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たみじろうたかにし
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1 Biotools 簡易マニュアル 2.2.4FA

1.FlexAnalysis でスペクトルにラベルをつけます Mass List Find Mass List Edit Mass List Find ボタンで全範囲にわたってピークピックもしくは Mass List Edit ボタンでピーク一つずつマニュアルでピークピックします (Autoflex 日本語マニュアル Ultraflex 日本語マニュアル参照 ) ただし

2 1.FlexAnalysis でスペクトルにラベルをつけます Mass List Find Mass List Edit Mass List Find ボタンで全範囲にわたってピークピックもしくは Mass List Edit ボタンでピーク一つずつマニュアルでピークピックします (Autoflex 日本語マニュアル Ultraflex 日本語マニュアル参照 ) ただしトリプシン自己消化物等のバックグラウンドピークはピックされていない状態にした方が良いでしょうもしくは FlexAnalysis Method のスクリプトを使用してソフトウェアにピークピックをさせる方法もあります 2. データを Biotools に転送します Tools メニューの Biotools を選択します (FlexAnalysis からの転送ではなく Biotools から直接読み込む場合には File メニューの Open コマンドを使用し任意のデータフォルダ内の 1r ファイルを指定します ) 2

マウス左ボタンをドラッグすると移動右ボタンをドラッグすると拡大縮小することも可能です 4.

3 3.Biotools が起動してデータが読み込まれます赤い線で示されているピークは既にピッキングされたピークですスペクトル全体表示スペクトル一部の拡大スペクトルを拡大するには虫メガネカーソル状態でマウスをドラッグします拡大を取消すにはクリックをしますまた縦軸横軸共それぞれの目盛ラベル周辺にカーソルを合わせて ( それによってカーソル形状が変化します ) マウス左ボタンをドラッグすると移動右ボタンをドラッグすると拡大縮小することも可能です 4.Biotools 上でのピークピッキングについて Analysis メニュー Add Peaks を選択してピッキングしたいピークを跨ぐようにドラッグします Add Peaks モードから抜ける場合はマウス右ボタンをクリックしますピックを取り消す場合には Remove Peaks を選択します後の手順は同様です * この後のデータ解析 ( データベース検索を含む ) はピックされているピークのみを考慮して行なわれます 3

5. データベース検索 (PMF,FAST/LIFT 共通 ) MS ボタン (FAST/LIFT の場合は MSMS ボタン ) をクリックすると検索条件入力画面が現れますので必要事項を入力します 2 6 8 10 12 1 4 5 3 7 9 13 11 14 1 検索に使用するMascotサーバのアドレス 2 検索をするユーザーの名前 3 検索をするユーザーのメールアドレス 4

4 5. データベース検索 (PMF,FAST/LIFT 共通 ) MS ボタン (FAST/LIFT の場合は MSMS ボタン ) をクリックすると検索条件入力画面が現れますので必要事項を入力します検索に使用するMascotサーバのアドレス 2 検索をするユーザーの名前 3 検索をするユーザーのメールアドレス 4 検索の名前 5サンプルの由来の種族 6 検索に使用するデータベース 7 使用した消化酵素の名前 8 存在する修飾 9 存在する可能性のある修飾 10タンパクの質量数 11Miss Clevageの最大数 12 質量数の許容誤差範囲 ( 通常 100~150ppm 程度 FAST/LIFTでは親イオンの誤差範囲 ) 13(FAST/LIFTのみ ) フラグメントイオンの質量数の許容誤差範囲 14(FAST/LIFTのみ )MALDI-TOF-PSD(FAST) もしくはMALDI-TOF-TOF(LIFT) を選択 ( は必須) (* 修飾を複数個選択する場合もしくは一度入力した修飾を削除する場合はCtrlキーを押しながら選択します ) 全て入力したら Start ボタンをクリックして検索を開始します 4

Sammary 画面と Peptide Summary 画面を切り替えることができます PMF の場合は Protein MS/MS サーチの場合は Peptide

5 6. 検索結果その 1 (MASCOT version 2.0) トップスコアでヒットしたタンパク ( ペプチド ) 2 検索結果のグラフ ( 横軸はスコア縦軸はヒットしたタンパクの数 ) 3 の部分で Protein Sammary 画面と Peptide Summary 画面を切り替えることができます PMF の場合は Protein MS/MS サーチの場合は Peptide Summary を選択して結果を閲覧することが推奨されています ( プルダウンメニューから選択して Format As ボタンをクリックします ) その検索に使用されたピークの質量数 2 ヒットしたタンパクペプチド ( スコア順 ) 3 青い丸はマッチしていることを示しています 5

6 そのヒットしたデータの一覧 (1) およびその詳細 (2) 各データの 3 のリンク (Accession) を辿るとさらに詳細について閲覧することが出来ます (Protein View) 6

7 7.(PMF の場合 ) 検索結果を Biotools に転送します Get All もしくは Get Hit(s) をクリックします Get all の場合はヒットしたすべてのデータを転送します Get Hit(s) はその下のダイアログに入力されているデータのみを転送します 1 であれば第一位のデータのみ 1,3 であれば第一位と第三位 1-3 であれば第一位から第三位までですハイフンとカンマは組み合わせて使用することも可能ですそして Exit をクリックすると Biotools の画面に戻りますこのように画面左側にデータが転送されスペクトル画面にはラベルその下にはシーケンスの情報が表示されます赤字のシーケンスはマッチしていることを示しその下のバーは色が濃いほどピーク強度が高いことを示しています Intensity Coverage: マッチしたピークの強度の総和ピックされているピークのピーク強度の総和 100 Sequence Coverage MS: タンパクの全シークエンス中マッチしたシークエンスの割合 7

8 8.(PMF の場合 ) データ解析 --- 二つ目のタンパクを探す --- 一度検索を行い Get All/Hit でデータを Biotools に転送した後 ( 複数のデータを転送した場合さらにその中から一つ目のタンパクを選択し ) 5. データベース検索と同様に MS ボタンでもう一度検索画面を表示させます Search Unmatched Peaks Only にチェックを入れて Start ボタンを押します ( その他の検索条件等はサンプルや実験履歴を考えて変更するか決めます ) Search Unmatched Peaks Only にチェックを入れるとピークリストから前回の検索でマッチしたものつまり一つ目のタンパク由来と考えられるピークがリストから除外されます 8

9.(PMF の場合 ) データ解析 --- 修飾を探す --- 図中赤丸の部分 (Digest Matches)

画面が現れますまず Select Unmatched(Mascot 検索でマッチしなかった質量数のみ選択 ) 次に

可能性のある修飾を全て入力します ( 可能性の無い修飾は入力するべきではありません ) 1 アミノ酸を選択 2

9 9.(PMF の場合 ) データ解析 --- 修飾を探す --- 図中赤丸の部分 (Digest Matches) をダブルクリックすると Sequence Editor が起動しさらに Search for mass 画面が現れますまず Select Unmatched(Mascot 検索でマッチしなかった質量数のみ選択 ) 次に Edit Mods( 修飾を入力する画面を呼び出します ) をクリックします可能性のある修飾を全て入力します ( 可能性の無い修飾は入力するべきではありません ) 1 アミノ酸を選択 2 位置を選択 3 修飾を選択 4Add をクリックして登録 5 必要な分だけ 1 から 4 を繰り返します 6 全て入力したら OK をクリックします 9

Search をクリックすると検索結果が表示されますそれぞれの結果をチェックし間違いが無ければ (

Select All をクリックします Send to Ms をクリックすると選択されたデータが

10 Search をクリックすると検索結果が表示されますそれぞれの結果をチェックし間違いが無ければ ( 妥当なら ) 選択します複数を選択するには Ctrl キーを押しながらクリック全てを選択するには Select All をクリックします Send to Ms をクリックすると選択されたデータが Biotools に転送されます Biotools では画面左側に新たなツリーが追加されます新たに追加されたツリーをクリック ( 選択 ) すると新たに見つかった情報のみでスペクトルにマッチングがかかりますツリーのルート ( 一番上 ) の部分を選択すると MASCOT での検索結果と併せてマッチング表示させることが出来ます 10

ハイフンとカンマは組み合わせて使用することも可能ですそして Exit をクリックすると Biotools の画面に戻りますタグラベルリストこのように画面左側にシークエンスのデータが転送され

11 10. (FAST/LIFT の場合 ) 検索結果を Biotools に転送します Get All もしくは Get Hit(s) をクリックします Get all の場合はヒットしたタンパク全てのデータを転送します Get Hit(s) はその下のダイアログに入力されているデータのみを転送します 1 であれば第一位のデータのみ 1,3 であれば第一位と第三位 1-3 であれば第一位から第三位までですハイフンとカンマは組み合わせて使用することも可能ですそして Exit をクリックすると Biotools の画面に戻りますタグラベルリストこのように画面左側にシークエンスのデータが転送されスペクトル画面にはラベルとタグその下にはシークエンスとフラグメントイオンの質量数等の情報 ( リスト ) が表示されます赤字はマッチしていることを示し灰色の文字はマッチしていない理論値を示していますこの灰色表示の数値を基にピークピックの再確認を行うことも可能ですフラグメントイオンの名称 11

そのシークエンスを直接手入力してスペクトルにマッチングをかけることが出来ます SequenceEditor ボタンを押すと

12 10. (FAST/LIFT の場合 )SequenceEditor からシークエンスを入力測定したペプチド断片のシークエンスに予め見当がついている場合はそのシークエンスを直接手入力してスペクトルにマッチングをかけることが出来ます SequenceEditor ボタンを押すと SequenceEditor が起動します New ボタンを押して新しいウインドウを表示させてシークエンスを手入力し Bio ボタンを押すとそのシークエンスが Biotools に転送されそのシークエンスをスペクトルにマッチングさせることが出来ます 12

11. (FAST/LIFTの場合)RapiDenovo ( RapiDenovo 専用の別ライセンスが必要です ) まずは MASCOT による検索を試みることを推奨いたしますある程度スペクトル全域にわたってシグナルが得られている必要がありますある一部 ( 領域 ) に全くシグナルが無いという状態では計算できない可能性があります FlexAnalysis のスクリプトや Mass List

Manual から見る事ができます FAST/LIFT のデータを読み込んでおき Analysis メニューの Full DeNovo Seqencing を選択します RapiDenovo の設定画面が現れますので必要事項を入力します 1 5 7 2 3 4 6 8 1 親イオンの質量数 ( 自動入力 ) 2 親イオン質量数の許容誤差範囲 3 フラグメントイオン質量数の許容誤差範囲 4

13 11. (FAST/LIFTの場合)RapiDenovo ( RapiDenovo 専用の別ライセンスが必要です ) まずは MASCOT による検索を試みることを推奨いたしますある程度スペクトル全域にわたってシグナルが得られている必要がありますある一部 ( 領域 ) に全くシグナルが無いという状態では計算できない可能性があります FlexAnalysis のスクリプトや Mass List Find コマンドによるピークピックでは不十分な場合がありますマニュアルでピックの状況を確認修正することを推奨しますこのテキストは飽くまで簡易版です RapiDenovo を使用する前に Biotools User Manual の関連部分をご一読下さい PDF 形式のファイルが PC にインストールされており Biotools の Help メニュー Open biotools Manual から見る事ができます FAST/LIFT のデータを読み込んでおき Analysis メニューの Full DeNovo Seqencing を選択します RapiDenovo の設定画面が現れますので必要事項を入力します親イオンの質量数 ( 自動入力 ) 2 親イオン質量数の許容誤差範囲 3 フラグメントイオン質量数の許容誤差範囲 4 計算で得られる候補シークエンスの評価判定基準 ( 大きな数値ほど厳しい ) 5 計算時のヒント :N 端のアミノ酸が判明しているときに入力 6 計算時のヒント :C 端のアミノ酸が判明しているときに入力 7 計算時のヒント : シークエンス中には無いことが判明しているアミノ酸を入力 8 計算時のヒント : シークエンス中にその存在が判明しているアミノ酸を入力 2~4 を入力したら Low mass ion info をクリックしますそれにより RapiDenovo がスペクトルの低分子量領域 ( つまり immonium ion 等 ) をチェックして 5~6 が自動入力されますただしスペクトルやピークピックの状況などによっては間違っている場合もありますので必ずチェックします文字はマニュアルでも入力削除可能です ( 通常 7 の I と Q は消しません ) 全て入力したら Calculate ボタンを押しますこれにより計算が始まり計算中は Cancel Calculation ボタンが押せるようになります ( もし計算結果無しの場合はこの Cancel Calculation ボタンがまた押せない状態になるだけですのでご注意ください ) 13

計算結果最終的に得られたシークエンス候補の数が多かった場合以下のウインドウが表示されます ( 少ない場合は表示されませんシークエンスがそのまま Biotools

Biotools スコア ( 括弧書きの数字 ) チェックを入れたシークエンスを Biotools に転送することができます ( チェックを入れて Accept ボタン

(*PCが直接インターネットに接続されている必要があります) シークエンスにチェックを入れ Copy/MS Blast ボタン (

14 計算結果最終的に得られたシークエンス候補の数が多かった場合以下のウインドウが表示されます ( 少ない場合は表示されませんシークエンスがそのまま Biotools に転送されます ) 部分的なシークエンス候補とそのスコア ( 最高 100) チェックの有無で下の表示が変化します最終的に得られたシークエンス候補とその Biotools スコア ( 括弧書きの数字 ) チェックを入れたシークエンスを Biotools に転送することができます ( チェックを入れて Accept ボタン ) 転送後は Biotools スコアの他に Denovo スコアも表示されます計算結果を基にホモロジー検索で同定を試みる場合 (*PCが直接インターネットに接続されている必要があります) シークエンスにチェックを入れ Copy/MS Blast ボタン ( チェックの入ったシークエンスがコピーされます ) 続いて Open MS Blast ボタンを押すと Internet Exprorer が起動し MS Blast Search のホームページが表示されますそこでペーストをし Submit Query ボタンをします 14

12. (LIFT の場合 ) コンバインサーチ一つのサンプルから一つの MS スペクトル (PMF) と一つもしくは複数の

これによって検索の制度が向上する可能性があります一つにまとめようとするデータのみを全て Biotools に読み込みます

multiple LIFT spectra を選択します Combine Spectra 画面が現れますので OK

15 12. (LIFT の場合 ) コンバインサーチ一つのサンプルから一つの MS スペクトル (PMF) と一つもしくは複数の FAST/LIFT スペクトルを測定した場合それら複数のデータを一つのデータにまとめて一度に検索を行うことができますこれによって検索の制度が向上する可能性があります一つにまとめようとするデータのみを全て Biotools に読み込みますそれらは必ず一つの PMF と一つもしくは複数の FAST/LIFT でなければいけません File メニューの Combine multiple LIFT spectra を選択します Combine Spectra 画面が現れますので OK をクリックします PMF_LIFT.mgf というデータが作成されます後は通常の MS/MS サーチと同様に MSMS ボタンを押して検索を行います 15

エンドポイント濁度測定装置 LT-16　取扱説明書

エンドポイント濁度測定装置 LT-16　取扱説明書エンドポイント濁度測定装置 LT-16 LT-16 Manager マニュアル ( 簡易マニュアル Version 2.0) LT-16 Manager のインストール LT-16 Manager は添付の CD に内蔵されています LT-16 Manager は Windows 7 Windows 8 において動作確認をしております ( 以下の図は Windows 8 使用時の表示図面です ) ただし