学位論文内容の要旨 AnnexinA4isinvclvedinprolifbraticn,chemoresistance andmigraticnandinvasioninovarianclearcell adenocarcincmacells (AnnexinA4 は, 卵巣明細胞腺癌細胞株の増殖

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1 学位論文内容の要旨 AnnexinA4isinvolvedinprolifEration,chemoresistance andmigrationandilwasioninovarianclearcell adenccarcindmacells (AnnexinA4 は, 卵巣明細胞腺癌細胞株の増殖, 抗癌剤抵抗性, 運動能 浸潤能に関連している ) TaeMogami 最上多恵 Ybkohama Obstetric8andGynecology CityUniversityGraduateSchoo1 ofmedicine 横浜市立大学大学院医学研究科医科学専攻産婦人科学 ( DoctoralSupervisor;FumikiHirahara,Pro 企 ssor ( 指導教員 : 平原史樹教授 )

2 学位論文内容の要旨 AnnexinA4isinvclvedinprolifbraticn,chemoresistance andmigraticnandinvasioninovarianclearcell adenocarcincmacells (AnnexinA4 は, 卵巣明細胞腺癌細胞株の増殖, 抗癌剤抵抗性, 運動能 浸潤能に関連している ) 月 ournalbone 序論卵巣癌は, 先進国における婦人科臓器発生悪性腫瘍の中で死亡原因の第一位を占める疾患である (IARC 2008). 上皮性卵巣癌は, 漿液性腺癌, 明細胞腺癌, 類内膜癌, 粘液性腺癌の4 つの組織型に分類されるが, 日本を含めたアジアにおいて, 明細胞腺癌の発生が他地域に比較して多いことが指摘されている 卵巣明細胞腺癌は, 上皮性卵巣癌の標準的化学療法に抵抗性であり, 進行癌では他組織型に比較して予後不良である個別的な早期診断方法, 有効な治療法を確立すべく, 特に癌進展や化学療法抵抗性に関わ愚メカニズムの解明は急務である 我々の研究グループは,2 次元電気泳動と質量分析を行い, 卵巣明細胞腺癌におけるタンパク発現の網羅的解析を行った. この中で, 他の組織型に比較して特に明細胞腺癌で発現が上昇しているタンパクの一つとしてannexinA4を, 最初に見出し報告した (MoritaetaL2006) AnnexinA4は, 現在までに, 遺伝子発現解析からも, タンパク発現解析からも, 卵巣明細胞 腺癌での発現冗進が指摘されているタンパクである (Kimeta1.,20Q9;MarquezetaL,2005; Miaoetalo,2,09;SchwartzetaL,20,2;Tbyamaeta1.,2012;Tsuchiyaeta1.,2003; YHmaguchietaL,2010;ZmmetaL,2005). アネキシンは, カルシウムイオン結合部位を構成する共通のドメインをC 末端側に複数もったタンパク群で,N 末端側ドメインが他のタンパクとの相互作用を行い, その機能を発揮すると考えられている主な機能としては,endo-,exocytosis,membranescaEfblding,Ga2 signalingなどがあげられる AnnexinA4の個別の機能については不明な点が多い.Annexin A4は, 腎細胞癌, 胃癌, 子宮内膜癌, 卵巣明細胞腺癌などで発現の冗進が認められている. 強制発現によって細胞運動能 (Zimmermanneta1.,2004), 抗癌剤抵抗性 (HanetaL,2000; Kimeta1.,2009) の冗進を認めたとの報告が存在するが, 卵巣明細胞腺癌細胞株を用いた報告

3 は, 調べ得た限り存在しない また,annexinA4には2 次元電気泳動で異なる等電点を示す2 つのサブタイプが存在することを我々のグループが見出しているが, その成因は不明であ駄本研究に用いた細胞株では,OVTDKDが酸性型優位,OVI8Eが塩基性型優位のannexinA4 発現パターンである 以上より, 本研究 20 目的を, 予後不良な組織型である卵巣明細胞腺癌で高頻度に高発現しているannexinA4に着目し,annexinA4の卵巣明細胞腺癌の進展, 化学療法抵抗性との関連を調べることと,annexinA4の等電点の異なる2つのサブタイプの構造的, 機能的な差異を調べること, とした 実験材料と方法卵巣明細胞腺癌細胞株 OVTOKQOVISEを用いた ShorthailpinRNA(shRNA) を発現するプラスミドベクターを遺伝子導入し,annexinA4 恒常発現抑制株を作製した コントロールには, 非認識ランダム配列のshRNAを用いた 臨床検体は, 横浜市立大学の倫理委員会の承認を得て, 同意のある症例を対象とし, 手術による切除検体を用いた 細胞増殖能と抗癌剤感受性の検討は, 細胞のviabilityをWSIL1assayによって測定して行った 細胞運動能と浸潤能は, チヤンパー法によるtranswellassayで評価した AnnexinA4, LMP2,RHAIVmの発現はウエスタン ブロッテイングで調べた. 臨床検体におiナるannexm A4の発現は, 免疫組織染色を行い, 染色範囲と染色強度をそれぞれOから3の4 段階に分類してその合計値をIHDスコアとして評価した AnnexmA4のサブタイプは,2 次元電気泳動で分離し, ウエスタン プロッテイングで検出した. 翻訳後修飾による変化は, リン酸化の可能性をphosphataseで, カルシウムイオン結合をEmAで, リジン残基アセチル化をヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で処理することによって検討した 結果と考察臨床検体の免疫組織染色の結果, 本研究に用いた52 例全ての卵巣明細胞腺癌組織でELnnexm A4は高度に発現していた それに対し, 漿液性腺癌の93%(13 例 /14 例 ) ではannemnA4 陰性であった. 正常卵巣はannexinA4 陰性であった. 細胞増殖能は,0VTOKOでは,annexinA4の発現抑制によって著明に抑制され, 細胞の倍加時間は約 2.5 倍に延長した 0VISBでも同様の傾向を認めたが, コントロール株 3うちの1 つで, 同様の増殖抑制を認めた 抗癌剤感受性は,annexinA4 発現抑制によって,OVTOKGでカルボプラチン,OⅥSEでパクリタキセルに対して, 改善を示した. カルボプラチンに対するOW1OKOの50% 阻害濃度は, コントロール株に比較して40% 以下に低下した OVISEでは,2つのコントロール株で感受性が異なったために結論には至らなかった. 細胞運動能と浸潤能は,DVISEでのみ,annexinA4 発現抑制で有意に抑制された.almB 慈竹

4 A4 強制発現によってRHAMM(hyaluronan-mediatedmotilityreceptor),LAMP2 (lysosome-associatedmembraneprotem2) の発現冗進を認めたとの報告がある (LinetaL, 2012) RHAMMは, 細胞運動能に (FoleyetaL,2 口 12;HanetaL,1994),LAMP2は, 浸潤 転移に関連する (SarafianetaL,1998) 我々の細胞株のどちらも,RHAMM 発現はわずかであったが,LAn 匹 2はOwSEで相当量の発現を認め,annexinA4 発現抑制によってLAMP2 の発現は著明に低下した GVISEは, その運動能, 浸潤能をLAM[P2に依存しており,annexm A4がその発現量の調節に関連しているた鐘に,DVISIBで20みannexinA4 発現抑制によって運動能, 浸潤能の低下を認途たとも考えられた. サブタイプの成因を翻訳後修飾と仮説し, 薬剤処理後にサブタイプの発現比率が異なるかを調べたが, 変化を認釣なかった. さらに, 臨床検体でも2つのサブタイプが様々な比率で発現していることを確認し, これを病期, 予後, 化学療法奏効性や, 細胞内局在と関連するか調べたが, 有意な傾向は認めなかった. 本研究で我均は, 卵巣明細胞腺癌細胞株を用いた発現抑制系においても,aImexinA4は細胞増殖, 抗癌剤抵抗性, 運動能, 浸潤能に関与していることを明らかにした そして, 異なる等電点をもつ2つ2サブタイプが, 異なる細胞生理学的機能をもちうる可能性を提示した 今後のさらなるサブタイプ成因の解明は, 卵巣明細胞腺癌の診断 治療 予後鰯改善に寄与しうるannexinA4の さらなる理解を促すと考える.

5 引用文献 FoleyJRLamD,JiangH,LiaM,DheongN,McDevittTM,ZamanA,VVrightJR,and SavaniRC.(2,12).Tbll-likerGceptor2(TLR2),transfbrmillggrowth 歯 ctor-β,hyaluronan (HA),andreceptorfbrHA-mediatedmotnity(RHAMM)arerequiredfbrsurfactantprotein A-stimulatedmacrophagechemotaxis. Hmi 鰯 anr,287(44),374, HallCL,WangC,LangeLA,andTurleyEA (1994) Hyaluronanandthehyaluronan receptorrhanniipromotefbcaladhesionturnoverandtr 乱 nsienttyrosinekinaseactivitylej ClaZIHi 城 126(2), HanEKTahirSK,CherianS]BCollmsN,andNgSC.(2000).Modulationofpaclitaxel resistancebyannexinⅣinhumancancerceulmes 戯 薮鰯 c 83(1),83-88 IARC,qLOBOCAN2008, Cancerincidence,mortalityandprevalencevvorldwide. (accessedonnov22,2,3) ご l0bocanoiarc fir ノ KimA,EnomotonSeradaS,UedarllakahashmRipleyB,MiyatakemFUjitaM,LeeCM, MorimOtOK,FnjimotoM,KimuramandNakaTb(2009)EnhancedexpressionofAnnexin A4inclearcellcarclnomaoftheovaryanditsassociationvvithchemoresistancetc carboplatin 迩滅鰯 nubz:125(10), LinLL,HuangHC,andJuanHE(2012) RevealingthemoleculELrmechanismofg 釦 stri 旧 cancermarkerannexina4incancercellpronferationusingexonarrays 麺娠 a7(9), doi: /iiournalponeo MarquezlWImaggerlyKA,PattersonARLiuJ,BroaddusR,FrumovitzMAtkinsonEN, SmithDLHartmannL,FishmanD,BerchuckA,WhitakerR,BershensonDM,Hills9B, BastRCJ]GandLuKH (2005) Patternsofgeneexpressionindi 鍵 renthistotypesof epithelialovamancancercorrelatewiththoseinnormalf 患 lllopiantube,endometrium,and co1dnocz2i Ckz12 塵 r 丑霞 11(17),

6 MiaoYXjaiB,LiuL,YangY;andWanX(20,9) AnnexinlVisdiff rentiallyexpressedin clearcellcarcinomaoftheovaryb 迩逓薮馳な ecni 錘 ;19(9), MoritaA,MiyagiE, 蝿 sumitsuh,kawasakih,hirandh,andhiraharae(2006). ProteomicsearGhfbrpotentiaIdiammsticmarkersandtherapeutictargetsfbrovarianclear celladenocarcinoma2.h 鋸 n コ j 唾 6(21), ,. SarafianV>JadotM,FoidartJM,LetessDnJJ,VtmdenBruleRCastmnDvoXWVattiauxR, andconincksvv;(1898) ExpresslDnofLa エ np-1andlamp-2andtheirinteractiqnsvvith galectin-3inhumantumdrcells 迩鍼巴 l:zn 75(1), SchwartzDR,KardiaSL,SheddenKA,KuickR,MidlanidisG,TaylorJM,MisekDE,WUR, ZhaiY;DarrahDMReedH,EnensonLH,qiordanoTJ,FearonER,HanashSMandCho Im.(2002)Geneexpressionin11variancancBrrefIectsbothmorpholcgyandbiological behavi distinguishingclearcellfromotherpoor-prcgnosisovarlancarcinomaso 己 HmD 壁忍 asb62(16), IbyamaA,SuzukiA,ShimadamAokiC,AokiY;UminoY;NakamuraY;AokiD,andSato TlA (2012).Protecmiccharacterizationofovar1ancancersidentif31ingannexin-A4 phcsphoserinsaminctransfbrase`cenularretinoicacid-bindmgprotm2,andserpinb5ab histology-specificbiqmarkersoczyn 鍵 r81 国 i1103(4), UHsuchiyaA,SakamotoM,YasudaJ,ChumaM,ohtal:ChkiM,Y1asugilyTaketaniY;and HirohaShiSK2003).ExpressionprofninginQvarianclearcellcarcincma:identificationof hepatocytenuclearfnctor-1betaasamolecularmarkerandapdssiblemoleculartargetfbr therapyofovarianclearcellcarcinomaa 麺薮溌錨鰹 163(6), YiamaguchiK,MandaiM,OuramMatsumuraN,HamanishiJ,Baba']UMatsuiS,Murphy SKandKonishil.(2,1 印.Identificationofanovarianclearcencarcinomahenesignature thatrefiectsinherentdiseasebiclcgyandthecarcinogenicprocesses G7I 窓 aglefig29(12), ZimmermannU,BalabanovS,qiebelJ,T1ellerS,JunkerH,sChmollD,PrutzelC,ScharfC

7 KleistB,andVValtherR (2m4).IncreasedexpresBionandalteredlQcationofannexinlVin renalclearcellcarcmoma:apossibleroleintumqurdisseminatidno 塵鍾 c 巴 rle 鑓 209(1), ZornKKBonomem 喝 angil,chandramduliefv;awtreycg,gardnergj,barrettjc, BoydJ,andBirrerMJ 鰹 005) Geneexpressicnprofilesofserous,endometriDid,andclear cellsubtypesofovarianandendcmetlialcance 迅錘 mamcerj3 鴎 11(18), ,

8 論文目録 I 原著論文 ( 本人を筆頭とする原著論文 ) MogamimYbkctaN,Asai-SatoMYamadaR,KoizumeS,SakumaY;YbshiharaM, NakamuraY;TakanoY)HiraharaEMiyagiY;MiyagiE AnnexinA4isinvolvedin prolif 息 ration,chemoresistanceandmigrationandinvasioninovarianclearcell adenocarcinomacells 麺 DB 伽 & 8(11),doi:1Ul371/journaLponeDO8D359 Novemberll, Ⅱ 副論文 ( 原著論文の内容と関係のある論文 ) なし Ⅲ 参考論文 ( 原著論文の内容以外の論文 ) M gamit,haruyas,ybkdtan,suzukir$sukegawaa,asai-satom,miyagie,hiraharar Serumln -6fbrdiagnosisofDvarlancarcinomaassociatedwithdermatomyositis:twocase reportsandcharacteristicclinicopathclogicalfactors 晦 #DZmDUbr2fJ;1,83-87.April2012. 加藤沙絵, 最上多恵, 宇佐美友希, 倉澤健太郎, 平吹知雄, 白須和裕. 診断に苦慮した虫垂粘 液性嚢胞腺癌の卵巣転移の 1 例 互衣塵騨祷リノ 禅堂会 j 離宮 : 篭言 YX 迩方激会 ) 誌 ; 第 47 巻第 4 号,411 頁 ~416 頁. 平成 22 年 11 月発行

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