパ系腫瘍はおおむねリンパ球領域あるいはそれより前方散乱が強い領域に分布します非リンパ系腫瘍では分化度の低い AML-M1 はおおむねリンパ球領域かリンパ球領域と単球領域の中間に分化段階が進むにしたがって側方散乱が強くなり AML- M3(APL) では顆粒球領域に近接した位置に分布する傾向がみられます ( 文献 3) したがって白血病細胞のゲーティングには形態学的情報が重要です CD45 蛍光を用いた白血病細胞のゲーティングについては後述します Ⅲ. 蛍光ヒストグラムのパターン ( 分析結果の解釈 ) 白血病細胞は細胞表面抗原の発現に異常をきたしている場合が少なくなく多くのマーカーでしばしば蛍光強度に異常がみられます蛍光強度が異常に低い場合陽性集団のピークが陰性コントロールで設定した陽性領域より陰性側に分布することがありますこの場合見た目の陽性率は低くなります例えば陽性率 50% という結果は陰性細胞と明らかな陽性細胞が半々である場合 ( 図 1 左 ) 以外に 100% 陽性でも蛍光強度が低いために半分が偽陰性になっている場合 ( 図 1 右 ) も考えられますしたがって白血病タイピングの分析結果を陽性率の数値だけで判断するのは危険でヒストグラムデータを添付するか図 1 右のような場合は弱陽性など何らかのコメントを付す必要があります CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute: 旧 NCCLS) のガイドライン (H43-A2) や JCCLS のガイドライン (H2-P) でもこの点が指摘されています ( 文献 4,25) 図 1: 陽性率 50% の意味陽性率 50% 陽性率 50% 3

4 Ⅳ. 陽性陰性の判別これから白血病タイピングを行うという方からしばしば陽性率が何 % 以上なら陽性と判定するか? というご質問をいただきます文献では陽性率 10~40% の範囲でカットオフ値を設定しているものが複数みられますが前述の理由からすべてのマーカーに画一的にカットオフ陽性率を設定するのは適当でないと考えられますさらに検体中の白血病細胞の割合が様々であり用いるマーカーの多くが正常血球 ( の一部 ) にも反応することからマーカーごとであってもすべての検体に画一的にカットオフ値を設定することはできませんしたがって陽性 ( あるいは弱陽性 ) と陰性の判定は解析ゲート中に正常血球がどれくらい含まれているか ( 白血病細胞の純度 ) そのマーカーが混入する正常血球成分にどのくらい反応するか ( マーカーの特異性感度 ) 白血病細胞のマーカー発現が十分に強いか ( 蛍光ヒストグラムのパターン ) の 3 点を常に念頭に置いて判断する必要があります 4

CD45 ゲーティングの有用性 CD45 は白血球共通抗原 (Leukocyte Common Antigen; LCA) として知られています正常骨髄において細胞系統や分化段階によって CD45 の発現レベルに違いがみられること ( 文献 5) や急性白血病特に CD20 陰性の B 細胞性 ALL で高率に CD45 陰性の症例がみられ CD45 陽性率

5 CD45 ゲーティングの有用性 CD45 は白血球共通抗原 (Leukocyte Common Antigen; LCA) として知られています正常骨髄において細胞系統や分化段階によって CD45 の発現レベルに違いがみられること ( 文献 5) や急性白血病特に CD20 陰性の B 細胞性 ALL で高率に CD45 陰性の症例がみられ CD45 陽性率が低いほど予後が良いことが報告されています ( 文献 6) その後 CD45 蛍光と側方散乱で白血病細胞を精度良くゲーティングする方法論が提案され ( 文献 7-9) 現在ではルーチンの白血病タイピングでも CD45 を用いる施設が増えています CD45 ゲーティングではリンパ球および単球より CD45 蛍光が弱く側方散乱が同程度の位置に分布する集団が白血病細胞 ( 芽球細胞 ) になります ( 図 2 下 ) ただしこの方法論では多くの成熟リンパ腫瘍など CD45 の発現レベルが正常リンパ球と変わらないものは分別できませんこのため従来の前方散乱側方散乱によるゲーティングを併用する必要があります CD45 の蛍光強度には抗体により差異がみられることが報告されていることからも CD45 ゲーティングには J33 抗体が適しています ( 文献 10) 図 2 CD45 ゲーティングによる白血病タイピング例 Scatter-gating Mononuclear cell CD45 dim blast CD45-gating CD45 dim blast 5

細胞質内マーカーの有用性前述のように細胞表面抗原にはいずれの細胞系統においても特異性と感度を同時に満たすマーカーは見出されていません一方で CD3 など系統特異性の高い分化抗原のいくつかが分化段階の初期から細胞質内に存在していることは以前から知られていましたしかし容易かつ確実な分析方法が確立されていなかったこともありフローサイトメトリーによる細胞質内抗原の検出は長い間

6 細胞質内マーカーの有用性前述のように細胞表面抗原にはいずれの細胞系統においても特異性と感度を同時に満たすマーカーは見出されていません一方で CD3 など系統特異性の高い分化抗原のいくつかが分化段階の初期から細胞質内に存在していることは以前から知られていましたしかし容易かつ確実な分析方法が確立されていなかったこともありフローサイトメトリーによる細胞質内抗原の検出は長い間限られた研究室のみで行われるアプリケーションでした現在では固定膜透過処理試薬 (IntraPrep) が市販されており細胞質内抗原の検出が容易になったことからこのアプリケーションの白血病タイピングへの応用が幅広く行われるようになってきました欧州 7 カ国の研究者で構成される European Group for the Immunological Classification of Acute Leukemias (EGIL) は 1995 年に急性白血病の免疫学的分類に関する基準案を発表しています ( 文献 11-13) この基準案では各細胞系統を規定する上で細胞表面マーカーに加え cycd3,cycd79,mpo などの細胞質内マーカーも重用していますまた Biphenotypic Acute Leukemias (BAL) の鑑別に関して下表のようなスコアリングシステムを提唱していますこのスコアリングシステムでは CD3 CD79 MPO 等の細胞機能に直接関わる系統特異性の高い細胞質内マーカーに高いポイントが付けられています ( 表 3) 表 3: Biphenotypic Acute Leukemias (BAL)* 鑑別スコアリングシステム (EGIL) ポイント ** B 細胞系 T 細胞系骨髄細胞系 CD79a cy IgM (cy) CD22 CD19 CD10 CD20 TdT CD24 (cy/m) CD3 TCR-α/β TCR-γ/δ CD2 CD5 CD8 CD10 TdT CD1a CD7 MPO CD13 CD33 CD65 CD117 CD14 CD15 CD64 注 ) * : B 系または T 系のいずれか一方と骨髄細胞系が 2 ポイント以上の場合に BAL と判断 ** : 各陽性マーカーについてそれぞれ対応するポイントを加算する細胞質内マーカーには細胞系統に固有の機能に直接関係するものが多くその分析結果は系統特異性をより強く反映していると考えられます図 3 に分析例を示します細胞表面抗原では白血病細胞は B 細胞系統骨髄細胞系統の Biphenotype を呈しますが細胞質内マーカーでは CD79a 陽性 MPO 陰性でありこの細胞が B 細胞起源であることがわかります正常な顆粒球は CD79a 陰性 MPO 陽性であり分析の過程には問題なかったことが分かります ( 図 3 下側 ) このように CD45 ゲーティングに加えて細胞表面マーカーと細胞質内マーカーを併用することで白血病タイピングの確実性が高まることが期待されます図 3 Biphenotype Leukemia の細胞質内マーカー分析例 MPO/CD79a/CD45 CD19/CD33/CD45 6

7 また同じく細胞内抗原を応用した例として aberrant expression の認められる ALL や AML と上記の Biphenotypic acute leukemia に相当する mixed-lineage leukemia を鑑別する基準も提唱されています ( 文献 14) この基準においても細胞系統特異性の高い CD3,CD79a,MPO などが採用されています ( 表 4) 表 4: 骨髄系マーカー陽性 ALL リンパ系マーカー陽性 AML mixed-lineage leukemia の鑑別基準 (Campana et al.) B-lineage My + ALL * Ly + AML * Leukemic cells are: 1. CD79a+ or cigμ+ or CD19+ and CD CD3-3. MPOand express CD13,CD15,CD33, or CD65 T-lineage My + ALL * Leukemic cells are: 1. CD7+ and CD3+(surface or cytoplasmic) 2. CD79a- 3. MPOand express CD13,CD15,CD33, or CD65 Leukemic cells are: 1. MPO+ or express at least two other My markers 2. CD3-3. CD79aand express CD2,CD5,CD7,CD19,CD22 or CD56 True mixed-lineage leukemia Leukemic cells coexpress: 1. MPO and CD79a or cigμ or 2. MPO and CD3 or 3. ccd3 and cigμ *: すべての基準を満たすこと My + ALL: 骨髄関連抗原陽性の ALL, Ly + AML: リンパ系抗原陽性の AML 多発性骨髄腫細胞解析における CD38 ゲーティングの有用性多発性骨髄腫 (Multiple Myeloma) は骨髄において形質細胞が単クローン性かつ進行性に増殖している造血器腫瘍の一種であり高齢者で多く認められますその解析には形質細胞が CD38 強発現であることを利用したゲーティング (CD38 ゲーティング ) が一般的に行われており形質細胞のみを識別することが可能です抗 CD38 抗体を用いたゲーティングと多重染色による表面抗原解析から形質細胞を多クローン (CD19+CD56-) 単クローン (CD19+CD56+ or CD19-CD56+ or CD19-CD56-) に判別でき他の抗体を組み合わせることでその分化段階も知ることができるとされています ( 文献 15) しかし CD38 抗原は形質細胞に特異的なマーカーではなく T 細胞 B 細胞単球等にも発現していることや骨髄腫細胞の CD38 発現量が低い症例も存在することから CD38/SSC によるゲーティングのほかに CD38/CD45 を用いたゲーティングの併用や形質細胞に対して特異性が高い抗 CD138 抗体により CD38 によるゲーティング領域の適正を判断するなどの方法も利用されています図 4 抗 CD38 抗体を用いた骨髄腫細胞ゲーティング例 CD38/SS CD38/CD45 7

8 参考文献 1. 和田守正ほか (1998): Mebio vol. 15: T. Mori, et al. (1995): Leukemia vol. 9: 青木定夫 (1987): 日血会誌 vol. 50: CLSI Document H43-A2,2007, Clinical and Laboratory Standards Institute. 5. V.O. Shah, et al. (1988): J. Immunol. vol. 140: F.G. Behm, et al. (1992): Blood vol. 79: G.T. Stelzer, et al. (1993): Ann. NY Acad. Sci. vol. 677: M.J. Borowitiz, et al. (1993): Am. J. Clin. Pathol. vol. 100: 西川潔ほか (1996): 臨床病理 vol. 44: C.W. caldwell, et al. (1993): Blood vol. 81: (Letter). 11. MC Bene, et al. (1995): Leukemia vol. 9: MC Bene,et al.(1998): Blood vol.92: EGIL,1998:Leukemia vol.12: D Campana,et al.(2000): J.Immunol.Methods vol.243: 河野道生 (1999): 現代医療 vol.31: CH Pui, et al. (1993): Blood vol. 82: BF Haynes, et al. (1989): Immunology Today vol. 10: EL Reinherz and SF Schlossman (1981): Cancer Res. vol. 41: FM Uckun (1990): Blood vol. 76: KC Anderson, et al. (1984): Blood vol. 63: AS Freedman, et al. (1987): Blood vol. 70: HG Drexler (1987): Leukemia vol. 1: JD Griffin, et al. (1986): Blood vol. 68: SF Schlossman, et al. (ed.) : Leucocyte Typing V, 1995, Oxford JCCLS ガイドライン (H2-P v1.0) 2003: 日本臨床検査標準化協議会 8

9 付 1 白血病細胞マーカー分析に用いられるマーカーの分布図および注意点 ( 文献 16-24) ( 細胞表面細胞質内 ) T 細胞系 ( および関連 ) 推奨 CD する Stem Celll 標識 Prothymic Cell Early Thymocyte 分布範囲 Intermediate Thymocyte Mature Thymocyte Circulating T-Cell 備考 CD1 CD2 NK の大半が+ CD3 細胞質内染色有用 CD4 単球は dull+ CD5 B-CLL の 95% で+ CD7 AML の一部 + NK+ CD8 NK の一部 + CD34 PE B 細胞系 ( および関連 ) 推奨 CD する Stem Celll 標識 Early Pre-B PreB 分布範囲 Immature B Mature Resting B Activated B Plasma Cell 備考 CD10 CD19 CD20 CD22 CD79 CD38 CD34 PE PE 好中球は dull+ 正常 B は bright+ 細胞質内染色有用形質細胞は Bright+ HLA-DR B 単球活性化 T 骨髄細胞が+ Igκ 免疫グロブリン軽鎖 Igλ 骨髄系 ( および関連 ) 推奨 CD する標識 CD13 CD14 CD33 CD34 CD117 PE PE PE PE 分布範囲 Mono Pro-mono CFU-GM Myeloblast Promyelo Myelo PMN 免疫グロブリン軽鎖備考 Gr と一部 B が dull+ HLA-DR B 単球活性化 T 骨髄細胞が+ MPO 細胞質内染色 Lactoferrin 細胞質内染色 9

10 付 2 白血病細胞マーカー分析パネル例 3 カラー分析, 急性白血病 3 カラー分析パネル設定にあたっての注意事項 1. CD45 ゲーティングすることで腫瘍細胞の割合の少ない検体でも正常細胞と異常細胞の区別が容易になる CD45 ゲーティングが有効でない場合は散乱光サイトグラムでゲーティングする 2. 検出感度と蛍光強度のバランスを考慮して発現の弱いマーカーや陽性陰性の分離が悪いマーカーに PE 標識を使用する例 : CD10 CD13 CD33 FITC 標識では偽陰性の恐れがある 3. 抗体の isotype が IgG2a/IgG2a IgG2a/IgG2b IgG2b/IgG2b となる組み合わせでは抗体の非特異反応による false double positive が起こる場合があるため片方が IgG1 となるように設定するとよい 4. 各蛍光色素間の蛍光コンペンセーションを必ず調整確認するとくに PC5 蛍光への PE 蛍光の漏れ込み補正が適切でないと CD45 陰性 ~ 弱陽性の細胞集団の分布位置が試験管によってばらつくことがある白血病解析パネル例 1-18 項目分析 FITC PE PC5 1 MsIgG(control) MsIgG(control) CD45 2 CD2 CD56 CD45 3 CD4 CD8 CD45 4 CD3 CD1a CD45 5 CD5 CD19 CD45 6 CD20 CD10 CD45 7 CD7 CD13 CD45 8 CD14 CD33 CD45 9 HLA-DR CD34 CD45 10 CD41 CD235a(Glycophorin A) CD45 パネル説明 1 コントロール抗体のアイソタイプはパネル抗体と同一のものを推奨いたします 2 T 細胞系と NK 細胞系の把握 T 細胞は CD2+/CD56- NK 細胞は CD2+/CD56+(CD3+T 細胞のごく一部も CD56+) CD56 は骨髄系腫瘍でも陽性となることがある 3 T 細胞の CD4,CD8 比率把握 ATL では CD4 CD8 伝染性単核球症では CD4 CD8 中間型胸腺段階では CD4+/CD8+ 4 T 細胞系と分化段階の把握 CD3 は T 細胞系に特異性の高いマーカー中間型胸腺段階では CD3-/CD1a+ ( 細胞質内 CD3 は +) 5 CD5 は T 細胞系マーカーであるが B-CLL の場合 CD5+/CD19+(CD20+) となる 6 Pre-B 段階では CD10+/CD20-(CD19+) 成熟 B 細胞は CD10-/CD20+(CD19+) 7 CD7 は T 細胞マーカーであるが骨髄系腫瘍で陽性となることがある CD13 は骨髄系マーカー 8 骨髄系と単球系の把握 CD14 は単球系マーカーであるが M4,M5 では陰性の場合もある CD33 は骨髄系マーカーであり成熟単球は CD14+/CD33+ 9 CD34 陽性あるいは CD34+/HLA-DR+ で他のマーカーが陰性の場合は造血幹細胞由来の可能性があり CD7 も陽性の場合は可能性が更に高い 10 赤芽球は CD235a(Glycophorin A)+ なので骨髄検体の場合 CD45- の細胞集団が白血病細胞かどうかの確認も可能巨核球血小板では CD41 陽性 10

11 白血病解析パネル例 2-18 項目分析 FITC PE PC5 1 MsIgG(control) MsIgG(control) CD45 2 CD2 CD56 CD45 3 CD3 CD5 CD45 4 CD4 CD8 CD45 5 CD34 CD10 CD45 6 CD20 CD19 CD45 7 CD7 CD13 CD45 8 CD14 CD33 CD45 9 HLA-DR CD117 CD45 10 CD41 CD235a(Glycophorin A ) CD45 パネル説明 1 コントロール抗体のアイソタイプはパネル抗体と同一のものを推奨いたします 2 T 細胞系と NK 細胞系の把握 T 細胞は CD2+/CD56- NK 細胞は CD2+/CD56+(CD3+T 細胞のごく一部も CD56+) CD56 は骨髄系腫瘍でも陽性となることがある 3 T 細胞系の把握 T 細胞は CD3+/CD5+ B-CLL における CD5 陽性例では CD3-/CD5+(CD19+,CD20+) となる 4 T 細胞の CD4,CD8 比率把握 ATL では CD4 CD8 伝染性単核球症では CD4 CD8 中間型胸腺段階では CD4+/CD8+ 5 CD34 陽性で他のマーカーが陰性の場合は造血幹細胞由来の可能性あり pre-b 段階では CD10+(CD19+,CD34 もしばしば陽性 ) 6 B 細胞系の把握成熟 B 細胞は CD19+/CD20+ Pre-B 細胞では CD19+/ CD20-(5 の CD10 も参照 ) 7 CD7 は T 細胞マーカーであるが骨髄系腫瘍で陽性となることがある CD13 は骨髄系マーカー 8 骨髄系と単球系の把握 CD14 は単球系マーカーであるが M4,M5 では陰性の場合もある CD33 は骨髄系マーカーであり成熟単球は CD14+CD33+ 9 HLA-DR は B 細胞系白血病や AML のほとんどで陽性 (APL では陰性 ) CD117 は骨髄性白血病の多くで陽性 10 赤芽球は CD235a(Glycophorin A)+ なので骨髄検体の場合 CD45- の細胞集団が白血病細胞かどうかの確認も可能巨核球血小板では CD41 陽性 11

12 付 3 白血病解析に用いられる抗体 JCCLS ガイドライン (H2-Pv1.0 文献 25) より引用急性白血病のための抗体 1. 主に B リンパ球系と反応 CD19:B リンパ球系 ALL のほとんどすべてに発現骨髄性白血病でも時に陽性 CD20:CD19 よりは低頻度 CD22: 通常発現しているが dim 細胞質により強く発現 CD10:B リンパ球系 ALL の多数に発現 T-ALL でも発現 CD79a:B リンパ球系 ALL の大部分に発現 AML でも発現例あり SmIgM,monoclonal immunoglobulin light chain: B リンパ球系 ALL の一部に発現 2. 主に T リンパ球系と反応 CD2: T-ALL の大部分に発現 AML でも発現例あり CD5: T-ALL の大部分に発現しているがしばしば dim CD7: T-ALL で最も高頻度に発現 AML の一部にも発現 CD3: 発現頻度は高くないが T リンパ球に特異的細胞質内 CD3 は T-ALL の最も特異的で sensitive なマーカー CD1a: しばしば発現 CD4,CD8 を同時に発現することもあり CD71: 大部分で陽性 CD38: 大部分で陽性 3. 主に骨髄系細胞と反応する抗体 CD13,CD33: 骨髄系白血病のほとんど全例でいずれかが発現しばしば ALL(T,B) でも CD14: 単球系への分化を示す骨髄系白血病でしばしば陽性 CD15,CD11b: 分化傾向を示す骨髄形白血病で陽性 CD41,CD61: 巨核芽球性白血病の診断に有用 CD235a(Glycophorin A): 赤白血病の診断に有用 CD34: 造血幹細胞のマーカー HLA-DR: AML,B-ALL のほとんどで陽性 T-ALL,APL ではしばしば陰性 TdT: ALL(T,B) の大多数で陽性 AML でもしばしば陽性 AntiMPO,CD65,CD117: 骨髄性白血病で陽性慢性リンパ性白血病やリンパ腫のための抗体 1. 主に B リンパ球と反応細胞表面免疫グロブリン : light chain restriction を示す CD19,CD20,CD22,CD37:B-ALL で通常陽性 CD10: follicular center B cell から発生したリンパ腫や白血病で陽性 B-CLL では陰性 CD23,CD5,CD20:CLL/SLL(small lymphocytic lymphoma) と MCL(mantle cell lymphoma) の鑑別に有用 CLL/SLL:CD23+,CD5+,CD20 dim MCL:CD23-,CD5+,CD20 bright CD103: hairy cell leukemia で陽性 CD25 と CD11c: 同時に発現すると hairy cell leukemia に特徴的 2. 主に T リンパ球と反応 CD3,CD2,CD5: T-CLL の大部分で陽性 CD8 or CD4: T-CLL の大部分はどちらかが陽性 CD5: B 細胞性白血病リンパ腫の一部特に B-CLL で陽性 CD7: T 細胞性腫瘍でしばしば消失 αβtcr: T 細胞性リンパ腫の大半で陽性 3. 主に骨髄系細胞と反応する抗体その他 CD11c: B-CLL の一部特に hairy cell leukemia で陽性 CD56,CD57: large granular lymphoproliferative disease でしばしば陽性 CD25,CD30,HLA-DR: transformed lymphocyte 由来のリンパ腫でしばしば陽性 CD38: 形質細胞性腫瘍で強陽性 12

13 付 4 TQ-Prep による白血病検体処理法フローチャート末梢血検体骨髄液リンパ節細胞数調整 (3~ /ml) 1 希釈 (> /ml の場合 ) 同一患者血漿または正常 AB 型血漿または EDTA 加 NBS で希釈患者血漿患者末梢血を 500 g で 5 分間遠心した上清 EDTA 加 NBS 培養用新生仔ウシ血清に EDTA を添加 (0.15%) 2 濃縮 (< /ml の場合 ) 検体を 500 g で 5 分遠心後上清を吸引除去血清加 PBS を添加して遠心洗浄 g で 4 分間遠心上清除去同一患者血漿または正常ヒト AB 血清または EDTA 加 NBS に再浮遊細胞数調整 (3~ /ml) ( 末梢血検体と同様に操作する ) ナイロンメッシュ (40μφ) でろ過 AML-M4またはM 5 等非特異結合が著しいと予想される場合はヒトγ グロブリンを最終濃度 5mg/mL 程度になるように添加する正常ヒトAB 血清ならば最終濃度 2~5% になるように加える室温で 30 分放置試験管 (12 75mm) に検体とモノクローナル抗体を分注よく攪拌しインキュベーション ( 室温 30~45 分, 遮光 ) TQ-Prep で溶血処理 5~10 分放置後 PBS で洗浄 (2 回サイトスタット,IOTest は 1 回でも可 ) 400~450 g で 5 分間遠心上清除去適量の 0.5%PFA 加 PBS に再浮遊 ( 直ちに測定する場合は PBS でも可 ) 細胞凝集塊等の異物がある場合はナイロンメッシュでろ過 FCM にて測定 3

14 T前駆細前駆細核球骨髄芽球細胞間型(胸腺Immunophenotyping Results 考えられる白血病細胞型使用する抗体胞中)T細胞成熟KT細細胞N胞B胞コモ熟ンAB細L型B細胞成胞骨髄球球系単系前球赤系巨系幹CD1a CD2 CD3 CD3( 細胞質内 ) CD4 CD5 CD7 CD8 CD19 CD20 CD79( 細胞質内 ) CD13 CD14 CD33 CD10 CD34 CD41 CD56 CD117 HLA-DR Glycophorin A :+ :+/- :- CE

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Microsoft PowerPoint FCM.....p2005.htm 臨床におけるフローサイトメーターの応用測定原理の概略臨床検査におけるFCM 応用例標準化と精度管理ベックマンコールター株式会社バイオメディカルリサーチ本部フローサイトメーター (FCM( FCM) 細胞や粒子の特性を調べる ( 光を当てた時に ) 細胞から出る光の強さを分析散乱光強度 ----- 細胞の大きさや内部構造蛍光強度 ----- 細胞の性状 ( 予め試料を染色 ) サイトミクス