遺伝子改変コモンマーモセットを用いた 神経科学研究の進捗 Next-generation Neuroscience using the common marmoset 岡野栄之 ( 慶應義塾大学医学部 ) 佐々木えりか ( 実験動物中央研究所 ) 1

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1 遺伝子改変コモンマーモセットを用いた 神経科学研究の進捗 Next-generation Neuroscience using the common marmoset 岡野栄之 ( 慶應義塾大学医学部 ) 佐々木えりか ( 実験動物中央研究所 ) 1

2 薬物代謝の相違 サリドマイドによる催奇形性 なぜ霊長類の実験動物が必要なのか? 小型霊長類 マーモセット 病原体への感受性の相違 A 型肝炎ウイルス /EB ウイルス / 麻疹ウイルスへの感受性 (Poswillo et al., Nature 1972) (Gilbert, Dev Biol.) 発現遺伝子の相違 霊長類の脳で特異的に発現する遺伝子 霊長類皮質脊髄路特異的遺伝子 霊長類一次視覚野特異的遺伝子 Occ1 RBP アカゲザル 2

3 コモンマーモセットの実験動物としての利点 トランスジェニック動物の作製が可能 遺伝子改変動物が系統化された霊長類はマーモセットのみ (Sasaki et al., Nature 2009) ヒトに近縁であり類似性が高い 代謝経路 生理学的 解剖学的特徴がヒトと非常に類似している 年間 5 6 匹出産 一匹の雌の生涯産仔数 ヒトのサイトカイン ホルモンと交差性を示す繁殖効率が良く発生工学研究に適している 性成熟まで約 1 年半と他の霊長類に比べ短い 性別 年齢 体重を揃えて繰り返し実験が可能小型で飼育や実験上の取り扱いが容易 比較的簡単なトレーニングで飼育可能 自発運動量が多く 行動観察が比較的容易 実験動物用として目的繁殖されている ヒトにとって危険な人獣共通感染症の報告がない 遺伝的に均質 微生物学的な統御がされている 3

4 遺伝子改変マーモセットモデルを用いた疾患研究の戦略ー変性疾患モデルの前臨床治験への応用ー パーキンソン病モデルマーモセット 平成 年度においてライン化に成功し 前臨床試験に使用する個体数の確保が可能になった 新規治療法の開発 ES ips 細胞を用いた移植療法遺伝子治療新規治療薬の開発 ( 創薬研究との連携 ) ALS モデルマーモセット 治療薬の開発 平成 年度で作成中 治療薬候補の効果検証リルテック HGF キサリプロデンメチルコバラミンデクスプラミペキソールクルクミン VEGF など 新規治療薬の開発 ( 創薬研究との連携 ) 6

5 トランスジェニック マーモセット個体の作出に成功 Nature 翡翠 わかば ばん子 蛍 光 7

6 新しい遺伝子改変技術による研究の加速的展開 精神疾患 ( 統合失調症 ) 自閉症 ( レット症候群 結節性硬化症 ) 技術革新 ノックアウト ノックイン技術 ES ips 細胞技術 人工ヌクレアーゼ (ZFN,TALEN) 精子幹細胞技術 内在性遺伝子の破壊 改変が可能 ノックアウト ノックインモデルの開発 ( 霊長類では前人未踏 ) アルツハイマー病 世界初の TG マーモセット パーキンソン病 ALS モデル レンチウイルスを用いた TG マーモセットの作製 ランダムな遺伝子挿入のみ 挿入遺伝子サイズの制限 平成 年度 平成 年度 8 15

7 人工ヌクレアーゼ (ZFN, Talen) を用いたレット症候群モデルマーモセットの作製 Zinc Finger domains bind to target DNA Fok I nuclease digest the target DNA DNA repair Error recovery will occur by Non-Homologous End-Joining (NHEJ) Loss of gene function 9

8 トランスジェニックマーモセット作成技術の開発 : 次の課題 ES cells DNA 直接注入 レンチウイルスベクター注入 Blastocyst ES 細胞の Blastocyst への注入 Can introduce long DNA. Large amount of oocytes are needed Can apply to all stage of embryos. DNA size is limited up to 8.5kb. Can produce target gene Knock-out animals. ES cells with chimeric animal production ability are required. 1~2 年間で達成 2009 年 3 4 年で達成 17

9 脳プロ (H20-24 年度 ) で作製した TG マーモセットの有効利用 GFP トランスジェニックマーモセット (Founder: 2(4) 匹 F1: 10 匹 F2: 2 匹 ) 骨髄幹細胞研究マイクロキメリズム研究 パーキンソン病モデル (APKO mrfp) トランスジェニックマーモセット (Founder:2 匹 F1: 8 匹 ) F1 個体を用いたライブイメージング研究 (MRI, PET) 理研分子イメージングセンター 創薬研究 パーキンソン病モデル (APKO hko) トランスジェニックマーモセット ( Founder:4 匹 ) 今秋より繁殖開始 Founder 個体を用いたライブイメージング研究 (MRI, PET) 理研分子イメージングセンター 導入遺伝子の神経細胞特異的発現増強 Tet off トランスジェニックマーモセット (Founder 5 匹 ) 今秋より繁殖開始 脳科学研究 18

10 今後 5 年間の TG マーモセット普及のための計画 1 年目 2 年目 3 年目 4 年目 5 年目 新規 TG マーモセット作出 (5 系統以上 ) Tet-off マーモセットを用いた解析 パーキンソン病モデル APKO-hKO マーモセットを用いた解析 これまでに作出した TG マーモセットおよび作出技術の普及 ゲノム編集技術を用いた脳科学に有用な KO マーモセット作出 TG マーモセット作出技術の低コスト化 これまでに作出した TG マーモセット系統化 19

11 TG マーモセットおよび作出技術の開発および普及 脳プロ : 平成 年度他資金他資金他資金平成 29 年度まで 世界初の TG 霊長類の系統化に成功 代謝疾患ノックダウンマーモセット作出 世界初のノックアウトマーモセット作出代謝疾患免疫不全自閉症モデル 新規疾患モデルマーモセット作出アルツハイマーモデル脳神経発達解析 世界初の TG マーモセットの実用例を提示 TG マーモセット作製可能施設拡大基礎生物学研究所群馬大学など 産 学 官を含めた研究領域での TG マーモセットモデルの使用の拡大 日本マーモセット研究会を通じた普及製薬企業 2 社と既にTGマーモセット作製に関する共同研究開始 20

12 基盤整備ゲノム情報 BAC ライブラリー 抗原抗体作製 薬物代謝経路 新しい発生工学技術 日本マーモセット研究会会長 : 垣生園子事務局 : 実験動物中央研究所 情報交換 飼育 繁殖技術の共有神経科学だけでなく広くバイオメディカル全体をカバー TG には限定しない 神経科学免疫学循環器病学再生医学血液病学創薬 前臨床試験 カテゴリー E( 企業 ) 技術供与共同研究 当面 脳プロ (20 24 年度 ) で確立した 1.GFP マーモセット ( 移植研究など ) 2. パーキンソン病モデル (2 種類 ) ( 早期診断 早期治療法の開発 ) 3.Tet off マーモセット ( ウィルスベクターと組み合わせることで神経系の随所で強力な遺伝子導入の増強 ) の普及を図る カテゴリー A 実中研 / 慶應 (1000 頭 )TG 他 発生工学技術の基盤 高磁場 MRI など カテゴリー B( 中規模施設を保有 ) 自然科学研究機構基生研 (100 頭 ) ウィルスベクター 国立精神 神経医療研究センタ - 神経研究所 (300 頭 ) 放医研 (100 頭 )PET 神戸理研 (150 頭 )PET 和光理研 (100 頭 ) 共同研究 TG を作りに行く等 できた個体を持ち帰り繁殖 通って共同研究 カテゴリー C( より小規模な施設を保有 ) 群馬大 (60 頭 ) など多数 名古屋市立大 (24 頭 ) 広島大 (30 頭 ) カテゴリー D ( 自前の施設を持たないユーザー ) 東北大学 ( 神経感覚器病態学講座 眼科学分野 ) 大阪大学 ( マーモセットセンター設立予定 ) まずはこれらの動物の特性を共同研究して徹底的に解析 使用する施設 研究者が増加することで個体の価格の適正化を見込む 京大霊長研 (150 頭 ) 認知行動バッテリー 浜松医大 (100 頭 ) 系統の育種 サンプルを持ち帰り解析 ( 放医研 理研和光 浜松医大が B に加わるかは未確認 ) 東京大学医科学研究所 国立病院機構東京医療センター など多数 ( 従来 マウスを主に使ってきた研究者が参入しやすいようにする ) *( 注 ) 実中研で完成したTG 作製技術の技術移転が完了した研究機関 基生研は大学共同利用機関の枠組みで大学等の研究者を支援 *( 注 ) 実中研で完成したTG 作製技術の技術移転が設備 人材などの面で可能な施設 * 様々な外部資金の獲得を共同して目指す *DからCへの移行をサポートする 21

13 TG マーモセット普及母体としての実中研の組織体制 包括責任者 ( 副所長 ) 基盤技術グループフルタイム 6 名アルバイト 4 名アカデミアの動物実験サポートマーモセット飼育 管理 動物実験技術の提供等 遺伝子改変マーモセット作出研究責任者 TG マーモセット作出グループフルタイム 6 名アルバイト 3 名 TG マーモセット作出 新規遺伝子改変 (KO/KI/KD) マーモセット開発グループ研究者 4 名技術員 5 名新技術確立 日本マーモセット研究会マーモセットを用いた研究 新たに確立された研究ツール 研究技術等の情報共有 TG マーモセット普及グループ製薬企業などにマーモセットニーズを調査 ユーザーニーズ調査コミッティー アカデミアを中心に TG マーモセット等のニーズを調査 アカデミアユーザ - 製薬等企業 22

14 実験動物中央研究所 共同研究拠点を担う実中研の準備状況 世界最大規模のマーモセット飼育 研究施設 ( 飼育頭数 :1000 頭 ) 欧米ガイドラインに準じた最高水準の飼育運営体制世界初の霊長類トランスジェニック動物系統の作出に成功 TGマーモセット作製施設遺伝子解析設備二光子顕微鏡 MRI 画像診断設備共通利用目的の実験空間 TGマーモセット作製班 ES/iPS 細胞樹立 培養技術飼育 実験動物技術員の教育動物生命倫理の厳正管理 教育 技術情報の提供マーモセット試料の提供 系統維持飼育の支援 共同研究実験の実施 23

15 遺伝子改変マーモセット作成拠点と協力機関 ( 案 ) 実中研が拠点となり 国内の拠点と協力して TG マーモセット作成 実中研 / 慶應 既に実中研から技術移転を受け TG マーモセット作出技術を有している機関 今後の TG 作出の要請の増加に伴い これらの機関でも共同研究 TG マーモセットを作出する 基生研 広島大学 国立精神 神経医療研究センタ - 神経研究所 群馬大学 作成した TG マーモセットの繁殖および普及の協力 浜松医大 理化学研究所 (BSI) 理化学研究所 ( 分子イメージング ) 現在 TG マーモセット作出可能な施設 TG マーモセット作出可能な施設を有する研究所 24

16 5 年後に自立的に機能するための戦略 1. 脳プロ ( 平成 年度 ) で作出したTG( 遺伝子改変 ) マーモセットを用いた研究の実績を挙げる TGマーモセットの有用性の実証 2. 複数の TG 作出可能機関設立 基生研 広島大学 国立精神 神経医療研究センタ - 神経研究所 群馬大学等 いずれも既に技術移転済み 3.TG 繁殖 配布機関設立 浜松医大 理化学研究所 BSI 理化学研究所分子イメージング等 既に 100 頭を超える飼育および繁殖施設を保有 4. 遺伝子改変マーモセット作出コスト削減 発生工学技術の効率化 作業効率化 出生率の上昇などによるコスト削減 5. バイオメディカル全般の遺伝子改変モデルマーモセット作出 肥満 糖尿病 免疫不全モデル等の作成は既に開始している新規遺伝子改変技術の確立により新たな難治性疾患モデルの作出を可能にする 6. 非遺伝子改変疾患モデル脊髄損傷 心筋梗塞 パーキンソン病モデル等の普及 汎用化免疫寛容モデル等の開発 25

17 TG マーモセット作出の効率化 ネットワークカメラ PLanex CS-WMV04N 生まれてきた個体の生存率を上げることで作出効率を上げる 外部 ( 自宅や携帯 ) から監視 駆けつけ 出産のべ数 駆けつけ回数 問題なし ( 親保育 ) 問題あり ( 人工保育 ) 問題あり のうち生存 / 死亡 なし 17 (24 匹 ) - 12 出産数 (16 匹 ) 5 出産数 (3 匹 ) 生存 2 匹死亡 5 匹 あり 7 (9 匹 ) 7 3 出産数 (5 匹 ) 4 出産数 (4 匹 ) 生存 4 匹死亡 0 匹 27

18 TG マーモセット作出のコストダウン計画 世界初の GFP TG マーモセット (2009) コスト パーキンソン病モデル (2010) パーキンソン病モデル (2011) Tet off (2011) 最適な蛍光タンパク質マーカーの選択非外科的胚移植法の確立 Founder and F1 発生工学技術および作業の効率化 発生工学技術の効率化および作業の効率化 ノウハウの蓄積などにより GFP マーモセット作出コストの 2/3 程度まで削減可能 28

19 遺伝子改変マーモセット技術の新展開 神経精神疾患モデル動物の作成とそれを用いた前臨床研究 創薬研究とその普及 脳科学に役に立つTGマーモセットTet Offラインの開発とそれを用いた神経回路遺伝学の実施 人工核酸ヌクレアーゼを用いたノックイン, ノックアウト技術の開発 ( 本年度中 ) TGマーモセット作出の効率化とコストダウン TGマーモセット作成技術の普及とuserの爆発的拡大 29

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