PureExo Exosome Isolation Kit for cell culture media & serum 高純度エクソソームを高収率 迅速に単離 エクソソームは 細胞由来の直径 nm の細胞外小胞で 広範囲の生体液 ( 血液 尿 羊水 細胞培養培地など ) に存在していま

Transcription

1 Revolutionary Tools for Exosome Research Cell Exosome Cell 2 ml 0.1 ml 2 ml ml PureExo Cell KIT P100 PureExo Serum KIT P101 DiagExo Urine KIT P120 DiagExo BodyFluid KIT P121 in 100 ul PBS 75 ul 25 ul RNA Exosomal RNA & Protein Extraction kit ( P200)

2 PureExo Exosome Isolation Kit for cell culture media & serum 高純度エクソソームを高収率 迅速に単離 エクソソームは 細胞由来の直径 nm の細胞外小胞で 広範囲の生体液 ( 血液 尿 羊水 細胞培養培地など ) に存在しています エクソソームは 細胞内情報伝達に重要な役割を果たし ある種のヒトの疾病に対する予後 治療 バイオマーカーとして使用できる可能性を持っています 本製品は 細胞培地 ( 品番 P100) 又は血清 ( 品番 P101) から完全なエクソソームを 迅速かつ効果的に回収するためのキットです 特長 超遠心 煩雑な単離操作は不要 操作時間は 2-3 時間程度 超遠心よりも高い回収率 (5-10 倍 ) 抗体ベースの手法より低コスト 高純度のエクソソームを回収可能 少量のサンプル ( 細胞培地 :2-4mL 血清 0.2mL) から高収率で回収 回収したエクソソームは各種アプリケーションに適用可能 (EM 研究 エクソソームラベル エクソソームサブポピュレーション エクソソーム mirnaのqrt-pcrプロファイリング エクソソームタンパク質のゲル分析など ) 溶液 A B C PureExo カラム 使用例 図.1 NIH3T3 細胞培地から本製品を用いて回収したエクソソームの透過型電子顕微鏡画像得られたエクソソームは 膜に包まれた球状の粒子 ( 直径 nm) として観察された 図.2 エクソソーム由来 RNA の定量分析 NIH3T3 細胞培地から本キットまたは超遠心分離法でエクソソームを単離した トータルエクソソーム RNA を NanoDrop 8000 分光光度計で計測した 本キットで単離したエクソソームは 超遠心分離法よりも エクソソーム RNA 量が多かった 図.3 粒度分布分析 NIH3T3 細胞 ( 細胞 ) の培地から 超遠心分離法 (A) 又は本キット (B) で トータルエクソソームを単離し BI 200SM Research Goniometer System (632.8nm レーザー ) を用いて動的光散乱 (DLS;dynamic light scattering) を測定した 単離したエクソソーム群の DLS 分布は 単一ピーク ( 直径 ~ 150nm) を示した 本キットで単離したエクソソームは超遠心分離法で単離したエクソソームと同様の分布を示した 図.4 エクソソーマルタンパク質マーカー分析 NIH3T3 細胞の培地 30mL から超遠心分離法で 又は同培地 5mL から本キットで それぞれエクソソームを単離した 回収したエクソソームを溶解し 得られたエクソソームタンパク質を Bio-Rad 4 20% グラジエントポリアクリルアミドゲルにロードして分離した エクソソームのマーカー CD9 及び脂質ラフトマーカーフロチリンを それぞれ抗 CD9 抗体 (Life span Biosciences 社品番 LS-B7794) 及び抗フロチリン抗体 (Abcam 社品番 AB41927) で認識させ イムノブロット分析した 本キットは 超遠心分離法と比べて 高純度 高収率のエクソソームを単離した Bio, LLC メーカー略号 :OBL 保存 : 常温 P100 PureExo Exosome Isolation kit (for cell culture media) 1 KIT 74,000 P101 PureExo Exosome Isolation kit (for serum) 1 KIT 64,000

3 DiagExo Urinary Exosome Isolation Kit 本製品は 尿サンプルからエクソソームを迅速かつ効率的に単離するためのキットです 尿サンプルから高収率でエクソソームを回収 特長 高純度のエクソソームを単離 超遠心よりも高い回収率 ( 約 10 倍 ) 超遠心 煩雑な単離操作は不要 操作時間は 2 時間程度 抗体ベースの手法より低コスト わずか 1mL の尿サンプルから高収率でエクソソームを回収 回収したエクソソームは各種アプリケーションに適用可能 (EM 研究 エクソソームラベル エクソソームサブポピュレーション エクソソーム mirnaのqrt-pcrプロファイリング エクソソームタンパク質のゲル分析など ) 溶液 A B C DiagExo カラム 1. サンプル調製 : 尿サンプル 3mL を 2000g 室温で 10 分間遠心し 細片を除去します 2. ペレットに触れないように 澄明な上清を新しいガラス管 1 に移し 氷上に置きます 3. ガラス管 2 に溶液 A/B/C の混合液を調製します ( 溶液 A: 0.25mL 溶液 B:0.25mL 溶液 C:1.0mL) * 溶液 C のボトルは使用の都度蓋を閉めます 4. ガラス管 2( 溶液 A/B/C 混合液 ) を 5-10 秒間ボルテックスし 均一な溶液にします 5. ガラス管 2( 溶液 A/B/C 混合液 1.5mL) をガラス管 1( 尿サンプル 3mL) に加えます 6. ガラス管 1 の蓋をしっかり閉め 30 秒間強くボルテックスし 4 で 1 時間インキュベートします 7. 混合液が 3 層に分かれます ( 右図参照 ) 中間の fluff 層に触れないように ピペットで上層をゆっくり吸引し 除去します (2 層 ( 上層と fluff 層 ) しか見えないこともあります ) 8. 残りの層をマイクロチューブに移し 300g で 2-3 分間遠心します 新しく 3 層が現れます ( 上層 : 培地の色 中層 : fluff 下層: 無色 ) 上層を注意深く吸引し 完全に除去します 9. ピペットチップを下層に挿入し 無色の下層も完全に除去します fluff 層だけをチューブに残します 10. マイクロチューブの蓋を解放し 室温で 5-10 分間乾燥させます ( 過乾燥させない ) 11. PBS μ L を加え ピペットで上下させて fluff を再懸濁します 12. 懸濁液を DiagExo カラムに移し カラムを 2000g で 5 分間遠心し 通過画分を回収します 13. この通過画分が単離された高純度エクソソームです 単離したエクソソームはそのまま使用するか 4 で最大 1 週間 又は -80 で最大 3 ヶ月間保存できます 101 Bio, LLC メーカー略号 :OBL 保存 : 常温品番品名包装希望販売価格 P120 DiagExo Urinary Exosome Isolation kit 1 KIT 74,000 2

4 DiagExo Human Body Fluid Exosome Isolation Kit 各種体液サンプルから高収率でエクソソームを回収 本製品は 各種体液サンプル ( 脳脊髄液 (CSF) 羊水 炎症性液 リンパ液 母乳 唾液 胃腸液(GI) 肺胞洗浄液など) からエクソソームを単離するためのキットです 0.5-2mL のサンプルから高収率でエクソソームを単離します 単離したエクソソームは 各種アプリケーション (EM 研究 エクソソームラベル エクソソームサブポピュレーション エクソソーム由来 mirna の qrt-pcr プロファイリング エクソソーム由来タンパク質のゲル分析や ELISA など ) に適用できます 溶液 A B C DiagExo カラム 1. サンプル調製 : 下表を参照に 必要な量の体液サンプルを採取します 2000g 室温で 10 分間遠心し 細片を除去します 2. ペレットに触れないように 澄明な上清を新しいガラス管 1 に移し 氷上に置きます 3. ガラス管 2 に溶液 A/B/C の混合液を調製します ( サンプル量に対する溶液 A/B/C の量は表 1 を参照 ) * 溶液 C のボトルは使用の都度蓋を閉めます 4. ガラス管 2 を穏やかに 5-10 秒間ボルテックスし 均一な溶液にします 5. ガラス管 2( 溶液 A/B/C の混合液 ) をガラス管 1( 体液サンプル ) に加えます 6. ガラス管 1 のキャップをしっかり閉め 30 秒間強くボルテックスし 4 で 1 時間インキュベートします 7. 混合液が 3 層に分かれます (p,2 の図参照 ) 中層の fluff に触れないように ピペットで上層を吸引し 除去します (2 層 ( 上層と fluff 層 ) しか見えないこともあります ) 8. 残りの層をマイクロチューブに移し 300g で 2-3 分間遠心します 新しく 3 層が現れます ( 上層 : 培地の色 中層 : fluff 下層: 無色 ) 上層を注意深く吸引し 完全に除去します 9. ピペットチップを下層に挿入し 無色の下層も完全に除去します fluff 層だけをチューブに残します 10. マイクロチューブの蓋を解放し 室温で 5-10 分間乾燥させます ( 過乾燥させない ) 11. PBS μ L を加え ピペットで上下させて fluff を再懸濁します 12. 懸濁液を DiagExo カラムに移し カラムを 2000g で 5 分間遠心し 通過画分を回収します 13. この通過画分が単離された高純度エクソソームです 単離したエクソソームはそのまま使用するか 4 で最大 1 週間 又は -80 で最大 3 ヶ月間保存できます 反応容量 溶液 A:20 μ L 溶液 B:20 μ L 溶液 C:80 μ L 溶液 A:40 μ L 溶液 B:40 μ L 溶液 C:160 μ L 溶液 A:60 μ L 溶液 B:60 μ L 溶液 C:240 μ L 溶液 A:80 μ L 溶液 B:80 μ L 溶液 C:320 μ L 溶液 A:100 μ L 溶液 B:100 μ L 溶液 C:400 μ L 各サンプル推奨容量 (μ L) 血清 CSF 羊水炎症性液体リンパ液母乳唾液胃腸液肺胞洗浄液 Bio, LLC メーカー略号 :OBL 保存 : 常温 3 P121 DiagExo Human Body Fluid Exosome Isolation kit 1 KIT 74,000

5 Exosomal RNA and Protein Extraction Kit エクソソーム中の RNA 及びタンパク質を抽出本製品は 各種エクソソーム単離キット ( 品番 P100 P101 P120 P121) で単離した高純度エクソソームから エクソソーマル RNA 及びエクソソーマルタンパク質の両方を抽出するためのキットです エクソソーマルタンパク質溶解バッファー N1 N2 N3 N4 溶液 RNA 溶離バッファー サンプル調製 1. 単離したエクソソームを RNase フリーチューブに移します PBS を加え 100 μ L とします 2. RNA とタンパク質の両方の抽出が必要な場合は エクソソームサンプルを 2 つに分けます :75 μ L を RNA 抽出 25 μ L をタンパク質抽出 エクソソーマル RNA の抽出 3. エクソソームサンプル 75 μ L を RNase フリーチューブに移し N1 溶液 250 μ L を加えます ピペットで上下させて混合し 室温で 5 分間インキュベートします * エクソソームサンプル量が異なる場合は N1 溶液の容量をサンプル量に比例して調節してください 4. N2 溶液 50 μ L をサンプルに加え 15 秒間強くボルテックスし 室温で 2-3 分間インキュベートします g 4 で 15 分間遠心します 6. 境界面を乱さないように 上層 ( 水層 ) を吸引し 新しい RNase フリーチューブに移します 7. N3 溶液 125 μ L を加え エクソソーマル RNA を沈殿させます 8. 室温で 15 分間インキュベートし 12000g 4 で 10 分間遠心します 9. エクソソーマル RNA のペレットは チューブの底または側部でゲルを形成します 上清を注意深く吸引し 除去します 10. RNAペレットにN4 溶液 250μLを加えて混合し 7500g 4 で 5 分間遠心します RNA ペレットに触れないように 上清を除去します 11. ステップ 10 を繰り返します 12. RNA ペレットを室温で 10 分間風乾させます 13. RNA ペレットを RNA 溶離バッファー μ L に溶解させます そのままアッセイに用いるか -80 で保管します エクソソーマルタンパク質の抽出 14. エクソソーマルタンパク質溶解バッファーを室温で解凍し 氷上に置きます 15. エクソソームサンプル 25 μ L を新しいチューブに移し エクソソームタンパク質溶解バッファー μ L を加え ピペットで上下させて混合します で 15 分間インキュベートし 14000g 4 で 10 分間遠心します 17. この上清が抽出したエクソソーマルタンパク質です 上清を新しいチューブに移し 氷上に置きます タンパク質濃度を測定し そのままアッセイに用いるか -80 で最大 3 ヶ月間保存できます 101 Bio, LLC メーカー略号 :OBL 保存 : 常温 & -20 P200 Exosomal RNA and Protein Extraction kit 20 PREP. 48,000 4

6 DiagExo Serum Exosomal Protein Extraction Kit 微量サンプルから高収率でエクソソーマルムタンパク質を回収本製品は ヒトの血清 母乳 唾液 腹膜流体 脳脊髄液 (CSF) 胃腸液(GI) 羊水から エクソソーム由来のタンパク質を単離するためのキットです わずか 100 μ L のサンプルから効率的にタンパク質を抽出します 特長 高純度のエクソソームを回収 超遠心法に比べて高い回収率 ( 約 10 倍 ) 遠心操作も煩雑な単離操作も不要 ( 操作時間は 2 時間以内 ) 抗体ビーズ法よりも低コスト 回収したエクソソームは各種アプリケーションに適用可能 (EM 研究 エクソソームラベル エクソソームサブポピュレーション エクソソーム mirnaのqrt-pcrプロファイリング エクソソームタンパク質のゲル分析など ) 1. 体液サンプルを採取し 氷上で冷却します g で 10 分間遠心し 細片を除去します 3. ペレットに触れないように 澄明な上清を新しいガラス管 1 に移します 4. ガラス管 2 に溶液 A/B/C の混合液を調製します ( サンプル量に対する溶液 A/B/C の量は下表を参照 ) * 溶液 C のボトルは使用の都度蓋を閉めます 5. ガラス管 2 を穏やかに 5-10 秒間ボルテックスし 均一な溶液にします 6. ガラス管 2( 溶液 A/B/C の混合液 ) をガラス管 1( 体液サンプル ) に加えます 7. ガラス管 1 のキャップをしっかり閉め 30 秒間強くボルテックスし 4 で 1 時間インキュベートします 8. 混合液が 3 層に分かれます ( 下層 : 無色 中層 : fluff( けば状のもの ) 上層: 橙色又は元々の体液サンプルの色 ) 中層の fluff に触れないように ピペットで上層を吸引し 除去します (2 層 ( 上層と fluff 層 ) しか見えないこともあります ) 溶液 A B C DiagExo カラム DiagExo 溶解バッファー 9. 残りの層をマイクロチューブに移し 300g で 2-3 分間遠心します 新しく 3 層が現れます ( 上層 : 培地の色 中層 : fluff 下層: 無色 ) 上層を注意深く吸引し 完全に除去します 10. ピペットチップを下層に挿入し 無色の下層も完全に除去します fluff 層だけをチューブに残します 11. マイクロチューブの蓋を解放し 室温で 5-10 分間乾燥させます ( 過乾燥させない ) 12. PBS μ L を加え ピペットで上下させて fluff を再懸濁します 13. 懸濁液を DiagExo カラムに移し カラムを 2000g で 5 分間遠心し 通過画分を回収します 14. この通過画分が単離された高純度エクソソームです 氷上で保管します 15. DiagExo 溶解バッファーを解凍し その μ L を単離したエクソソームに加えます 5 回ほどピペットで上下させ 完全に混合します 氷上で 15 分間インキュベートします ,000g 4 で 10 分間遠心します その上清が抽出されたエクソソーマルタンパク質です 新しいチューブに移し -80 で保存します 反応容量 溶液 A:20 μ L 溶液 B:20 μ L 溶液 C:80 μ L 溶液 A:40 μ L 溶液 B:40 μ L 溶液 C:160 μ L 溶液 A:60 μ L 溶液 B:60 μ L 溶液 C:240 μ L 溶液 A:80 μ L 溶液 B:80 μ L 溶液 C:320 μ L 溶液 A:100 μ L 溶液 B:100 μ L 溶液 C:400 μ L 各サンプル推奨容量 (μ L) 血清 CSF 羊水炎症性液体リンパ液母乳唾液胃腸液肺胞洗浄液 Bio, LLC メーカー略号 :OBL 保存 : 常温 & -20 P300 DiagExo Serum Exosomal Protein Extraction kit 10 RXN 88,000

7 ExoFectin srna-into-exosome Kit エクソソームに small RNA(siRNA mirna など ) を簡単導入本製品は 各種エクソソーム単離キット ( 品番 P100 P101 P120 P121) で単離した高純度エクソソームに mirna sirna などの small RNA を導入するためのキットです 特長 高いローディング効率 エクソソームに対する影響は穏やか 扱いやすい! エレクトロポレーション法用 ( 品番 :P400) ExoFectin 溶液 A B エレクトロポーレーションキュベット 無菌ピペット ケミカル法用 ( 品番 :P401) ExoFectin Reagent Supplemental buffer エレクトロポレーション法 1. 高純度エクソソームを単離します ( エクソソーム単離キット ( 品番 P100 P101 P120 P121 など ) を使用 ) 単離したエクソソームがペレットの場合は PBS μ L に再懸濁します ( エクソソームペレットの大きさに応じて ペレットの 10 倍容量の PBS を加えます ) エクソソーム懸濁液を氷上に置きます 2. エクソソーム懸濁液 2-5 μ L をとり エクソソームタンパク質を定量します トータルのエクソソームタンパク質濃度がエクソソームの定量値を示します 3. ExoFectin 溶液 A 65 μ L と ExoFectin 溶液 B 35 μ L を混合し エクソソーム ( μ g) 及び small RNA(0.1-3 μ mol) に加えて ピペットで上下させて混合させます * 混合液のトータル容量は 120 μ L を超えないようにしてください 4. ExoFectin - エクソソーム -smallrna 混合液をキュベットに移します ( 混合液でキュベットの底を覆い 気泡が入らないようにしてください ) キュベットに蓋をします 5. 混合液の入ったキュベットを エレクトロポレーターキュベットホルダーに挿入します 400mV パルスタイム 秒で混合液をエレクトロポレートします 6. エレクトロポレート完了後 キュベットを取り出し PBS 500 μ L をキュベットに加えます キットに添付の無菌ピペットを使用して 混合液を新しい無菌チューブ ( 予め 1% BSA を含む PBS 1.5mL を入れておく ) に移します この時点でエクソソームには smallrna が導入されています 7.( オプション )PureExo エクソソーム単離キット ( 品番 P100) を用いてエクソソームを沈殿させます 8. smallrna を導入したエクソソームについて 下記のようなアプリケーションに使用できます (1) エクソソームを使ってターゲット細胞に RNA をデリバリー : 1% BSA を含む PBS にエクソソームを懸濁します ターゲット細胞を 48 時間飢餓状態にします もしくは 50% コンフルエントに達するまでターゲット細胞を FBS 枯渇状態で培養します smallrna を導入したエクソソームを加えます 時間培養を続けた後 細胞を回収し リアルタイム RT-PCR でターゲット遺伝子の発現を測定します (2) in vivo RNA デリバリー ( 動物への静脈注射 ( 尾部注射など ) 又は局所注射 ( 筋肉内注射など ) によるデリバリー ): 単離したエクソソームを 5% グルコース通常食塩水に再懸濁し レシピエント動物に注射します 注射を繰り返すことで エクソソームデリバリーの効果を増強することができます 免疫抵抗を最小限に抑えるために エクソソームの由来と同じ種のレシピエント動物を選択することを推奨します エクソソームデリバリー後 各種時点において 挿入した組織におけるターゲット遺伝子の発現を リアルタイム RT-PCR を用いて測定するか イメージングにてターゲット遺伝子の発現を検出します 101 Bio, LLC メーカー略号 :OBL 保存 :4 P400 ExoFectin srna-into-exosome Kit (Electro) 1 KIT 82,000 P401 ExoFectin srna-into-exosome Kit (Chemical) 1 KIT 45,000 6

8 Revolutionary Tools for Exosome Research 1 Normal cell exosome extraction service 2 Exosome RNA and protein extraction service 3 Disease cell exosome extraction service 4 Exosome fluorescent labeling 5 Exosome Biotin labeling 6 Exosome antibody labeling 7 Exosome FACS sorting