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えりかしもかさ
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1 Promega KAWARABAN プロメガは発光テクノロジーで創薬がん研究をサポートします二頁プライマリー細胞不要! T細胞活性化バイオアッセイ三頁タンパク質の部分変性を回避! 新たなタンパク質消化法四五頁代謝物質をプレートリーダーで高速解析!六頁 RT-qPCR + レポーターアッセイで 1+ 1= 3!? 七頁野外トランスクリプトーム研究を支える Maxwell RSC 自動核酸精製装置217 年春号プロメガ株式会社

2 バイオ医薬プロジェクト T T Cell Activation AssaysT T Cell Activation PD-1/PD-L1 T T T T Cell Activation T TCR IL-2 TCR IL-2 IL-2 NFAT NFAT Nuclear factor of activated T-cells T IL-2 NFAT NFAT-RE NFAT TCR/CD3 TCR co-receptor CD28 T Cell Activation Bioassays TCR/CD3 NFAT 1ACD28 IL-2 1B 2 A. TCR B. CD3 CD3 TCR/CD3 Effector Cell (NFAT) Glo CD28 NFAT-RE Luciferase CD3 TCR 1. T Cell Activation Bioassay CD3 TCR/CD3 Effector Cell (IL-2) 2 NFAT TCR/CD3 PD-1/PD-L1 NFAT CD28 CTLA-4 IL-2 IL-2 PD-1/PD-L1 NFAT 2 PD-L1 or PD-L2 aapc/cho-k1 Cells Glo CD28 IL-2 promoter Luciferase aapc/raji Cells 13791MA T Cell Activation Bioassay Anti-CD3 T AbataceptCTLA-4 R IgG-Fc BlinatumomabCD3 CD19 Jurkat Jurkat Cell Propagation Model, CPM Chimeric Antigen Receptor, CAR T CAR-T CAR VL VHscFv N CD3 ζ C 3 CAR T scfv CD3 ζ T T scfv CD3 ζ CD28 4-1BB 3 CAR CAR NFAT Ectodomain Endodomain Signal VH VL Linker scfv Spacer Transmembrane Intracytoplasmic CD19/CD2 scfv Ab CD28 Linker 4-1BB CD3ζ Bioluminescence (RLU) 1.2E +6 1.E +6 8.E +5 6.E +5 4.E +5 2.E +5.E + TCR/CD3 (NFAT) Ratio of CAR DNA to Carrier DNA αcd19-car : Carrier 1: αcd19-car : Carrier 3.3:6.6 αcd19-car : Carrier 1:9 αcd19-car : Carrier :1 αcd2-car : Carrier 1: αcd2-car : Carrier 3.3:6.6 αcd2-car : Carrier 1:9 αcd2-car : Carrier :1 3. CD19 CD2 CAR T Cell Activation Bioassay CAR TCR/CD3 Effector CellsNFAT CD19-CAR CD2-CAR Raji T Cell Activation Bioassay ADCC Reporter Bioassay Cell Propagation Model, CPM Raji No Raji 2 TCR Activator TCR NFAT-RE PD-L1 or PD-L2 PD-L1 Luciferase PD-1 Effector Cells (Jurkat) Anti-PD-L1 or Anti-PD-L2 Anti-PD-1 TCR Activator 2. 2 TCR CD8/86 CD28 IL-2 Promoter Luciferase CTLA-4 Effector Cells (Jurkat) CTLA-4 Anti-CTLA-4 NFAT J , T Cell Activation Bioassay NFAT5X J , NFAT, Propagation Model J161 IL-2 J , T Cell Activation Bioassay IL-25X J , IL-2, Propagation Model J1631

バイオ医薬プロジェクト EU 3 AccuMap Low ph Protein Digestion kit 1 Lys-C 1 1. Low ph digestion Low ph digestion IgG Low ph digestion 8 15 IgG1 IgG1 28~32 2 S-S S-S S-S 2.

3 バイオ医薬プロジェクト EU 3 AccuMap Low ph Protein Digestion kit 1 Lys-C 1 1. Low ph digestion Low ph digestion IgG Low ph digestion 8 15 IgG1 IgG1 28~32 2 S-S S-S S-S 2. TPEVTCVVVDVSHEDPEVK S-S SFNRGEC Cys265 Cys213 Low ph digestion S-S Oxidation Suppressant AccuMap Low ph Protein Digestion kit Rapid Digestion Kit Rapid Digestion Kit 3 3. Rapid Digestion Kit IdeS IdeZ? IdeS IdeZ kawara167_p2.pdf AccuMap Low ph Protein Digestion kit Rapid Digestion Kit - Trypsin 1 µg VA16 35, Rapid Digestion Kit - Trypsin/Lys-C 1 µg VA161 53, 3Promega KAWARABAN

細胞ビックバン高次元細胞プロジェクト代謝物質をプレートリーダーで高速解析細胞は周囲を取り巻く環境に適応するために細胞内のシグナル経路や代謝経路を変化させ生存分化増殖といった運命決定を行っています近年では癌細胞や細胞分化の過程でエネルギー代謝に変化が現れることが明らかとなり創薬や再生医療の分野で新たな標的としてエネルギー代謝が注目を集めています

幹細胞はその多能性を維持するために解糖系に依存した代謝特性を各タイムポイントで培養上清を回収しました各サンプルは希釈して発示す一方分化段階が進むにつれてミトコンドリアでの酸化的リン酸化光アッセイのタイミングまで凍結保存し最後のサンプリング後に発光の活性が高まり代謝経路が移っていく事が知られています (Int. J. Mol. Sci.

培地中の乳酸とグルタミン酸量の増加が観察されましたグルコースとグルタミンが細胞内に取り込まれ代謝産物の放出がなされた結果を反映していますまた代謝産物がエピジェネティックな制御に関与したり脳神経組織 5倍希釈しサンプルを分けて発光アッセイのように代謝産物が神経伝達物質として働くことも知られています (Cell Metabolism, 216, 23, 27-47 Neuron,

このような背景を受けてプロメガでは発光法でエネルギー代謝産物 4, 2, 2, 8h を測定する技術を開発しています図 1 にはグルコース乳酸グルタミンなデヒドロゲナーゼがルシフェリン前駆体を還元することにより発光反 48h 72h 8h 48h 72h Time, hrs グルタミンの消費 8, グルタミン酸の分泌 4, 7, 光を生じます

4 細胞ビックバン高次元細胞プロジェクト代謝物質をプレートリーダーで高速解析細胞は周囲を取り巻く環境に適応するために細胞内のシグナル経路や代謝経路を変化させ生存分化増殖といった運命決定を行っています近年では癌細胞や細胞分化の過程でエネルギー代謝に変化が現れることが明らかとなり創薬や再生医療の分野で新たな標的としてエネルギー代謝が注目を集めていますプロメガでは細胞の多様な応答性を細胞内外の酵素や代謝物を指標として簡便高感度に測定するアッセイ技術を数多く開発してきました今回はエネルギー代謝の主要なマーカーであるグルタミングルタミン酸グルコース乳酸を高感度な発光法で検出できる新たなアッセイシステムをご紹介いたしますエネルギー代謝アッセイへの注目の高まり肺がん細胞株の A549 細胞を異なる細胞数で播種し 3 日間培養を続け幹細胞はその多能性を維持するために解糖系に依存した代謝特性を各タイムポイントで培養上清を回収しました各サンプルは希釈して発示す一方分化段階が進むにつれてミトコンドリアでの酸化的リン酸化光アッセイのタイミングまで凍結保存し最後のサンプリング後に発光の活性が高まり代謝経路が移っていく事が知られています (Int. J. Mol. Sci. 216, 17, 253) 昨今がん領域で注目を浴びている免疫系においアッセイを行いましたても代謝経路の変化はホットなトピックであり T 細胞の分化の際には解糖系からミトコンドリアでの代謝への変化が起きるといわれています (Nature Reviews, 216, 16, 553) 細胞数および培養日数に依存してグルコースとグルタミンの減少が観察されその一方で培地中の乳酸とグルタミン酸量の増加が観察されましたグルコースとグルタミンが細胞内に取り込まれ代謝産物の放出がなされた結果を反映していますまた代謝産物がエピジェネティックな制御に関与したり脳神経組織 5倍希釈しサンプルを分けて発光アッセイのように代謝産物が神経伝達物質として働くことも知られています (Cell Metabolism, 216, 23, Neuron, 215, 86, ) 細胞播種 Glucose 細胞培養 Lactate 細胞周囲の代謝産物量の変化細胞内の代謝経路の評価は今後重要各タイムポイントで培養上清 2µLを回収なアッセイの１つになっていくでしょう発光でのエネルギー代謝産物の測定グルコースの消費 1,8, ていました 1,6, 1,4, 1,4, 1,2, 1,, 8, 6, 1,2, 1,, 8, 6, 4, このような背景を受けてプロメガでは発光法でエネルギー代謝産物 4, 2, 2, 8h を測定する技術を開発しています図 1 にはグルコース乳酸グルタミンなデヒドロゲナーゼがルシフェリン前駆体を還元することにより発光反 48h 72h 8h 48h 72h Time, hrs グルタミンの消費 8, グルタミン酸の分泌 4, 7, 光を生じます発光シグナルはルミノメーターで簡便に測定できるため Time, hrs グルタミン酸の測定原理の概要を示しています各測定対象に特異的応に必要なルシフェリンを生成するため各産物の濃度に比例した発乳酸の分泌 1,8, 1,6, 雑な MS 解析 HPLC RI などの技術が必要となりボトルネックとなっこれまで生体反応に関わっている様々な代謝産物を解析するには煩 Glutamine Glutamate 6, 5, 4, 3, 高価な機器の導入や煩雑な準備を行う必要はありませんまた特殊な 2, 前処理を行う必要はなく試薬の添加混合のみで測定することがで 3, 2, 1, 1, 8h 48h 8h 72h Time, hrs 48h 72h Time, hrs きます加えてこの技術は細胞内の測定だけではなく細胞外培養上清サンプルや組織サンプル血液体液サンプルにも対応可能図 2. 培養上清を用いた各代謝産物の経時的測定です図 1 各代謝産物のグラフにおいて濃い棒グラフは 15, 細胞の条件を示し薄い棒グラフは 5, 細胞の条件を示すまた赤い点線は培地のみの測定値を示す培地は DMEM, 5mM glucose, 2mM glutamine, 1% dialyzed serum を使用したグルコース乳酸グルタミングルタミン酸図 3 にはマクロファージ様に分化誘導した細胞を用いた例を示しましルシフェリン前駆体 NAD(P)H たマクロファージには大きく分けて M1 型と M2 型と呼ばれる 2 つのサブグループが存在し M1 型は炎症の惹起 M2 型は抗炎症反応に関ルシフェリン NAD(P) デヒドロゲナーゼルシフェラーゼレダクターゼ Light Light 与すると言われていますまた M1 型は解糖系が亢進している事が明らかになっていますヒト単球細胞株 THP-1 細胞を分化誘導し各サブグループの代謝活性酵素活性を評価したところ M1 型ではグルコースの取り込み量と乳酸の分泌量細胞内が亢進している結果が観察されましたこのような分化誘導による代謝活性の評価にも対応可能です PMA 血液体液培地 THP1 発光代謝アッセイ ia Med IFNγ LPS IL4 IL13 M Remove media for lactate Wash cells Add 2DG M1 M2 乳酸の分泌グルコースの取込み 4 3,, サンプル組織図 1. 上図グルコース乳酸グルタミングルタミン酸測定の原理下図代謝産物測定アッセイで対応可能なサンプル例培養上清や分化誘導した細胞を使ったアプリケーションこの技術を使って培養上清中の代謝産物の経時的な変化を測定したアプリケーションを図 2 に示しました一般的な細胞株では増殖の際にグルコースとグルタミンを細胞内に取り込み代謝産物として乳酸とグルタミン酸を培地中に放出します 4 3 M1 M2 2 1 M (RLU) 3次元培養 lactate(mm) M 2,5, 2,, M1 M2 1,5, 1,, 5, 図 3. T 細胞における代謝活性の比較 THP-1 細胞を PMA で刺激しマクロファージ様に分化誘導したその後 M1 型は IFN γ +LPS 刺激にて M2 型は IL4+IL13 刺激にて分化誘導したその後培養上清中の乳酸量左グラフおよびグルコースの取り込み量の評価右グラフを行った Glucose Uptake はかわら版 216 年夏号をご覧ください kawara167_p3.pdf

5 3 2 4 µ L 5 pico mol ips T Web 4 ATP RealTime-Glo CellTiter-Fluor CellTiter-Glo ATP A C (CellTiter-Glo ) 1, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 5, 1, 2, Cells per well 4. A549 well ATP A. B. RealTime-Glo CellTiter-Fluor C. ATP CellTiter-Glo 2. Assay RealTime-Glo CellTiter-Fluor D. Glutamate-Glo Assay 培養上清での細胞生存性アッセイ細胞ライセートの作成細胞内のグルタミン酸の測定 ATP アッセイ B (RealTime-Glo ) D (Glutamate-Glo ) 3,5, 3,, 2,5, 2,, 1,5, 1,, 5, 1,8, 1,6, 1,4, 1,2, 1,, 8, 6, 4, 2, 5, 1, 2, Cells per well RentaMax : GloMax & 5, 1, 2, Cells per well Fluorescence (CellTiter-Fluor ) S/N Lactate Glutamate Glucose Glutamine Metabolites, µm S/B Lactate 1nM5pmol/5 µl Up to 2 µm >24 Glucose 5nM.25pmol/5 µl Up to 5 µm >1 Glutamine 5nM.25pmol/5 µl Up to 5 µm >1 Glutamate 5nM.25pmol/5 µl Up to 5 µm >5 5. Add to Measure Donna Leippe et al. J Biomol Screen 216 Nov A Cacace and P Sonveaux et al. Oncogene, 1 11., 216 Assay kit Lactate-Glo Assay 5 ml J521 74, Glucose-Glo Assay 5 ml J621 67, Glutamate-Glo Assay 5 ml J721 74, Glutamine/Glutamate-Glo Assay 5 ml J821 8, CellTiter-Glo 2. Assay ATP 1 ml1 G , CellTiter-Fluor Cell Viability Assay 1 ml1 G68 17, RealTime-Glo MT Cell Viability Assay 1 G9711 2, Glucose Uptake-Glo Assay 5 ml5 J , RentaMAX / /! 5Promega KAWARABAN

6 ありのままの細胞解析 RT-qPCR = 3!? NanoLuc 6 CRISPR RT-qPCR HRE-luc2P NanoLuc ( 転写活性 ) HIF1A-Nluc( タンパク質レベル ) RT-qPCR RT-qPCR RT-qPCR mrna / [ex. IC, EC] artifact RNA PCR RNA 2nd RT-qPCR RT-qPCR RNA PCR artifact PCR transient transfection RT-qPCR RT-qPCR 1 ips ES semi-qpcr ES Oct3/4 Nanog RT-qPCR RT-qPCR 1Kazutoshi Takahashi and Shinya Yamanaka, Cell 126, , 26 RT-qPCR + NanoLuc = 3?! NanoLuc Luciferase (Nluc) NanoLuc Oplophorus gracilirostris 19kDa (Fluc) 1 1 Fold Response(log scale) 1 1 Celltiter-Fluor ( 細胞生存性 ) Log1[Phenanthroline](M) 1. HEK293 CellTiter-Fluor HIF1A-Nluc NanoDLR 8 Nluc NanoLuc RI 196 DNA VGF VGF c-fos 2 NanoLuc NanoLuc 2 Masato Katsuyama, et al. "Clioquinol Increases the Expression of VGF, a Neuropeptide Precursor, Through Induction of c-fos Expression" Journal of Pharmacological Sciences 124, , 214 NanoLuc NanoLuc GPCR CREB CRE camp / PKA NFAT NFAT RE / ELK / SRF SRE MAP / ERK SRF SRF RE RhoA AP1 AP1 RE MAPK / JNK Nrf2 ARE p53 p53 RE DNA ATF6 ATF6 RE ATF4 ATF4 RE MTF1 MRE Hif1 α HRE AhR XRE AP1 AP1 RE MAPK / JNK NF- κ B NF- κ B RE NF- κ B STAT1STAT2 ISRE INF- α STAT3STAT3 SIE IL-6 SMAD3SMAD4 SBE TGF- β STAT5STAT5 STAT5 RE IL-3 STAT1STAT1 GAS RE JAK / STAT1 IFN- γ C / EBP RE TCF-LEF TCF-LEF RE Wnt MycMax Myc Myc 1395MA

, (217), Bioinformatics 気象データトランスクリプトームデータ統計モデリング / 機械学習 solar radiation temperature 理解データベース予測 Nagano et al., (212) Cell 1.

7 Maxwell RSC Nagano et al., (212), Cell Maxwell RSC Instrument RNA Maxwell RSC Instrument Maxwell RSC Instrument 16 RNA-Seq Iwayama et al., (217), Bioinformatics 気象データトランスクリプトームデータ統計モデリング / 機械学習 solar radiation temperature 理解データベース予測 Nagano et al., (212) Cell 1. 従来法 Speed Up! Cost Down! 当研究室従来法当研究室自動化などにより RNA-Seq を大幅に低コスト多検体化 2. RNA-Seq RNA-Seq WGS GBS(ddRAD-Seq) NGS Maxwell RSC Instrument NGS Maxwell RSC Instrument 1 AS45 2,8, Maxwell RSC Plant RNA Kit 48 AS15 39, promega.formstack.com/forms/muzusample 7Promega KAWARABAN

4 4 4 4 / & RealTime-Glo MT Cell Viability Assay 1 G9711 2, 14, CellTox Green Cytotoxicity Assay 1 ml G8741 16, 9,6 CellTiter-Glo 2.

5 ml G89 21, 12,6 NanoLuc NanoBiT NanoBiT PPI MCS Starter System 1 N214 18, 18, NanoBiT PPI Flexi Starter System 1 N215 18, 18, MCS [ ] Flexi [Flexi ] NanoLuc / Nano-Glo Dual-Luciferase /pnl 1.1.TK Bundle 1 N1521 8, 4, Nano-Glo Dual-Luciferase /pnl1.

53[luc2/pgk] Bundle 1 N1551 8, 4, Nano-Glo Dual-Luciferase ReporterAssaySystem 1 ml N161 39, 31, Nano-Glo LuciferaseAssay 1 ml N111 23, 18, Bundle NAD(P)H 217 4 1 6 23 Glucose Uptake-Glo Assay 5 ml

8 / & RealTime-Glo MT Cell Viability Assay 1 G9711 2, 14, CellTox Green Cytotoxicity Assay 1 ml G , 9,6 CellTiter-Glo 2. Assay 1 ml G , 9, CellTiter-Glo 3D Cell Assay 1 ml G , 11,2 CellTiter-Fluor Cell Viability Assay 1 ml G68 17, 1,2 3/7 Caspase-Glo 3/7 Assay 2.5 ml G89 21, 12,6 NanoLuc NanoBiT NanoBiT PPI MCS Starter System 1 N214 18, 18, NanoBiT PPI Flexi Starter System 1 N215 18, 18, MCS [ ] Flexi [Flexi ] NanoLuc / Nano-Glo Dual-Luciferase /pnl 1.1.TK Bundle 1 N1521 8, 4, Nano-Glo Dual-Luciferase /pnl1.1 PGK Bundle 1 N1531 8, 4, Nano-Glo Dual-Luciferase /pgl4.54[luc2/tk] Bundle 1 N1541 8, 4, Nano-Glo Dual-Luciferase /pgl4.53[luc2/pgk] Bundle 1 N1551 8, 4, Nano-Glo Dual-Luciferase ReporterAssaySystem 1 ml N161 39, 31, Nano-Glo LuciferaseAssay 1 ml N111 23, 18, Bundle NAD(P)H Glucose Uptake-Glo Assay 5 ml J , 44,1 NAD/NADH-Glo Assay 1 ml G971 9, 63, NADP/NADPH-Glo Assay 1 ml G981 9, 63, NanoLuc pnl [NlucP/NFAT-RE/Puro] Vector 2 µg 78, pnl [NlucP/NFAT-RE/Hygro] Vector 2 µg 78, pnl [NlucP/CRE/Hygro] Vector 2 µg 78, pnl [NlucP/p53-RE/Hygro] Vector 2 µg 78, pnl [NlucP/ATF6-RE/Hygro] Vector 2 µg 78, pnl [NlucP/ATF4-RE/Hygro] Vector 2 µg 78, pnl [NlucP/MRE/Hygro] Vector 2 µg 78, pnl [NlucP/HRE/Hygro] Vector 2 µg 78, pnl [NlucP/GAS-RE/Hygro] Vector 2 µg 78, pnl [NlucP/ISRE/Hygro] Vector 2 µg 78, pnl [NlucP/SIE/Hygro] Vector 2 µg 78, pnl [NlucP/STAT5-RE/Hygro] Vector 2 µg 78, pnl [NlucP/AP1-RE/Hygro] Vector 2 µg 78, pnl [NlucP/CEBP-RE/Hygro] Vector 2 µg 78, pnl [NlucP/MycMax-RE/Hygro] Vector 2 µg 78, pnl[nlucp/are/hygro] Vector 2 µg 78, pnl[nlucp/sre/hygro] Vector 2 µg 78, pnl[nlucp/srf/hygro] Vector 2 µg 78, pnl[nlucp/sbe/hygro] Vector 2 µg 78, pnl [NlucP/TCF/LEF-RE/Hygro] Vector 2 µg 78, pnl [NlucP/XRE/Hygro] Vector 2 µg 78, pnl3.2.nf-b-re [NlucP/NF-B-RE/ Hygro] Vector 2 µg N , 51,1 promega.formstack.com/forms/nvect217 pgl4.42[luc2p/hre/hygro] Vector 2 µg E41 73, 51,1 pnlf1-hif1a [CMV/neo] Vector System 2 µg N , 51,1 NanoLuc NanoLuc NanoLuc 1 19kDa / NanoBRET,NanoBiT HiBiT 4 NanoLuc Frank Fan NanoLuc : :3 promega.formstack.com/forms/nlucseminar217 Tel / Fax [email protected] プロメガ株式会社本社東京都中央区日本橋大伝馬町マツモトビル Tel /Fax 大阪事務所大阪市淀川区西中島花原第 8ビル74 号室 Tel /Fax Web sitewww.promega.jp 製品の仕様価格については 217 年 3 月現在のものであり予告なしに変更することがあります販売店 PK173-2B

バイオ医薬プロジェクト PD-1/PD-L1 PD-1/PD-L1 PD-1/PD-L1 PD-1/PD-L1 T T PD-1 PD-L1 T PD-L1 T PD-1/PD-L1 T PD-1/PD-L1 T T T PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay PD-1/PD-L1

バイオ医薬プロジェクト PD-1/PD-L1 PD-1/PD-L1 PD-1/PD-L1 PD-1/PD-L1 T T PD-1 PD-L1 T PD-L1 T PD-1/PD-L1 T PD-1/PD-L1 T T T PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay PD-1/PD-L1 Promega KAWARABA 216 年夏号プロメガは発光テクノロジーで創薬がん研究をサポートします二頁免疫チェックポイントをレポーターで定量PD-1/PD-L1 三頁グルコースの取込みとエネルギー代謝四頁エピジェネティクス酵素の発光アッセイ五頁 anoluc ってすごい!: より高感度なレポーターアッセイ六頁実験をすすめるためのRentaMAX 活用術七頁細胞内タンパク質相互作用の高感度バイオセンサー