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1 ( 病原 ) 細菌検査の流れ 細菌の分離 培養 同定 横浜市立大学医学部微生物学講座吉田篤司 ( 病原 ) 細菌検査の流れ ( 病原 ) 細菌検査の流れ 増菌培養 増菌培養 1

2 ( 病原 ) 細菌検査の流れ塗沫 鏡検検査 塗沫 乾燥 固定染色洗浄固定 エンテロバクターグラム染色像 55 才女性 留置カテーテル尿 尿路感染を疑いグラム染色を実施多数のグラム陽性球菌と一部フィラメント状に変形したグラム陰性桿菌が認められた ( tomatsugazou/bpic5.jpg) ( 病原 ) 細菌検査の流れ細菌の分離 分離培養 様々な種類の細菌が混在している検体から 各々の菌を純粋に取り出すために行う培養法 1 個 1 個の菌が特定の場所で増殖して肉眼で見える大きさまで菌の集落 ( コロニー ) を形成し かつ他の集落と隔てられ独立した存在であれば可能である. 最も簡単な方法が寒天平板培地を白金耳を用いておこなう方法である 2

3 分離培養の方法 急性膀胱炎の尿塗抹標本グラム染色し鏡検多数の白血球を認め 一部に食菌が認められる かなり多数のグラム陰性桿菌が認められる この尿を簡易検査法にて定量培養を行った BTB 乳糖寒天に塗抹した結果集落数より 本菌は尿 1ml 中に >10 5 存在することが確認され 本菌を原因菌と考えてよい BTB 乳糖寒天培地で黄色い集落が観察され 大腸菌群の菌であることが推測された同定の結果 本菌は E. coli であった 3

4 数回発熱 細菌尿を認め化学療法を繰り返している慢性腎孟腎炎の症例尿塗抹標本のグラム染色像多数の白血球 多数のグラム陰性桿菌が認められる 定量エーゼによる簡易尿細菌定量法で 10 5 /ml 以上の細菌を認め 本菌は原因菌としてよい集落が示すよう緑色の色素を産出し 緑膿菌であることが推測された同定の結果は Pseudomonas aeruginosa であった ( 病原 ) 細菌検査の流れ 4

5 腸内細菌の分離培地 ( 選択分離培地 ) BTB 上の寒天上の腸内細菌のコロニー DHL 寒天上の腸内細菌のコロニー E. coliは乳糖を分解するために中心部赤色コロニー Shigellaは無色の小さなコロニー Salmonellaは硫化水素を産生するために中心部が黒色のコロニー Serratiaは色素産生のために紅色中型やや軟らかい感じのコロニー E. cloacaeも赤色のコロニーを作るがやや軟らかい感じがする E. coliは黄色の大型コロニー Shigella は無色の小さなコロニー Salmonella は中型のコロニー Serratiaは産生色素と培地の色のために暗紫色のコロニー E. cloacaeは無色のコロニー Proteusは無色のコロニー ( スォーミング ) 生化学的検査 ( 確認培養 ) 典型的大腸菌 TSI LIM SIM CLIG : 培地 TSI 寒天培地 目的 組成 PH7.4 作製 腸内細菌の糖分解 肉エキスペプトン乳糖 白糖 ブドウ糖塩化ナトリウムチオ硫酸ナトリウム亜硫酸ナトリウム硫酸第一鉄フェノール赤 (6.8: 橙 ~8.4 赤 ) 寒天 小試 4ml 分注 分半斜面に固める 培養 35 18~24 時間 判定 -/-(-) +/A -/A +/AG +/AG (+) 5

6 LIM 寒天培地 目的 組成 PH6.8± 作製 培養 判定 腸内細菌のリジン脱炭酸 ペプトン ブドウ糖 酵母エキス L- リジン塩酸塩 L- トリプトファン ブロムクレゾールパープル 寒天 小試 3ml 分注 分 35 18~24 時間 + Escherichia coli salmonella Enterrobacter aerogenes Vibrio - Shigella Enterobacter cloacae/aggromerans Citorobacter Yerusinia Proteus SIMブイヨン 目的腸内細菌の鑑別硫化水素産生 (S) インドール(I) 運動性 (M) IPA 組成 PH7.4 肉エキスペプトンチオ硫酸ナトリウム塩酸システインクエン酸鉄アンモニウム寒天 作製 小試 3ml 分注 分 培養 35 18~24 時間 判定 リジンデカルボキシラーゼ産生性 インドール産生性および運動性 SIM(IPA) S+ ind+ M+ IPA+ 判定 -+- Klebsiella oxytoca -++ Escherichia coli Serratia Yersinia --- Klebsiella pneumoniae クリグラー確認培地 目的 組成 PH7.4 腸内細菌の乳糖 ブドウ糖の分解 (TSI から白糖を除いたもの ) カゼインペプトン乳糖 肉ペプトン 塩化ナトリウム肉エキス 酵母エキス ブドウ糖クエン酸鉄三アンモニウム チオ硫酸ナトリウムフェノ - ルレッド 寒天 +++(+) Proteus vulgaris --+ Enterobacter +w-+(+) Proteus mirabilis +d+(-) Citrobacter 作製小試 3ml 分注 分 半斜面に固める 培養 35 18~24 時間 判定 Eschericia coli( 乳糖遅分解 ) Proteus Y.enterocolitica Vibrio cholerae 6

7 シモンズのクエン酸塩 目的 組成 PH6.7± 腸内細菌のクエン酸利用能 リン酸一水素カリウム クエン酸ナトリウムリン酸ニ水素カリウム 硫酸マグネシウム塩化ナトリウム ブロムチモールブルー 寒天 Escherichia coli 作製小試 2ml 分注 分オートクレーブ全斜面に固める 培養 35 18~24 時間 判定 + ほとんどの腸内細菌 Pseudomonas - Escherichia coli Shigella Morganella Proteus morganii 培地 T S I ( 斜面 / 高層 ) 結果 + ( 黄 ) / + ( 黄 ) ガス シ モ ン S I M V ズ ク P エ ン 酸 化 水 素 IPA 硫 インドール ナ ト リ ( 褐色 ) ( 黒変 ) ( 赤変 ) ウム + ガ ス 尿素 運動性 + Salmonella typhimurium Salmonella Paratyphi A 培地 T S I ( 斜面 / 高層 ) 結果 ( 赤 ) / + ( 黄 ) 黒変 シ モ ン S I M V 尿 運 ズ ク P 素 動 エ ン 酸 IPA 硫化水素 インドール 性 ナ ト リ ( 褐色 ) ( 黒変 ) ( 赤変 ) ウム + ( 青 ) + + 培地 T S I ( 斜面 / 高層 ) 結果 ( 赤 ) / + ( 黄 ) シ モ ン S I M V ズ ク P エ ン 酸 化 水 素 IPA 硫 インドール ナ ト リ ( 褐色 ) ( 黒変 ) ( 赤変 ) ウム ガ ス 尿素 運動性 7

8 Klebsiella pneumoniae ( 病原 ) 細菌検査の流れ 培地 T S I ( 斜面 / 高層 ) 結果 + ( 黄 ) / + ( 黄 ) ガス シ モ ン S I M V 尿 運 ズ ク P 素 動 エ ン 酸 水素 性 IPA 硫化 インドール ナ ト リ ( 褐色 ) ( 黒変 ) ( 赤変 ) ウム + ( 青 ) + + 血清学的検査 菌体成分の抗原によって 菌を分類 同定する方法 免疫血清の作り方 ~ 採血 免疫 H は鞭毛の抗原 O は菌表面抗原 ~ 吸収操作 抗原標準株をウサギで免疫し その血清を分離して 抗原性が類似する菌を大量に この血清に混合して 共通の抗原に対する抗体を除き 特定の抗原に対してのみ反応する血清を得る 8

9 スライド凝集反応試験 スライド凝集反応試験 ( 別名 : のせガラス凝集反応試験, ためし凝集反応テスト ) 菌塊を顕微鏡用スライドガラスに少量とり 抗血清を加え混合被検菌が疑われて菌である場合には 血清抗体が菌と反応して菌の大きな格子状になり塊を作る O 抗原は比較的簡単に判り易い H 抗原は特殊な培養が必要 ( 病原 ) 細菌検査の流れ 薬剤感受性試験 希釈法 ( 液体 ) ある微生物がある薬剤に対して感受性か耐性かを判断する試験細菌など培養可能な微生物については 検査する薬剤を一定の濃度になるよう加えた培地でその微生物が生育可能かどうかの検査 ( 生育阻止試験 ) を行う完全に生育阻止可能な最低の濃度を 最小発育阻止濃度 (minimal inhibitory concentration, MIC) として その微生物に対する薬剤の効果の指標とする MICの値が小さいほど薬剤の効果が高い MICが大きければ微生物の薬剤に対する抵抗性が高い ( 薬剤耐性 ) 9

10 希釈法 ( 平板 ) ディスク法 BD Sensi-Disc センシ ディスク薬剤感受性試験用 (Kirby-Bauer 法 ) 10

11 ( 病原 ) 細菌検査の流れ 遺伝学的検査 PCR 特定の DNA 部分を増幅させ 電気泳動によって泳動させ染色して特定の DNA が増幅したかどうかを確認 パルスフィールドゲル電気泳動 (PFGE) 制限酵素を用いて DNA を切断化し そのパターンによって解析個々に発生している集団食中毒や散発性の食中毒の原因が共通の食品を原因として発生している場合 菌を PFGE 法で解析することにより同一原因によって発生したものかどうか解析できる DNA 抽出 PCR による増幅電気泳動増幅を確認 11

12 全自動細菌検査装置リボプリンター TM システム ( 病原 ) 細菌検査 細菌のリボゾームRNA 遺伝子に見られる多型性を利用した遺伝子フィンガープリント解析 ( リボタイピング ) を自動で行う装置リボゾームRNAを指定する遺伝子であるrRNA 遺伝子 (rdna) 周辺領域は 細菌の種や亜種の間で少しづつ異なる多型性をもつ このrDNA 周辺領域の多型性を細菌個別の指紋 ( フィンガープリント ) のように利用して同定する ( リボタイピング ) 細菌のDNAを制限酵素で切断することによって生成するDNA 断片をリボゾームRNAのオペロンを用いたプローブで検出することにより細菌を同定します Listeria monocytogenesを分別する場合 40タイプまで識別可能デュポン社 12

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