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1 Genome Editing

2 コラム ゲノム編集の最新技術概要 ゲノム編集の最新技術概要 真下知士准教授 Tomoji Mashimo 大阪大学大学院医学系研究科附属共同研ゲノム編集センター / 附属動物実験施設 Genome Editing Research & Development Center/ Institute of Experimental Animal Sciences, Graduate School of Medicine, Osaka University ゲノム編集とは 大阪大学ゲノム編集センター ( 真下研 ) の皆様前列中央が真下先生 2012 年,CRISPR-Cas9 が登場して以来, ゲノム編集の利用が広がっている ガイド RNA(gRNA) を作成して Cas9 タンパク質と一緒に細胞や受精卵に導入することで, 簡単に遺伝子を改変できる 基礎研究だけでなく, 農作物や畜産動物の品種改良にも利用されており, 再生医療やゲノム編集治療などへの利用が広がっている 新しいゲノム編集ツールが次々と登場! 近年,CRISPR-Cas9 に代わる新しいゲノム編集ツールが開発されている ( 図 1) レンサ球菌由来 CRISPR-Cas9 は PAM と呼ばれる GG 配列を認識するが, 新しいツール Cas12a(Cpf1) はAA 配列を認識してゲノム編集を行うことができる ジンクフィンガーヌクレアーゼ (ZFN) の特許権が来年 2019 年に切れることから, 再び注目を集めている Cas9 の DNA 切断を不活化した dead Cas9(dCas9) は,DNA 配列に結合するが, 切断しない この dcas9 に転写 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です2 活性化因子を結合した CRISPRa(activation), 抑制因子を結合した CRISPRi(interference) により, 遺伝子の発現を調節できる また,DNA( 脱 ) メチル化酵素を結合した エピゲノム編集 も行われている Base Editor は dcas9 に塩基置換酵素を結合して,DNA を切断せずに一塩基変異 (SNP) の編集ができる DNA を切らないためオフターゲット効果も削減でき, ゲノム編集治療への応用が期待されている DNA ではなく RNA を認識して,RNA を切断する CRISPR も登場している CRISPR-Cas13a(C2c2) は, 遺伝子のメッセンジャー RNA を分解することで, ゲノム編集治療に利用できる また, 微量なウイルスの検出や分解にも利用できる さらに,dCas13 に RNA 置換酵素を結合させた RNA 編集も可能になっている ( 文献 1) 図 1 さまざまなゲノム編集ツールとその利用目的

3 コラム ゲノム編集の最新技術概要 コンディショナルノックアウトも可能! CRISPR-Cas9 の登場により,ES 細胞を使わなくても遺伝子改変マウスが簡単に作れるようになった 我々は, マイクロインジェクション法の代わりにエレクトロポレーション法を利用することにより, 一度にたくさんの受精卵に CRISPR を導入する 超簡単ゲノム編集 を開発した ( 文献 2) また, 株式会社バイオダイナミクス研究所と共同して, ニッキング酵素を利用した 長鎖一本鎖 DNA(lssDNA) 作製法を開発した ( 文献 3,p.22~23) さらに,CRISPR-Cas9,lssDNA, エレクトロポレーション法を同時に利用することで, 効率的にコンディショナルマウスを作出できる CLICK 法を開発した ( 文献 4) CRISPR-Cas9 を使うことで, コンディショナルマウスやラットが簡単に作製できるようになった ( 図 2) CLICK:CRISPR with lssdna inducing conditional knockout alleles 図 2 エレクトロポレーション法により, マウス受精卵に CRISPR-Cas9,, 長鎖一本鎖 DNA(lssDNA) を導入することで, loxp 配列を 2 箇所同時にノックインできる コンディショナルマウスを F0 世代で作製することも可能である 特許申請ゲノム編集方法出願人 : 大阪大学 ( 真下知士, 宮坂佳樹 ) 出願日 : 平成 28 年 11 月 28 日出願番号 : ゲノム編集治療に向けて ゲノム編集を使ったヒト遺伝子治療の開発競争が繰り広げられている 初めてのゲノム編集治療は,ZFN を用いた米国エイズ患者の T 細胞における HIV レセプターのノックアウトである イギリスでは, 急性リンパ性白血病の小児に TALEN により CAR-T 療法が実施された これらは, 免疫細胞を体外に取り出す ex vivo 治療にあたる 米国では, ムコ多糖症患者の体内に直接 ZFN を投与する in vivo ゲノム編集も実施されている 日本でもモデル動物を使った治療法開発が進められているが, 基本特許が欧米に抑えられているため, 多くの企業は開発競争に後れを取っている 日本初の新しいゲノム編集技術の開発が, 待たれている 文献 1.Cox D. et al., Science, 358 (6366): 1019~27, Kaneko T. et al., Scientific Reports, 4: 6382, Yoshimi K. et al., Nature Communications, 7: 10431, Miyasaka Y. et al., BMC Genomics, 19 (1 ): 318, 2018 日本ゲノム編集学会第 3 回大会 会期 :2018 年 6 月 18 日 ( 月 )~6 月 20 日 ( 水 ) 会場 : 広島国際会議場 会場にお越しの際はフナコシ展示ブースに是非お立ち寄り下さい! 出展期間 :2018 年 6 月 19 日 ( 火 )~20 日 ( 水 ) ブース番号 :21 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です3

4 連載企画 フロンティアーズ FRONTIERS Vol.31 The Delivery Experts Polyplus-Transfection 社はフランスに本拠を置く, トランスフェクション試薬のメーカーです 核酸導入分野で 20 年以上にわたり培ってきたノウハウに基づき, 様々な導入物質 / 導入対象に対応する製品ラインナップを揃えています 2002 年には ISO 9001 を取得しており, 一部の製品は世界中で臨床試験にも使用されています 今回は同社の Genome Editing Project Leader である Valérie Toussaint 氏に, 同社の新製品 jetcrispr についてお話を伺いました 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です4 トランスフェクションはゲノム編集成功の鍵 CRISPR/Cas9 を用いたゲノム編集には,Cas9 タンパク質と の細胞への導入が必要です ゲノム編集を成功させるためにはこれらを細胞内のターゲットへ確実に届けることが重要です つまり, トランスフェクションは鍵となるステップといえます ゲノム編集に適した試薬を選ぶことが重要です 哺乳動物細胞の場合,Cas9 タンパク質と の導入には 3 種類のアプローチがあり, 私たちは各手法に適した製品を取りそろえています ( 右図 ) 1DNA :Cas9 タンパク質, をコードしたプラスミドの導入 jetprime(p.11) 2RNA :Cas9 をコードした mrna と の導入 jetmessenger(p.10) 3RNP( リボ核タンパク質 ) : 精製 Cas9 タンパク質と の複合体の導入 jetcrispr(p.5) 研究室で広く用いられているのは Cas9 と をプラスミド DNA で導入する手法 1ですが, トランスフェクションが困難な初代細胞やがん細胞には不向きです メリットが多い,RNP を直接導入するゲノム編集 近年, ゲノム編集研究のトレンドは,Cas9 タンパク質を と同時に導入する手法 3にシフトしてきました タンパク質での導入は, オフターゲットの低減など多くのメリットがあるアプローチです 短時間で効率よく編集できる転写 翻訳が不要, 活性 Cas9- 複合体が細胞に直接送達されるオフターゲットが最小限に抑えられるトランスフェクション後, 迅速に分解される (Cas9 クリアランスが速い ) 困難な細胞にも簡単に導入可能 スクリーニングが簡単細胞生存率が高い ゲノム編集に最適化されたトランスフェクション試薬 jetcrispr 私たちが新たに開発したトランスフェクション試薬 jetcrispr は,RNP トランスフェクション (Cas9 タンパク質と の同時導入 ) のための製品です 0 より高いゲノム編集効率を実現するため, 私たちは ela 細胞 0 jetcrispr 0. l well と Cas9 タンパク質の濃度や存在比率, 50 (9 ェ プ ート ) Cas9 タンパク質配列についても検証 最適化を行 0 0 いました ( 例 : 右図 ) 0 jetcrispr との併用によりベストなゲノム編集効率 10 0 が得られる SpCas9 Nuclease も開発, 販売してい RNP 5 nm RNP 10 nm RNP 0 nm ます Cas9/ 複合体の導入これら 2 製品を組み合わせて使用することで, 他社製品よりも高いゲノム編集効率を実現できます INDEL jetcrispr の詳細は p.5 をご覧下さい! :Cas9=1:1 の条件で, トランスフェクションが成功しゲノム編集による変異導入が生じた細胞の割合 ( ゲノム編集効率,INDEL%) を数値化した

5 タンパク質で導入 Cas9 タンパク質と の導入専用トランスフェクション試薬 jetcrispr jetcrispr と PolyPlus 社で最適化された SpCas9 を併用することで, ゲノム編集効率が上昇します 他社トランスフェクション試薬との比較 他社 Cas9 タンパク質との比較 IN EL 70 jetcrispr(0.3μl) 60 量の 社トランスフェクション試薬 A549 細胞 E 293 細胞 IN EL 60 E 293 細胞 Pol Plus 社 SpCas9 社製品 A 社製品 社製品 C 縦軸 (INDEL%): ゲノム編集を行った細胞由来のゲノム DNA から編集部位について PCR を行い,T7 endonuclease 処理後のバンドパターンから, ゲノム編集に成功した細胞の割合 ( ゲノム編集効率 ) を算出した 高い細胞生存率 迅速で確実なゲノム編集導入後も細胞の生存率と形状を維持します 70 E 293 細胞 60 E -293 細胞 A549 細胞 IN EL 処理細胞 RNP30 n 0 jetcrispr を用いたトランスフェクション 48 時間後の細胞形態観察 jetcrispr を用いたゲノム編集効率 接着細胞, 浮遊細胞問わず, 様々な細胞で使用できます 血清や抗生物質の存在下でも使用できます 通常のトランスフェクション法に加え,Reverse Transfection 法で迅速な導入を行うことも可能です 使用回数 :1.5 ml 当たり最大 1,250 回分 (24 ウェルプレートの場合 )/300 回分 (6 ウェルプレートの場合 ) 品 名 メーカー商品コード 包装 / 価格 ( ) jetcrispr, RNP Transfection Reagent PPU ml / 11,000 PPU ml / 65,000 PPU ml / 105,000 SpCas9 Nuclease PPU μg / 39,000 配列 :NLS-SpCas9-NLS, 濃度 :Solution at 10 µg/µl, 分子量 :162 kda 無償サンプル品あります! マークの製品は, 無償サンプルのご用意があります ご希望の方は当社テクニカルサポート ( 試薬担当 ) までお問い合わせ下さい バンドルキャンペーン! 期間 :~2018 年 7 月 31 日キャンペーン期間限定で, トランスフェクション試薬 jetcrispr(0.75 ml) と SpCas9 Nuclease(100 μg) のお得なセットを販売いたします [ メーカー :PPU] セット品商品コード ( キャンペーン期間限定 ) 包装 キャンペーン価格 set 65,000 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です5

6 ガイドRNA合成 ゲノム編集効率に優れた sgrna を簡単に作製 CRISPRevolution sgrna 合成サービス SpCas9 用に最適化された 合成サービスです 標的配列 (17~23 塩基 ) をご指定いただくだけで, 最大 90% の高いゲノム編集効率を持つ一本鎖 (sgrna) を合成しお届けします ココがすごい! CRISPR/Cas9 を用いてゲノム編集を行う際に, を直接トランスフェクション / インジェクションする方法があります は in vitro transcription(ivt) でプラスミドから調製できますが, キットが高価な上に作業の手間がかかります Synthego 社の CRISPRevolution sgrna は, 手間がかからず安定した高い編集効率を持つ完全合成の です プラスミド配列のデザイン コンストラクト作製 シークエンス プラスミド精製の操作 / 試薬は不要です の作製方法 CRISPRevolution sgrna プラスミド in vitro Transcription(IVT) 発現プラスミドを設計する プライマーを設計して 配列を標的配列を選択し,sgRNA を注文する プラスミドのスクリーニング シークエン納品後すぐに使用可能! ス 精製など導入用プラスミドの作製に 1~2 週間必要 PCR で増幅する の IVT を行い, 精製するなど導入用 の作製に 1~3 日必要 編集効率 最大 90% 中 ~ 高 様々 品質 非常に高い 様々 低い ( 不純物があり, 不一致もみられる ) 初代細胞および幹細胞への効率 非常に良い 悪い 悪い オフターゲット効果 非常に低い 様々 ( ゲノム内へ DNA 混入の可能性あり ) 様々 (IVT 用酵素のエラーの可能性あり ) 安定かつ高い編集効率を持つ crrna, tracrrna のアニーリングが不要で高効率かつ短時間での操作が可能 100% DNA フリーのため外来 DNA の挿入を防止 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です6 使用例 IVT 1 sgrna 1 IVT 2 sgrna 2 RNP 複合体を作ることで in vivo でも安定 配列中の 80 mer の Synthego scaffold は SpCas9 用に最適化済み IVT 3 sgrna HEK293T 細胞における sgrna の編集効率と一貫性の比較 3 種類の異なるターゲット遺伝子に対して, 本製品と IVT でゲノム編集を行った どの遺伝子においても IVT で作製した に比べ, 本製品は高効率かつ安定した挿入または欠失 (Indel) を確認できた CRISPRevolution sgrna お問い合わせ先 : 試薬 TEL: in vitro Transcription (IVT) :reagent@funakoshi.co.jp 製品到着後すぐにトランスフェクション可能 Web 上でオフターゲットが最小限の を簡単にデザイン可能 (p.7 参照 ) 1 b ladder DNA Cas9 (control) DNA Cas9 2 8 bp lineari ed p C bp lineari ed p C19 cut ith Cas bp sgrna を用いたプラスミド切断実験直線状プラスミドを CRISPRevolution sgrna で切断した 標的 DNA は 95.8% の効率で切断された RNA 純度の比較合成 AAVS1 遺伝子 100 nt に対する について, 質量分析 (MS) を行った ( 左 ):CRISPRevolution sgrna 全長配列による単一のピークが見られる ( 右 ):IVT-derived guide RNA 複数のピークが見られる 不純物はオフターゲットの原因となる お問い合わせ先 : TEL: :jutaku@funakoshi.co.jp

7 ガイドRNA合成 ゲノム編集が困難な初代細胞や幹細胞などには Chemically Modified sgrna がおすすめ 関連製品 :Chemically Modified sgrna Chemically Modified sgrna は, 初代細胞や幹細胞, K562 細胞やがん細胞株, 造血幹細胞由来細胞といったゲノム編集が難しい細胞にも高効率に安定した塩基の挿入 / 欠損 (Indel formation) を起こすことができます の 5 と 3 末端 RNA 残基に 2 -O-methyl analogs と 3 phospho-rothioate inter-nucleotide を結合し ており, 細胞内での RNA 分解を抑制しています Chemically Modified sgrna の使用例 高効率にトランスジェニックマウスの作製が可能 Synthego 社の sgrna は完全合成されているため,IVT で E on eletion Rate A erage uccess Knock in 作製した sgrna とは違い 100% DNA-free です これにより, 高い効率でノックアウト / ノックイン動物モデルの作製 が可能となりました 同一の 配列であっても,Synthego 社 sgrna ではエクソン切断効率が 2 倍異なることが報告されていま 45 す また, ノックイン効率も IVT に比べ 3 倍も上昇しました 11 Commercial IVT sgrna Synthego Modified sgrna IVT sgrna Synthego sgrna Un-edited (Unstained) Un-edited (Stained) 他社 2-piece modified crrna : tracrrna Synthego 社 chemically modified sgrna ご注文方法 / 価格 sgrna の標的配列 (17~23 mer) をご指定下さい Synthego 社のサイト Knockout Guide Designer ( 右記参照 ) より, 簡単にデザインできます 例.5 -AAUUUCACAGCUGCACAUA+Synthego Scaffold-3 フナコシ Web にある専用注文書に必要事項をご記入の上, 電子メー 品 キット内容 CRISPRevolution sgrna(3 nmol) TE buffer Nuclease-free water オプション品 ( 単品購入不可, 詳細はお問い合わせ下さい ) Cas9 Protein,Annealing buffer,tris-edta buffer ルに添付して当社 特注品担当までお送り下さい 名 メーカー商品コード 包装 / 価格 ( ) sgrna Kit SGO SGO kit / 59,000 SGO SGO-0001-CM Chemically Modified * 1 kit / 89,000 * 初代培養細胞や ips/es 細胞などの幹細胞において高い編集効率が得られる 91.0% Knockout Guide Designer CD3(TCR) のノックアウト CD3 タンパク質の発現抑制を目的として,TCR α 遺伝子をターゲットとした と Cas9 タンパク質を CD34+ヒト造血幹細胞にエレクトロポレーションで導入した トランスフェクションを行ってから 7 日後にノックアウト効率をフローサイトメトリーで測定した Synthego 社ウェブサイト上で遺伝子ノックアウト用配列 を簡単にデザインできます design.synthego.com 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です7

8 ＲＮＡで導入 フナコシニュース 2018 年 6 月 1 日号 No Cas9 または Cre リコンビナーゼの 高発現用 mrna sgrna 特異性 切断活性評価キット GenCrispr sgrna Screening Kit ゲノム上の標的配列に Cas9 ヌクレアーゼを効率良くリ クルートでき かつ切断効率の高い sgrna を 簡単迅 速にスクリーニングできるキットです Memo Genome Editing mrna Cas9 または Cre リコンビナーゼの mrna の 3 末端に poly A tail を有する 安定性の高い非免疫原性の修 飾 mrna です それぞれ野生型 Cas9 または核局在化 配列融合 Cre リコンビナーゼを高発現します single sgrna スクリーニング CRISPR/Cas9 システムでゲノム編集を行うとき Cas9 ヌクレアーゼ を標的に正しく導く sgrna の設計が重要です しかし 標的に関する 全ての情報から sgrna を設計したとしても そこからベストな特異性 Ca s9 導入 と切断効率が得られるとは限りません このため あらかじめ配列の異 を選択することが重要です します 特 長 細胞での実験を行う前に in vitro で sgrna 機能の有効性 ー 編集 確認 Cas9 発現用 mrna は と混合し トランスフェ クション試薬とインキュベートした後 細胞へ添加して導入 gui der NA ドナ 特 長 なる複数の sgrna を設計し 特異性 切断活性がベストとなる sgrna 細胞質内で直接タンパク質を発現するため 核への取り込み は不要です を確認することができます キット中にはポジティブコントロールの sgrna と基質 DNA 非分裂細胞に用いることができます が含まれています プロモーター非依存的にタンパク質を発現します 本キットで得られた in vitro での切断効率が in vivo での活性と一 From mrna to Protein 致しないことがあります mrna キット内容 その 他 8 核への取り込みなし GenCrispr Cas9 nuclease バッファー ポジティブコントロール sgrna ポジティブコントロール基質 RNase-free Water 複合体 形成 品 翻訳 ゲノムへの組み込みなし 核 トランスフェクション しにくい細胞に最適 名 メーカー 商品コード CRISPR/Cas9 の標的となる配列領域を増幅する 2. Cas9 による切断反応 3. 反応物の分析 1 アガロースゲル電気泳動で分析する メーカー 商品コード 20 μg / 42, μg / 105, μg / 42, μg / 105,000 関連製品 名 包装 / 価格 GenCrispr sgrna Screening Kit GSC L GSC L 包装 / 価格 CRISPR-Cas9 Encoding mrna OZB MRNA31-20 OZB MRNA Cre Recombinase Encoding mrna OZB MRNA32-20 OZB MRNA DNA 基質の調製 1 kit / 1 kit / 36,000 86,000 Cas9 発現 mrna や 用のトランスフェクション試 薬です RmesFect CRISPR と混合した RNA は分解から保護 され 効率良く細胞に導入されます 品 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です 各記事右上の Web ページ番号を入力 検索 各製品の詳細は フナコシ Web のタブから かんたんに検索できます 名 メーカー 商品コード ココを選択 SEARCH タンパク質 mrna の リリース エンド ソーム 操作方法概略 品 エンドサイ トーシス 包装 / 価格 RmesFect CRISPR OZB RMC μl / 45,000 Memo Cre リコンビナーゼとは バクテリオファージ P1 由来の Type Ⅰトポイソメラーゼで loxp 部位 間の DNA の組換えを触媒します 組換え産物は loxp 部位の場所と相 対配向に依存します お問い合わせ先 試薬 TEL つの loxp 部位間の DNA の切除 loxp 部位を含む DNA 分子の融合 loxp 部位間の DNA の反転 FAX reagent@funakoshi.co.jp

9 RNAで導入 野生型 / 変異型 Cas9 発現 mrna と 作製キット Transfection-ready Cas9 SmartNuclease mrna & grna Vector Kit 8121 野生型 Cas9 またはニッカーゼ型 Cas9(D10A) と を,RNA の状態で細胞などのホストに導入するシステムです 挿入 欠失により遺伝子をノックアウトしたい場合に有用です 相同組換えによるノックアウト / ノックインには, 別途 HR ベクターが必要です 詳細は p.20~21 をご覧下さい 野生型 / 変異型 Cas9 については,p.13 をご覧下さい grna 作製キットで作製した と Cas9SmartNucleasemRNA を細胞へ同時にトランスフェクションして, ゲノム編集を行います RNA の状態で細胞にトランスフェクションするため, 免疫原性が低く, タンパク質発現までの時間が短く, 速やかにゲノム編集が行われます ES 細胞にも適しています トランスフェクション効率のチェックに有用な GFP/RFP タグ付き Cas9mRNA もあります 製品ラインナップ Transfection-ready Cas9 SmartNuclease mrna [ メーカー :SBI] 用途 Cas9 タグ 商品コード 包装 価格 ( ) なし CAS500A-1 20μg 67,000 野生型 (hspcas9wt) GFP CAS530G-1 10μg 59,000 真核生物用 RFP CAS531R-1 10μg 59,000 なし CAS504A-1 20μg 67,000 変異型 (hspcas9,d10a,nickase) GFP CAS534G-1 10μg 59,000 RFP CAS535R-1 10μg 59,000 原核生物用 hspcas9 なし CAS502A-1 20μg 67,000 ポジティブコントロール用 mrna 品 名 メーカー商品コード 包装 / 価格 ( ) mrnaexpress Positive Control mrna, Transfection-ready SBI MR700A-2 GFP 2 10μg/ 55,000 SBI MR800A-2 RFP 2 10μg/ 55,000 受注発注品 grna 作製キット 任意の (crrna-tracrrna キメラ転写産物 ) を組み込んだ T7gRNACloningVector により,PCR 用または invitro 転写用のテンプレートとして, 高効率に を作製できます 品名メーカー商品コード包装 / 価格 ( ) Linearized T7 grna SmartNuclease Vector Kit SBI CAS510A-1 1kit/ 112,000 grna クローニングベクター作製キット T7 grna SmartNuclease Synthesis Kit SBI CAS510A-KIT 1kit/ 131,000 grna クローニングベクター作製キット (#CAS510A-1) に invitro 転写を行うための試薬が付属したキット Cas9 Protein and T7 grna SmartNuclease Synthesis Kit SBI CAS400A-KIT 1kit/ 183,000 grna クローニングベクター作製キット (#CAS510A-1) に組換え Cas9 タンパク質 (#CAS400A-1) が付属したキット コントロール用 grna 品名メーカー商品コード包装 / 価格 ( ) Cas9 SmartNuclease AAVS1 grna, Transfection-ready SBI CAS520A-1 10μg/ 49,000 AAVS1 に対する grna 使用例 s Cas9 RNA AA grna Do o 1 Cas9 1 AA grna e o Do o GFPFluorescence BrightFieldPhase 上図 :Cas9mRNA と AAVS1 に対する と GFP を組み込むためのベクターを細胞に導入した 下図 :Cas9 および AAVS1 に対する を発現する All-in-one ベクターと, GFP を組み込むためのベクターを, 細胞に導入した mrna の直接導入により All-in-one ベクター使用時と同等の組換えが生じた Kan R Kan R grna C o i g a d odu io e o CA 510A 1 p C ri Cas9 a Nu ease AA 1 grna CA 520A 1 p C ri T7Promoter grnacloningsite grnasca old T7Promoter AAVS1gRNA grnasca old 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です9

10 RNAで導入 mrna 専用のトランスフェクション試薬 jetmessenger 神経細胞, 幹細胞, 免疫細胞, 線維芽細胞など, 特にトランスフェクションが困難な細胞にも高い効率で mrna を導入可能です CRISPR/Cas9 によるゲノム編集,iPS 細胞の作製, 幹細胞分化および免疫療法研究に最適です mrna を用いることで,DNA に比べてトランスフェクション効率が向上します ゲノムに組み込まれるリスクはありません 使用例 ラ ト皮 ニ ーロン ト HepG2 細胞 etmessenger mrna 他社製品 mrna マ ス幹細胞 egfpmrna をさまざまな細胞にトランスフェクションし,24 時間後にフローサイトメトリーにより導入効率を評価した 操作方法概略 本製品 (egfpmrna) 他社製品 ( 2K/eGFP プラスミド DNA) 本製品または他社製品を用いて, 各細胞に egfpmrna をトランスフェクションし,48 時間後に明視野および蛍光顕微鏡により解析した etmessenger/mrna 他社製品 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です10 egfpmrna または egfp 発現プラスミドをトランスフェクションし,24 時間後にフローサイトメトリーにより導入効率を評価した 各種細胞へのトランスフェクション効率 分類細胞名トランスフェクション効率 脳細胞 上皮細胞 線維芽細胞 U-87MG >90% Cortexneurons 40~60% Caco-2 >90% MCF-7 >90% MDCK 40~60% BJ >90% Primaryfibroblasts 70~90% IMR-90 >90% CPRE2 >90% MEF 60~80% 肝細胞 HepG2 >90% リンパ球 Jurkat 40~60% K562 40~60% マクロファージ Macrophages 50~70% 単球 幹細胞 Primarymonocytes 10~30% THP-1 80~90% hmsc >90% mes 50~70% 品 名 メーカー商品コード 包装 / 価格 ( ) jetmessenger PPU ml 1kit/ 16,000 PPU ml 1kit/ 88,000 PPU ml 1kit/ 148,000 無償サンプル品あります! マークの製品は, 小容量の無償サンプルをご用意しています ご希望の方は当社テクニカルサポート ( 試薬担当 ) までお問い合わせ下さい

11 プラスミドで導入 Cas9 プラスミド導入に使用実績があります jetprime Kit ポリマーを用いた, 非リポソーム型の DNA / sirna 用トランスフェクション試薬です 幹細胞をはじめ,HeLa,HEK293,CHO 細胞などの接着細胞に, 高い効率で導入できます 4799 導入操作が非常に簡便です また, 導入後の培地交換は不要です 本試薬 1.5 ml で DNA を導入する場合,24 ウェルプレートの細胞では 1,500 回,6 ウェルプレートの細胞では 375 回導入できます DNA と sirna の co-transfection にも使用できます 抗生物質や血清存在下でも使用できます 使用例 Empt ector ゲノム編集での使用実績 ウイルスの作製にも使用できます 1. 導入実績のある細胞 細胞の種類 細胞株 細胞の種類 細胞株 B16-F10 COS-7 BNLCl2 HEK293 * 線維芽細胞 CaCO2 MRC-5 CHO-K1 * NIH-3T3 HCT-116 骨髄細胞 Raw HeLa * 筋芽細胞 C2C12 上皮細胞 HepG2 神経細胞 SH-SY5Y Huh-7 肝細胞初代細胞 MCF-7 メラノサイト MCF-10A MDCK PC-3 *HeLa,HEK293,CHO 細胞に使用した場合,70~90% の効率で導入できます Vero 操作方法概略 DNA / sirna を jetprime buffer で希釈する 2. jetprime reagent を加える 秒間ボルテックスした後, 室温で 10 分間インキュベートする の混合液をプレートに加える 5. 24~72 時間インキュベートする 5. jetprime を用いて HeLa 細胞に と Cas9 を共発現するプラスミドを導入し, DNA 複製に関わる遺伝子 (PCNA または CDC45) をノックアウトした マーカー選択後, 培養 7 日目の細胞形態を観察したところ, 細胞が平たくなり, 核のサイズが大きくなっていた 遺伝子ノックアウトが生じたためと考えられる 細胞毒性が低い jetprime 他社製品他社製品 jetprime または他社製品を用いて HeLa 細胞にトランスフェクションを行い,24 時間後に位相差顕微鏡で細胞を観察した 導入効率が高い jetprime 他社製品 本製品または他社製品を用いて,24 ウェルプレートで培養した各種細胞株に 1 ウェル当たり 0.5 μg のプラスミドベクターを導入し, フローサイトメーターにより導入効率を測定した 品 名 メーカー商品コード 包装 / 価格 ( ) jetprime Kit PPU ml 1 kit / 13,000 PPU ml 1 kit / 60,000 PPU ml 1 kit / 95,000 無償サンプル品あります! マークの製品は, 小容量の無償サンプルをご用意しています ご希望の方は当社テクニカルサポート ( 試薬担当 ) までお問い合わせ下さい 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です11

12 プラスミドで導入 目的遺伝子に対する が組み込み済み! Gene Knockout Kit via CRISPR / Cas 構築済みの Cas9 / 発現ベクターと相同組換え用のベクターのセットです 19,000 種類以上の標的遺伝子に対するキットを取りそろえています マーカー遺伝子によるノックアウト細胞のスクリーニングに有用です CRISPR により ORF の 5 末端周辺を切断します 異なる配列の がクローニングされたベクターが 2 種類含まれ, 確実に目的遺伝子をノックアウトできます GFP と Puro によってセレクションできます 包装 / 価格 1kit/ 364,000 受注発注品 [ メーカー :ORI] 操作方法概略 キット内容 目的遺伝子に対する と Cas9 を 1 つのベクターで発現する pcas-guide ベクター 2 種類 (#KN2xxxxxG1,#KN2xxxxxG2) ホモロジーアームが組み込まれた GFP-puro ベクター (#KN2xxxxxD) ネガティブスクランブルコントロールベクター (#GE100003) a ge se o ed i Cas uide edesig ed do o e a e NA o o e o ou o L A F Lo p uro Lo p R A Chro oso e o o ogous Repair Edited Chro oso e F Lo p uro Lo p 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です12 ターゲット配列がクローニング済みの pcas-guide ベクターと HomologousArms と FunctionalCassette を含むテンプレート DNA をコトランスフェクション 使用例 CRISPR/Cas9 によりターゲット遺伝子がノックアウトされ,GFP( 外来プロモーター連結 ) とピューロマイシン (PGK プロモーター連結 ) がノックインされる 細胞を~20 日間継代 希釈培養し, 選択を行う ATG5 humangeneknockoutkitviacrispr(#kn210563) を用いてバリデーションを行った 製品の検索方法 / ご注文方法 選抜前の細胞からゲノム DNA を抽出し,ATG5 配列から GFP 配列を増幅するプライマーを用いて PCR を行った 1 フナコシ Web の に を入力 GFP-puroCassette の導入により,ATG5 がノックアウトされ GFP がノックインしたことが分かる 2ご注文の際には, 上記ラインナップ検索で表示される品名, メーカー (ORI), 商品コード, 包装 (1kit), 数量をお知らせ下さい

13 プラスミドで導入 線状化されているため, ライゲーションが容易な All-in-one ベクターです と Cas9 を 1 つのベクターで発現できます PrecisionX Cas9 SmartNuclease All-in-one Vectors 相同組換えによるノックアウト / ノックインには, 別途 HR ベクターが必要です 詳細は p.20~21 をご覧下さい および Cas9 タンパク質は 1 つの CRISPR ベクターから発現できるため, 細胞への導入が必要となるCRISPR ベクターは 1 種類のみです 変異型 Cas9(D10A) はニッカーゼとして機能し, オフターゲット効果を低減した相同組換えによるゲノム編集が行えます トランスフェクション効率のチェック用に GFP/RFP 配列が挿入されているベクター (TaggedVector) もあります 製品ラインナップ PrecisionX T7 Cas9 grna Linearized SmartNuclease Vector(10 reactions) [ メーカー :SBI] Cas9 プロモーター タグ 商品コード 包装 価格 ( ) EF1-T7-hspCas9-H1-gRNA なし CAS700A-1 131,000 EF1-T7-hspCas9-T2A-GFP-H1-gRNA EF1 GFP CAS700G-1 136,000 EF1-T7-hspCas9-T2A-RFP-H1-gRNA RFP CAS701R-1 136,000 CAG-T7-hspCas9-H1-gRNA なし CAS720A-1 131,000 CAG-T7-hspCas9-T2A-GFP-H1-gRNA 野生型 (hspcas9wt) CAG GFP CAS720G-1 1kit 136,000 CAG-T7-hspCas9-T2A-RFP-H1-gRNA RFP CAS721R-1 136,000 CMV-T7-hspCas9-H1-gRNA なし CAS740A-1 131,000 CMV-T7-hspCas9-T2A-GFP-H1-gRNA CMV GFP CAS740G-1 136,000 CMV-T7-hspCas9-T2A-RFP-H1-gRNA RFP CAS741R-1 136,000 Cas9 Nickase: grna Linearized SmartNickase Vector(10 reactions) [ メーカー :SBI] Cas9 プロモーター タグ 商品コード 包装 価格 ( ) EF1-T7-hspCas9-nickase-H1-gRNA なし CAS750A-1 131,000 EF1-T7-hspCas9-nickase-T2A-GFP-H1-gRNA EF1 GFP CAS750G-1 136,000 EF1-T7-hspCas9-nickase-T2A-RFP-H1-gRNA RFP CAS751R-1 136,000 CAG-T7-hspCas9-nickase-H1-gRNA 変異型 なし CAS770A-1 131,000 CAG-T7-hspCas9-nickase-T2A-GFP-H1-gRNA (hspcas9,d10a, CAG GFP CAS770G-1 1kit 136,000 CAG-T7-hspCas9-nickase-T2A-RFP-H1-gRNA Nickase) RFP CAS771R-1 136,000 CMV-T7-hspCas9-nickase-H1-gRNA なし CAS790A-1 131,000 CMV-T7-hspCas9-nickase-T2A-GFP-H1-gRNA CMV GFP CAS790G-1 136,000 CMV-T7-hspCas9-nickase-T2A-RFP-H1-gRNA RFP CAS791R-1 136,000 Cas9 Double Mutant: grna Linearized SmartNuclease Vector Kit(10 reactions) NullNuclease(D10A/H840A の 2 重変異体 ) を発現するベクターです ヌクレアーゼ活性およびニッカーゼ活性が完全に失わ れていますが, 標的配列への結合能を有し, オフターゲット効果の少ない転写リプレッサーとして機能すると考えられています [ メーカー :SBI] Cas9 プロモーター タグ 商品コード 包装 価格 ( ) EF1-hspCas9-DM-H1-gRNA 変異型 (NullNuclease) EF1 なし CAS805A-1 1kit 131,000 Memo 変異型 Cas9(D10A) とは Cas9 タンパク質の D10A アミノ酸変異により, ヌクレアーゼ活性が不活性化し, ニッカーゼ活性を持つようになります Cas9(D10A) は, 野生型 Cas9 のように DNA 二本鎖を切断せず, 一本鎖のみを切断しニックを入れます そのため, 二本鎖切断による DNA 修復機構 NHEJ( 非相同末端結合 ) が起こらず, 標的領域以外での遺伝子欠失 挿入やオフターゲット効果を抑制できます また, ペアのニックにより, 細胞株におけるオフターゲット効果を 50~1,500 倍まで減少した例もあります 5 3 CCN GGN 3 grna 1 TAGCCGTAACGAATGGCAAT-5 ATCGGCATTGCTTACCGTTA Cas9 D10A Nickase TAGCCGTAACGAATGGCAAT CGTAAGCTTACGCGATGCAC Cas9 D10A Nickase GCATTCGAATGCGCTACGTG 5 -CGTAAGCTTACGCGATGCAC grna 2 3 Targetingsite 標的部位のアンチセンス鎖に対する grna1 とセンス鎖に対する grna2 を作製し, Cas9(D10A) を用いてペアでニックを入れ, ゲノム編集の効率を向上させる NGG NCC 3 5 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です13

14 プラスミドで導入 複数の を同時発現させるベクターの構築キット PrecisionX Multiplex grna Cloning Kit 直線化した (grna) ベクターまたは Cas9 All-in-one ベクターに, 一度に複数の をクローニングできるキットです 最大 8 つの をクローニングできます 1 回のトランスフェクションで複数遺伝子をノックアウトするコンストラクトを作製できる, ユニークなキットです 必要な 量は最小限で済みます ほとんどの ベクターに対応します 使用例 複数のゲノム領域における同時編集 A. B. C. D. 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です14 Multiplex grna Cloning Kit には,H1 and U6 プロモーターのブロックが含まれ, 簡単にマルチ grna カセットを作製できます Step1 作製しようとする grna を含む領域を増幅できるプライマーと, キット由来の scaffold-promoter block を PCR で結合し, 両方の grna を含む PCR 産物を作製する Step 2 PCR 産物を fusion reaction mix, 線状発現ベクターと結合させる 品名メーカー商品コード包装 / 価格 ( ) PrecisionX Multiplex grna Cloning Kit SBI CAS9-GRNA-KIT 10 tests 1 kit / 67,000 関連製品 参考文献 Tsui-Ting Ho, et al., Nucleic Acids Research,(2014). Multiplex grna Cloning Kit と Cas9 発現 All-in-one ベクターとのセット (10 reactions) [ メーカー :SBI] Cas9 プロモーター タグ 商品コード 包装 価格 ( ) EF1-T7-hspCas9-H1-gRNA EF1 なし CAS700A-KIT 187,000 CAG-T7-hspCas9-H1-gRNA 野生型 (hspcas9 wt) CAG なし CAS720A-KIT 1 kit 187,000 CMV-T7-hspCas9-H1-gRNA CMV なし CAS740A-KIT 187,000 EF1-T7-hspCas9-nickase-H1-gRNA 変異型 EF1 なし CAS750A-KIT 187,000 CAG-T7-hspCas9-nickase-H1-gRNA (hspcas9,d10a, CAG なし CAS770A-KIT 1 kit 187,000 CMV-T7-hspCas9-nickase-H1-gRNA Nickase) CMV なし CAS790A-KIT 187,000 Cas9 All-in-one ベクターについては,p.13 をご覧下さい (A) Multiplex grna Cloning Kit( 本製品 ) と All-in-one Cas9 SmartNickase Vector(p.13) を用いて quad-plex grna を作製し,CMV-GFP-T2A-RFP カセットを安定発現する細胞から GFP- T2A-RFP 領域 (1,260 bp) を除去した (B) GFP 配列の 5 末端と RFP 配列の 3 末端で切断が生じるよう,4 種類の を Cas9 ベクターにクローニングした (C) PCR で GFP と RFP 遺伝子領域を増幅し, 電気泳動でバンドを確認した (lane 1) ベクター導入なし,1,600 bp (lane 2) ベクター導入あり,340 bp (D) GFP と RFP 蛍光の検出ベクターを導入した細胞で蛍光が減少した

15 63308 最適デザインの と Cas9 を組み込んだレンチウイルス発現ベクター transedit CRISPR-Cas9 Lentiviral Reagents 最適なデザインの と Cas9 nuclease を, レンチウイルス発現ベクターの中に組み込み, バクテリアのグリセロールストック, またはウイルス粒子の形でお手元にお届けします ベクターの種類 All-in-one ベクター と Cas9 が 1 つのベクターから発現します 単一マーカーで選択可能です RNAplusCas9expressionvectors(pCLIP-All) CM LTR 6 grna EFS CM Blast R P2A Cas9 Puro R s 3 LTR レンチウイルスベクターに, ヒト / マウス / ラットのいずれかの遺伝子をターゲットにした をクローニングします transomic 独自のアルゴリズムにより最適な 配列をデザインし, 上位 3 種類の をクローニングしたレンチベクターを納品します オフターゲットを最低限に抑えます ウイルスベクターで導入 製品例 trfp 品名メーカー商品コード包装 / 価格 ( ) transedit Mouse CRISPR Cas9 Nuclease plus grna All-In-One Target Gene Set (pclip-all-efs-blast)-bacterial Glycerol Stock TOT CAMS1001-EFS-Blast 1set/ 160,000 2 ベクターシステム Cas9 と の発現を, それぞれ別のベクターで行います 系に合わせた最適化や Cas9 の選択も可能です grnaexpressionvectors(pclip-grna) Blast R 製品構成 ( 上位 3 種 ) ネガティブコントロール (non-targetingcontrolgrna) OMNIfectTransfectionReagent( バクテリア グリセロール ストック製品のみ ) CM LTR 6 grna Puro R 品名メーカー商品コード包装 / 価格 ( ) transedit Mouse CRISPR grna Target Gene Set (pclip-grna-efs-blast)-bacterial Glycerol Stock TOT CCMS1001-EFS-Blast 1set/ 137,000 transedit CRISPR Cas9 Nuclease Expression Vector (pclip-cas9-nuclease-efs-puro) TOT TECC1001 1vial/ 115,000 EFS s trfp Cas9expressionvectors (pclip-cas9nuclease,pclip-cas9nickase) 3 LTR 2 種類の が組み込まれたベクター (DualgRNA vector) もあります 製品例 ご注文方法 / 価格 詳細は当社 特注品担当までお問い合わせ下さい transomic 社 Web にアクセスし, 目的遺伝子 プロモーター レポーター 希望納品形態などを確認の上, 専用の注文書に必要事項をご記入下さい 詳細はフナコシ Web(Web ページ番号 :63308) をご覧頂くか, 当社 特注品担当までお問い合わせ下さい [ メーカー :TOT] お問い合わせはこちらまで! 特注品担当 Tel Fax : jutaku@funakoshi.co.jp お問い合わせ先 : TEL: FAX: :jutaku@funakoshi.co.jp 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です15

16 ウイルスベクターで導入 と野生型 / 変異型 Cas9 をレンチウイルスベクターで導入します Lentiviral CRISPR / Cas9 System トランスフェクションの難しい細胞でノックアウトしたい場合や,Cas9 安定発現細胞株を樹立し, 複数のノックアウト細胞を効率良く作製したい場合に有用です 製品ラインナップ 1Cas9 と を同時に発現させる All-in-one レンチウイルスベクター [ メーカー :SBI] Cas9 プロモーターマーカー商品コード包装価格 ( ) 野生型 (hspcas9wt) 発現用 変異型 (hspcas9(d10a) mut,nickase) 発現用 CMV Puro CASLV300PA-1 131,000 MSCV Puro CASLV320PA-1 131,000 1kit CMV Puro CASLV400PA-1 131,000 MSCV Puro CASLV420PA-1 131,000 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です16 2Cas9 と をそれぞれ発現させるレンチウイルスベクター [ メーカー :SBI] Cas9 プロモーター マーカー 商品コード 包装 価格 ( ) CMV Puro CASLV100PA-1 10μg 112,000 野生型 MSCV Puro CASLV120PA-1 10μg 112,000 (hspcas9wt) 発現用 CMV EF1a copgfp CASLV105PA-1 10μg 112,000 MSCV EF1a copgfp CASLV125PA-1 10μg 112,000 CMV Puro CASLV200PA-1 10μg 112,000 変異型 (hspcas9(d10a) MSCV Puro CASLV220PA-1 10μg 112,000 mut,nickase) 発現用 CMV EF1a copgfp CASLV205PA-1 10μg 112,000 MSCV EF1a copgfp CASLV225PA-1 10μg 112,000 EF1a H1 BlasticidinR CASLV500PA-B 1kit 112,000 EF1a H1 copgfp CASLV501PA-G 1kit 112,000 発現用 EF1a H1 RFP CASLV502PA-R 1kit 112,000 EF1a U6 BlasticidinR CASLV510PA-B 1kit 112,000 EF1a U6 copgfp CASLV511PA-G 1kit 112,000 EF1a U6 RFP CASLV512PA-R 1kit 112,000 3パッケージング済みの Cas9 発現用レンチウイルス [ メーカー :SBI] Cas9 プロモーター マーカー 商品コード 包装 価格 ( ) CMV Puro CASLV100VA-1 112,000 野生型 MSCV Puro CASLV120VA-1 112,000 (hspcas9wt) 発現用 CMV EF1a copgfp CASLV105VA-1 112,000 MSCV EF1a copgfp CASLV125VA-1 112, μl CMV Puro CASLV200VA-1 112,000 変異型 (hspcas9(d10a) MSCV Puro CASLV220VA-1 112,000 mut,nickase) 発現用 CMV EF1a copgfp CASLV205VA-1 112,000 MSCV EF1a copgfp CASLV225VA-1 112,000! ウイルスベクター関連製品ご購入時のご注意 Cas9 発現用レンチウイルス (#CASLV***VA) はウイルスベクター関連製品のため, 購入時にご使用者確認書が必要です ご注文の際は, フナコシ Web( pdf/viral.pdf) にある ウイルスベクター関連製品ご使用者確認書 に必要事項をご記入の上, 販売店担当者にお渡し下さい なお, 製品をご使用の際には 遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律 ( カルタヘナ法 ) および所属組織における安全管理規定に従い, しかるべき施設で実験を行って下さい 詳細は文部科学省ライフサイエンス課の Web をご覧下さい 関連製品 レンチウイルスやレトロウイルスのポリエチレングリコール (PEG) 沈殿による濃縮を簡便に行える試薬 本製品 100ml で,400ml のウイルス産生細胞の培養上清からレンチウイルスを濃縮できます 品名メーカー商品コード包装 / 価格 ( ) Virus Precipitation Solution, PEG-it SBI LV810A-1 100ml/ 56,000 SBI LV825A-1 250ml/ 121,000

17 ウイルスベクターで導入 SaCas9 を発現するアデノ随伴ウイルスベクター AAV Cas9 SmartNuclease Plasmid 強力な組換えアデノ随伴ウイルス (raav) 技術によって,in vivo で Cas9 を導入するためのベクターです SaCas9 は, 広く使用されている SpCas9 よりもサイズが小さいながら SpCas9 と同様の効率を持ち,rAAV ベクターへの挿入が可能です 本製品に, ウイルス粒子を産生するためのパッケージングベクターは含まれていません HR Targeting Vector については,p.20~21 をご覧下さい Memo AAV による における問題点と SaCas9 の発見 AAV は分裂 非分裂細胞の両方に遺伝子を導入し, 長期間発現させる能力があるため, 組換え体 AAV(rAAV) は遺伝子治療やゲノム工学研究におけるベクターとして頻繁に使用されます しかし,rAAV による in vivo における遺伝子導入を行う際には, 最も広く使用される Cas9 である Streptococcus pyogenes Cas9 gene(spcas9) のサイズが問題となっていました この問題を克服するために,Ran らは, よりサイズの小さい Cas9 遺伝子オーソログの特性を解析し,Staphylococcus aureus 由来の Cas9 (SaCas9) を発見しました SaCas9 はサイズが SpCas9 より 1 kb 程度短いにも関わらず,SpCas9 と同様の効率を持ち,rAAV ベクターへの挿入が可能です SaCas9 は デザインが異なります 参考文献 Ran F. A., et al., Nature, 520: 186~191 (2015). 製品ラインナップ All-in-one ベクター SaCas9 と を一つのベクターで発現できます 10 reactions Check it out! ワンステップで raav 粒子を濃縮する試薬 AAVanced Concentration Reagent ウイルス産生細胞の培養上清を回収し, 遠心 (1,500 g) するだけで raav を濃縮できます 従来の raav 粒子の濃縮方法とは異なり, 細胞の溶解および CsCl 密度勾配超遠心, クロマトグラフィー, またはアフィニティーマトリックスカラムへの結合などは不要です 形質導入する細胞への毒性はありません 品名メーカー商品コード包装 / 価格 ( ) AAVanced Concentration Reagent SBI AAV100A ml / 78,000 SBI AAV110A ml / 157,000 品名メーカー商品コード包装 / 価格 ( ) Linearized All-in-one SmartNuclease AAV Plasmid (EF1α-hsaCas9-U6-gRNA(SA)) SBI CASAAV100PA-1 1 kit / 131,000 SaCas9 と を別々に導入 品名メーカー商品コード包装 / 価格 ( ) Cas9 Expression Vector for the Two Vector AAV SmartNuclease System (EF1α-hsaCas9 AAV Plasmid) SBI CASAAV200PA-1 10 μg / 112,000 grna Expression Vector for the Two Vector AAV SmartNuclease System, Linearized AAV Plasmid (EF1α-RFP-U6-gRNA(SA)) SBI CASAAV300PA-1 1 kit / 112, AAVanced raav-2 Injected into Mouse Brain [ メーカー :SBI] 本製品を用いて濃縮した AAV-2(ITR-PGK-GFP-ITR)1.5 μl を 6 週齢 C57 マウスの海馬および中脳に定位注射した 3 週間後マウスを PFA で灌流固定し,40 μm の脳切片を作成して GFP の蛍光を観察した 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です17

18 Cas9 安定発現細胞株 Cas9 タンパク質を長期間安定に発現するヒトおよびマウスの細胞株です Tet-on システムにより Cas9 タンパク質の発現量を制御できる細胞と, 定常発現する細胞があります 使用例 293T Cas9 安定発現 HEK293 細胞株 ヒトゲノムにおける Safe Harbor である AAVS1 遺伝子座に hspcas9 を組み込んだ,Cas9 の安定発現 HEK293 細胞株です 下記ベクター (#CAS620A-1) を用いて,HEK293 細胞株に Cas9 遺伝子をノックインして作製した安定発現細胞株です Cells/vial Dox: 品 名 f-cas9 175kDa メーカー商品コード包装 / 価格 ( ) Stable Cas9 HEK293 Cell Line with Cas9 Stably Integrated at AAVS1 Safe Harbor Locus SBI CAS630A-1 1vial/ 187,000 Tubulin 関連製品 Tet-on システムによる Cas9 タンパク質の誘導 (#CLHKCAS902) Doxycyclin の培地添加によって, 任意のタイミングで Cas9 タンパク質を発現誘導できる 製品ラインナップ Tet-on 発現誘導型細胞 #GE620A-KIT(p.30) に含まれるベクターです 品名メーカー商品コード包装 / 価格 ( ) hspcas9 AAVS1 Safe Harbor Knock-in Donor (AAVS1-SA-puro-EF1-hspCas9) SBI CAS620A-1 10μg/ 191,000 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です18 品 名 メーカー商品コード 包装 / 価格 ( ) Cas9 Stable Cell Line for CRISPR, Inducible PRC CLHKCAS T 1vial/ 300,000 PRC CLHKCAS901 C2C12 1vial/ 300,000 PRC CLHKCAS906 HeLa 1vial/ 300,000 PRC CLHKCAS910 MCF-7 1vial/ 300,000 PRC CLHKCAS913 MIA PaCa-2 1vial/ 300,000 PRC CLHKCAS905 U2OS 1vial/ 300,000 GFP-Foxp3 and Cas9 Combo Cell Line PRC CLHKCOMBO1 293T 1vial/ 300,000 Tet-On システムを利用した安定発現株のご購入には, 事前に Tet システムライセンス確認 同意書へのご記入, ご提出が必要です フナコシ Web(Web ページ番号 :63737) の価格表に掲載のライセンス同意書に必要事項をご記入の上, 販売店担当者にお渡し下さい 詳細は, 当社 特注品担当までお問い合わせ下さい 定常発現細胞 品 名! ご購入時のご注意 メーカー商品コード 包装 / 価格 ( ) Cas9 Stable Cell Line for CRISPR, Non-Inducible PRC CLHKCAS T 1vial/ 300,000 PRC CLHKCAS904 3T3-L1 1vial/ 300,000 PRC CLHKCAS903 NIH 3T3 1vial/ 300,000 Checkitout! L-755,507 ヒト ips 細胞で,CRISPR/Cas9 による 相同組換え修復の効率を促進します OH O H N OH 参考文献 PinderJ.,et.al., Nucleardomain knock-in screenfortheevaluationand identificationofsmallmoleculeenhancersofcrispr-based genomeediting. NucleicAcidsRes.,43:9379~9392(2015). [PMID: ] 品名メーカー商品コード包装 / 価格 ( ) L-755,507 RSD 2197/10 10mg/ 46,000 RSD 2197/50 50mg/ 191,000 β 3 -アドレナリンレセプターのパーシャルアゴニスト ips 細胞において,CRISPR/Cas9 による相同組換え修復 (HDR) 効率を 2~3 倍 (largefragment) または最大 9 倍 ( 点変異の場合 ) に向上させる 化学式 :C 30 H 40 N 4 O 6 S,M.W.:584.73, 純度 :>98%,CASNo.: O N H S O [ メーカー :RSD] N H NH O

19 ベクター 組み込んだ配列を痕跡を残さず除去できます PiggyBac Gene Editing HR Targeting Vector CRISPR/Cas9 を併用し, ゲノムの特定箇所の修正や, 変異の導入を行うための相同組換え用ベクターです 導入したセレクションマーカーカセットは,PiggyBac Transposase により痕跡を残さずに除去できます 任意の変異を導入した相同領域を MCS1/MCS2 にクローニングし相同組換えを起こすことで, 特定の箇所への点変異の導入や修正などが可能となります 選択マーカー (Puro 耐性および GFP 蛍光 ) により, 相同組換えを起こした細胞株を選択できます ホストゲノムに導入した選択マーカーは,Transposase 発現ベクターを発現させることにより, ほとんど痕跡を残さずに除去で 7922 きます マーカーの除去の際にはチミジンキナーゼ (TK) を利用したセレクションが可能です PiggyBac HR Vector 品名メーカー商品コード包装 / 価格 ( ) piggybac HR Vector(5'MCS-EF1-GFP-Puro-TK-3'MCS) SBI PBHR100A-1 10μg/ 212,000 ゲノムに導入した目的遺伝子の除去には, 別途 Excision-onlyPiggyBacTransposaseExpressionVector(#PB220PA-1) が必要です p.32 をご覧下さい! ご購入時のご注意 営利団体 企業 (CommercialEntity) にご所属のお客様が 9 ヶ月を越えて本製品を使用される場合, ライセンス契約が必要です 原理 キ ンイントロンマーカーカセットの除去 Excision-only PiggyBac Transposase (#PB220PA-1, p.32) を用いたシームレスな遺伝子編集例 Step1: Cas9 は に相補的な部分で DSB( 二本鎖切断 ) を起こす DSB はイントロン内で生じるようにする Step2: DNA 修復機構が DSB にリクルートされる この時,DSB の付近と相同な配列を持つ HR ベクターが存在すると,NHEJ( 非相同末端結合 ) ではなく HR( 相同組換え ) が生じやすい HR ベクターのホモロジーアームが相同組換えによりゲノムに組み込まれる Step3: マーカーカセットの除去 Excision-onlyPiggyBacTransposase が 5 /3 PiggyBac TR(TerminalRepeat) の間にある配列を完全に除去する 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です19

20 7942 ベクター ノックイン / ノックアウト / 編集用ベクター PrecisionX HR Targeting Vectors タンパク質コード領域およびタンパク質非コード領域を標的とした, ノックアウト / ノックイン用ベクターです CRISPR/Cas9 と組み合わせて使用します Memo Cas9 のみの導入による二本鎖切断の結果, 遺伝子ノックアウトを生じさせることは可能ですが, より効果的かつ正確なゲノム編集を行うため,SBI 社では HRtargetingvectors(HR ベクター ) の併用をオススメしています HR ベクターはポジティブまたはネガティブ選択に必要なマーカーを含むため, 変異導入に成功した細胞の選択が可能です HR ベクターは最大 6~8kb の ORF(openreadingframe) を含み, 遺伝子ノックインやタグ付けに利用できます Basic HR Targeting Vector ノックアウトノックイン編集タグ付け ベーシックベクター目的遺伝子をホストゲノムに組み込むためのターゲッティングベクターです 発現カセットを任意にカスタマイズできます cori,sac, pn, r, si,bg BamHI,Sa,Sp,Hind bai, ot BstBI,Sac CS Po A CS 3856bp A R Re ication 品名メーカー商品コード包装 / 価格 ( ) Basic HR Targeting Vector for Gene Knock-In/Out [MCS1-LoxP-MCS2-MCS3-pA-LoxP-MCS4] SBI HR100PA-1 10μg/ 147,000 Gene Tagging HR Targeting Vector ノックアウトノックイン編集タグ付け 細胞内での目的遺伝子産物の局在や動態の解析に最適です 選択マーカーにより, 相同組換えを起こした細胞株を選択できます GFP タグベクター 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です20 cori C a, e, o,bstbi cori GFP+ ルシフェラーゼタグベクター cori IRES-GFP 共発現ベクター cori,sac, r, si G P Po A T2A G P Po A IR S G P Po A ba, ot ba A R ba, ot 1 A R A R 1 R P T2A Puro Po A 7672bp 1 R P T2A Puro Po A 7565bp Re ication R P T2A Puro Po A 7735bp Re ication Re ication BamHI,Sa CS BamHI,Sp G P Po A 1 R P T2A H gro Po A CS G P T2A uci Po A A R A R bp Re ication R P T2A Puro Po A 8556bp Re ication BamHI,Sp CS BamHI,Sa CS BamHI,Sp CS GFP-Fusion HR Targeting Vector [GFP-pA-LoxP-EF1α-RFP-T2A-Puro-pA-LoxP-MCS] SBI HR120PA-1 10μg/ 161,000 GFP-Fusion HR Targeting Vector [GFP-pA-LoxP-EF1a-RFP-T2A-Hygro-pA-LoxP-MCS] SBI HR220PA-1 10μg/ 161,000 T2A-GFP Co-Expression HR Targeting Vector [T2A-GFP-pA-LoxP-EF1α-RFP-T2A-Puro-pA-LoxP-MCS] SBI HR130PA-1 10μg/ 161,000 GFP-T2A-Luciferase Co-Expression HR Targeting Vector [GFP-T2A-Luc-pA-LoxP-EF1α-RFP-T2A-Puro-pA-LoxP-MCS] SBI HR150PA-1 10μg/ 161,000 IRES-GFP Co-Expression HR Targeting Vector [IRES-GFP-pA-LoxP-MCS1-EF1α-RFP-T2A-Puro-pA-LoxP-MCS2] SBI HR180PA-1 10μg/ 161,000

21 Gene Knock-out HR Targeting Vector ノックアウトノックイン編集タグ付け デュアルマーカー HR ベクター RI,S I,K I, I, s I,Bg II I, I C 1 1 R -T2A- uro- o A 5767 B HI,S hi C 2 品 名 メーカー商品コード包装 / 価格 ( ) Gene Knock-Out HR Targeting Vector [MCS1-EF1α-RFP-T2A-Puro-pA-MCS2] SBI HR110PA-1 10μg/ 161,000 A R Re ication S I,Bs GI,Bs I B si,m I, I,S I,Ag I C 1 1 G -T2A- uro- 2A-TK- o A 6 03 C 2 Gene Knock-Out HR Targeting Vector with TK selection [MCS1-LoxP-EF1α-GFP-T2A-Puro-P2A-hsvTK-pA-LoxP-MCS2] SBI HR210PA-1 10μg/ 181,000 Kan R Re ication RI,S I,K I, I, s I,Bg II B HI,S I,S hi I, I C 1 1 G -T2A- uro- o A 5840 C 2 Gene Knock-Out HR Targeting Vector [MCS1-EF1a-GFP-T2A-Puro-pA-MCS2] SBI HR410PA-1 10μg/ 161,000 A R Re ication S I,K I, I, s I,Bg II I, I C 1 1 R -T2A-H gro- o A 61 3 B HI,S I,S hi C 2 Gene Knock-Out HR Targeting Vector [MCS1-EF1a-RFP-T2A-Hygro-pA-MCS2] SBI HR510PA-1 10μg/ 161,000 A R Re ication OnTarget Gene Knock-out HR Targeting Vector ノックアウト ノックイン 編集 タグ付け ネガティブセレクション HR ベクター 3 MCS の外に PGK-hsvTK カセットが挿入されたベクターです ネガティブセレクションにより, 目的の相同組換え以外で プラスミドがゲノムに導入された細胞を排除できます Bs GI,Bs C 1 Bs GI,Bs C 1 Bs GI,Bs C Kan R Kan R G -T2A- uro- o A 7402 R -T2A-H gro- o A Kan R 7744 asticidin- o A 6385 Re ication Re ication Re ication B s,m,,s C 2 GK s TK M,,S C 2 GK s TK B s,m,,s C 2 GK s TK PrecisionX OnTarget Gene Knock-out HR Targeting Vector [MCS1-EF1α-GFP-T2A-Puro-pA-MCS2-PGK-hsvTK] SBI HR700PA-1 10μg/ 181,000 PrecisionX OnTarget Gene Knock-out HR Targeting Vector [MCS1-EF1α-RFP-T2A-Hygro-pA-MCS2-PGK-hsvTK] SBI HR710PA-1 10μg/ 181,000 PrecisionX OnTarget Gene Knock-out HR Targeting Vector [MCS1-EF1α-Blasticidin-pA-MCS2-PGK-hsvTK] SBI HR720PA-1 10μg/ 181,000 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です21

22 ベクター サイズの大きな遺伝子を効率よくノックインできます Long ssdna Preparation Kit 高い純度で正確な配列を有する長鎖の一本鎖オリゴ (ssdna) を, 半日間で簡単に調製できるキットです 1,500 base または 3,000 base 用のキットがあります 本キットで調製した long ssdna を DNA とし,CRISPR/Cas9 と一緒に導入することで,GFP 配列を正確かつ効率よくノックインすることに成功した報告があります 参考文献 : ssodn-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes. Yoshimi K., et. al., Nat. Commun., 7: (2016).[PMID: ] ココがすごい! 簡単に高純度の目的配列を有する長鎖 ssdna の取得が可能本製品は,BioDynamics Laboratory 社が大阪大学大学院真下知士准教授と共同で開発したものです ssdna の調製には PCR や合成 DNA オリゴマーの使用, エキソヌクレアーゼ反応, 逆転写酵素反応などの工程があることから, 内部の変異や末端の欠失を生じることは避けられませんでした また, 精製には変性アクリルアミドゲル電気泳動やストレプトアビジン被覆常磁性ビーズなどが用いられてきましたが, 大量の dsdna の混入が指摘される場合もありました Long ssdna Preparation Kit( 本製品 ) は, 簡単な操作によって, 高い純度で目的の配列を有する長鎖の ssdna を取得することができます 操作方法概略 1 2 or 3 4 or 1. 目的の DNA 断片をキット付属のプラスミドの MCS の 2 つの Nicking 酵素サイトの間, あるいは Nicking 酵素サイトと制限酵素サイトの間にクローニングする 2.Nicking 酵素や制限酵素を用いて切断する 3. 消化したプラスミドを, 添付の Denaturing Gel-loading Buffer で変性させた後, 通常の電気泳動を行う 4. 先頭のバンドを切り出し抽出, 精製するだけで目的の ssdna が得られる 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です22 特許申請中の新技術である Nicking 酵素法によって, 変異や末端の欠失を含まない,1,500 base または 3,000 base までの長鎖 ssdna が調製できます 全操作は, 一般的な dsdna 断片の調製法とほぼ同じで, 特別な機器や試薬は必要ありません PCR で増幅しないため, エラーは生じません ベクター製品のため, 安価です 品 名 メーカー商品コード 包装 / 価格 ( ) Long ssdna Preparation Kit BDL DS610 for 1.5kb 1 kit / 40,000 BDL DS620 for 3.0kb 1 kit / 40,000 調製したい long ssdna の長さに応じた製品をお選び下さい 着色済み RNA 分子量マーカーが付属しています 回収率 UP! Coming Soon! キット内容 Plasmid * Denaturing Gel-loading Buffer: 目的の長鎖 ssdna を通常のアガロースゲル電気泳動で分離精製することができます 着色済 RNA 分子量マーカー (Prestain Marker for RNA High, DynaMarker ): ゲル電気泳動をモニターするために有用なインディケーターとして使用できます 本製品にはゲルからの DNA 抽出キットは含まれません *~1.5 kb 用と 3.0 kb 用の製品とで, キットに含まれるプラスミドの種類が異なります! ご購入時のご注意 ご注文の際に使用目的確約書が必要です Web に掲載の使用目的確約書に必要事項をご記入の上, 販売店担当者にお渡し下さい 本製品または技術を商用目的で使用される場合は, 予め当社 特注品担当までお問い合わせ下さい 新製品 : 長鎖 ssdna の精製に最適化したゲル抽出キット BioDynamics Laboratory 社では, 現在新製品を開発中です 上記キットで作製した長鎖 ssdna を高収率 高純度で抽出 精製できます 発売情報をお見逃しなく!

23 長鎖の一本鎖 DNA(LssDNA) で広がるゲノム編集の可能性 大阪大学大学院医学系研究科附属動物実験施設真下知士准教授 CRISPR-Cas9 システムを利用することで, 遺伝子改変マウスを非常に簡単に, 短期間で, 低コストで作製することが可能になりました マウス受精卵に guide RNA と Cas9 メッセンジャー RNA( あるいは Cas9 タンパク質 ) をインジェクションすることで, ノックアウトマウスを作製することができます 技術の難しいインジェクションの代わりに, エレクトロポレーションで簡単に受精卵に導入することも可能になっています ( 文献 1) CRISPR-Cas9 のメリットは, 複数の を同時に使うことで, ダブルノックアウトやトリプルノックアウトしたり, 大規模なゲノム領域を欠失させることが可能です CRISPR-Cas9 と一緒に, 短い一本鎖 DNA(ssODN:singlestranded oligonucleotide) を導入することで,ES 細胞ではこれまで煩雑であった一塩基変異 (SNP) を簡単に置換することができます ( 文献 2) しかしながら, 受精卵の中では, 相同組換え (HR:Homologous Recombination) 効率があまり高くないことから, GFP やヒト遺伝子などの大きなサイズのゲノム DNA をノックインすることが困難でありました 今回,( 株 ) バイオダイナミクス研究所 ( メーカー略称 :BDL) が開発した長い一本鎖の DNA(LssDNA:long ssdna) を作成する方法により,CRISPR-Cas9 と一緒に LssDNA を導入するだけで,GFP や大きな遺伝子を効率的にノックインすることができるようになりました 実際, 我々の研究室では, 神経に発現する Thy1 遺伝子の下流に緑色蛍光タンパク質 GFP がつながるようにデザインした LssDNA を作成し, 受精卵にインジェクションすることで, 神経細胞が特異的に緑色の蛍光を発するノックインラットを作製することに成功しました ( 文献 3) LssDNA とゲノム編集を組合わせれば, これまでは難しかった蛍光タンパク質や組織特異的 Cre, ヒト遺伝子などのノックインが可能です ( 株 ) バイオダイナミクス研究所 ( 販売 : フナコシ ( 株 )) の LssDNA 精製キットを利用すると, 半日間で簡単に LssDNA を作成することができます 本コラムは,2016 年にご執筆いただいたものです 引用文献 1)Kaneko T., et. al., Sci. Rep., 4: 6382 (2014). 2)Yoshimi K., et. al., Nat. Commun., 5: 4240 (2014). 3)Yoshimi K., et. al., Nat. Commun., 7: (2016). Citation 使用例 参考文献 ssodn-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes. Yoshimi K., et. al., Nat. Commun., 7: (2016). [PMID: ] Nicking 酵素法 ( 本製品 ) にて調製した長鎖 ssdna (2A peptide 配列と GFP 全域の配列,5 側 300 base homology arm,3 側 60 base homology arm を含む全長 1,194 base の相補鎖側 ssdna) poly(a) を付与した Cas9-poly(A)RNA :Thy1-TGA をラット受精卵へマイクロインジェクションすることによって, ラット rthy1 遺伝子 C 末端に, 高い効率 (11.1%) で GFP 遺伝子全域をノックインすることに成功した この論文は, 長鎖 ssdna を用いた LssDNA 法 (ssodn に対して LssDNA) によって, 外来遺伝子全長のノックイン効率を高めることができることを示した初めての報文である 3.0 kb 1.5 kb 目的の dsdna 断片を plsodn-1 または plsodn-3 の MCS にクローニングした これを Nicking 酵素で処理することで目的断片の両端にニックを導入した Denaturing Gel-loading Buffer で変性後, 試料を電気泳動で分離し, 目的のバンドから DNA を抽出, 精製した Lane 1:1,500 bp DNA 断片を導入した plsodn-1 を,Nicking 酵素で処理した試料 Lane 2: 精製した長鎖 ssdna(1,500 base) Lane 3:3,000 bp DNA 断片を導入した plsodn-3 を,Nicking 酵素で処理した試料 Lane 4: 精製した長鎖 ssdna(3,000 base) 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です23

24 63186 Cas9 発現を mrna レベルで確認 Cas9 遺伝子用プライマーのセット 細胞内における Cas9 mrna の発現を確認するための RT-PCR 用プライマーのセットです 使用例 増幅サイズの異なる 2 種類のプライマーセットが付属します 野生型 Cas9,Nickase Cas9,double mutant Cas9 のいずれも検出可能です 品名メーカー商品コード包装 / 価格 ( ) Cas9 RT-PCR Primer Set SBI CAS9-PR-1 1 kit / 18,000 各プライマー 50 µl(5 µm),50 回分 122bp 219bp Cas9 発現細胞とコントロール細胞由来の cdna を用いて PCR を行い, 増幅産物を電気泳動した Cas9 発現細胞由来試料の Ct 値はおよそ 17 であり, ネガティブコントロールではバンドが検出されなかった 抗 Cas9 抗体 検索絞込み機能が強化されたフナコシ Web で抗体検索もらくらく! アンティ先生 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です24 品名 Anti-Cas9, N-terminal クラス :IgG, 性状 :PAPu, 交差性 :Bacteria Anti-Cas9, C-terminal クラス :IgG, 性状 :PAPu, 交差性 :Bacteria Anti-Cas9, Antibody Pack クラス :IgG, 性状 :PAPu, 交差性 :Bacteria #NBP SS(0.025 ml,1.0 mg/ml) と #NBP SS(0.025 ml,1.0 mg/ml) が 1 vial ずつ含まれるセットです Anti-Cas9 クラス :IgG, 性状 :PAPu, 交差性 :Bacteria Anti-Cas9 クラス :IgG, 性状 :PAPu 関連製品 : 抗 Cpf1 抗体 品名 Anti-CPF1 クラス :IgG, 性状 :AAPu 免疫動物 ( クローン ) 標識 適用 メーカー 商品コード 包装 価格 ( ) Mouse-Mono - IC, IF, IHC, NOV NBP SS ml 29,000 (7A9-3A3) IP, West NOV NBP ml 68,000 Mouse-Mono - ChIP, IC, IF, NOV NBP SS ml 29,000 (6G12) IP, West NOV NBP ml 66,000 Mouse-Mono - - NOV NBP set 49,000 Mouse-Mono (7A9) Mouse-Mono (7A9) 略号 : Mono : Monoclonal, Poly : Polyclonal, AAPu : Antigen Affinity Purified, PAPu : Protein A/G Affinity Purified, APu : Affinity Purified, Pu : Purified, Dot : Dot Blotting, EMSA : Electrophoretic Mobility Shift Assay, FCM : Flow Cytometry, IC : Immunocytochemistry, IF : Immunofluorescence, IHC : Immunohistochemistry, IP : Immunoprecipitation, Neut : Neutralization, West : Western Blotting Memo Acidaminococcus および Lachnospiraceae 由来の Cpf1 タンパク質は, ヒト細胞においてゲノム編集を効率的に行うことが分かっています Cpf1 は Cas9 といくつか共通の特性を持ちますが, 特に下記のような利点があります 単一の crrna 誘導エンドヌクレアーゼであり, 干渉を調節する tracrrna を必要としない Cas9 によって産生される平滑末端の代わりに, 付着末端を産生する T( チミン ) リッチな PAM 配列を利用 pre-crrna プロセッシングのための RNase Ⅲ 機能を有する 参考文献 :Zetsche B., et al., Cell., 163 (3): 759~71 (2015). - - IC, IF, IP, West ELISA, IF, IP, West WEB 会員にご登録下さい! ログインにより, 各種お問い合わせフォーム, カタログ請求, オンラインオーダーが便利になります GNT GTX μg 32,000 EPG A μg 13,000 EPG A μg 34,000 EPG A μg 60,000 免疫動物 ( クローン ) 標識 適用 メーカー 商品コード 包装 価格 ( ) Rabbit-Poly - IC, IF, West GNT GTX μl 23,000

25 65625 Cas9/SaCas9 定量用 ELISA キット EpiQuik CRISPR/Cas9/SaCas9 Assay ELISA Kit Cas9 を導入した発現クローンのスクリーニングに有用です Cas9(SpCas9) または SaCas9 タンパク質を, ダイレクト ELISA 法により定量するキットです 電気泳動を用いずに,Cas9 タンパク質の定量を行えます キットには Cas9 または SaCas9 のコントロールが含まれています 迅速 (3 時間 ), 高感度かつ特異的に定量できます 測定試料 : 全細胞抽出物, 精製 Cas9 測定範囲 :0.5~20ng/well 測定波長 :450nm 使用例 標的配列が切断されたかを検出するキット GenCrispr Mutation Detection Kit CRISPR/Cas9 などのゲノム編集ツールで切断されたゲノム DNA を,PCR により検出するキットです 切断効率を確認することができます 目視で簡単に確認できます 標的配列を含む領域の PCR でミスマッチを含む二本鎖 ( ヘテロ二重鎖 ) が形成された場合,PCR 反応液を T7EndonucleaseⅠ 処理するとミスマッチ部位で切断されます 電気泳動上で切断された断片がバンドとして検出されます 遺伝子突然変異誘発や SNP の検出にも使用できます キット内容 キットにはポジティブコントロールの鋳型 DNA とプライマーミックスが含まれています High-FidelityDNApolymerase PCRreactionbuffer GenCrisprT7endonucleaseⅠ GenCrisprT7endonucleaseⅠreactionbuffer ControltemplateDNA Controlprimermix 左 :HeLa 細胞抽出物に異なる濃度で Cas9 タンパク質を添加し,EpiQuikCRISPR/ Cas9AssayELISAKit(#P-4060) で Cas9 タンパク質量を測定した 右 :K562 細胞抽出物に異なる濃度で SaCas9 タンパク質を添加し,EpiQuikCRISPR/ SaCas9(S.aureus)AssayELISAKit(#P-4062) で SaCas9 タンパク質量を測定した 検量線左図 :EpiQuikCRISPR/Cas9AssayELISAKit(#P-4060) 右図 :EpiQuikCRISPR/SaCas9AssayELISAKit(#P-4062) 品名メーカー商品コード包装 / 価格 ( ) EpiQuik CRISPR/Cas9 Assay ELISA Kit (Colorimetric) EPG P Assays 1kit/ 71,000 EPG P Assays 1kit/ 121,000 EpiQuik CRISPR/SaCas9 (S.aureus)Assay ELISA Kit (Colorimetric) EPG P Assays 1kit/ 60,000 EPG P Assays 1kit/ 103,000 ProteaseK dntp 本製品にゲノム DNA 抽出キットは含まれません 操作方法概略 1. 細胞の回収 :CRISPR/Cas9 などで処理された細胞を遠心して回収する 2.PCR 用試料の調製 : キットなどを用いて, ゲノム DNA を抽出する 3.PCR による増幅 : キットに付属の DNApolymerase で PCR を行う 4 ヘテロ二重鎖 DNA の消化 :PCR 後, 反応液に T7endonuclease Ⅰを処理する 5. 検出 : アガロースゲル電気泳動を行う 品 名 メーカー商品コード 包装 / 価格 ( ) GenCrispr Mutation Detection Kit GSC L reactions 1kit/ 39,000 GSC L reactions 1kit/ 86,000 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です25

26 64354 安い 早い 高効率 CRISPR/Cas9 による遺伝子改変マウス作製サービス 標的遺伝子に対する 設計から invitro 活性評価を行い, 受精卵へのインジェクションを行います 産子の 50% 以上に変異導入されることが期待されます を用いたノックインも承ります の設計からマウス作製まで, トータルサービスのご提供が可能です また, 一部工程のみの実施も可能です 作業概要 ( 標準工程 ) 1. 設計と活性確認 ( 約 2 ケ月 ) 標的遺伝子に対して を設計し, その標的配列を認識 切断できるかどうか invitro で切断活性評価を行います ご要望に応じて,Cas9 発現ベクターの構築も実施いたします Cas9 Cas9 ベクター お客様のご要望に応じた工程での実施例 ES 細胞への導入 ES 細胞を用いて, 相同組換え法との組み合わせにより,2 箇所の loxp 配列を挿入したコンディショナル ポテンシャルの ES 細胞クローンを取得しております 受精卵へのインジェクション Cas9 ベクターあるいは Cas9 タンパク質と一緒に ssoligodna を受精卵にインジェクションし, ポイントミューテーション ( 点変異 ) 等をノックインしました これまでに, 数塩基欠失,1 塩基欠失,1 塩基置換などの変異アレルを持つマウスを得ることに成功しております 高効率 CRISPR/Cas9 ノックイン法 Cas9 タンパク質と RNA およびを一緒に受精卵に導入することで, ゲノム中の特定の場所へノックインすることができます これまでは難しかった点突然変異の導入や大きなサイズの組換えを, 受精卵で効率よく行うことが可能で,CRISPR/Cas9 によるマウス作製の適用範囲がさらに拡大するものと考えられます 上記の他, 様々な技法 ( ノックイン,flox マウス作製など ) についても, ご相談を承ります 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です26 2. 受精卵へのインジェクションオプション工程 既存のトランスジェニックマウス作製と同様の方法を用いて,Cas9 タンパク質と 自然交配による次世代マウスの作製 RNA の複合体を受精卵にインジェクションファウンダーマウスと野生型マウスとの自然交配により, 次世します 同時にをインジェクション代マウスを作製します することで, 相同組換えによるノックイン産子全頭について, ダイレクトシーケンスによる導入変異の解を期待します 析をいたします 実施内容については, ご要望を踏まえてご提案させていただきます 納期 : 約 3 ヶ月 3. ファウンダーマウスの同定 (4~5 ケ月 ) SPF 施設の飼育ラック 1 棚を占有させ,1 世代 (3 か月間 ) の飼育 繁殖を行います 産子については,8 週齢までの飼育とダイレクト変異が導入されている産子 ( ファウンダーマウス ) をスクリーニングシーケンスによる変異配列の解析を実施します し, ダイレクトシーケンスによって変異体の検出を実施します 1 棚は 10 ケージを収納する規模です 交配 繁殖の進行に伴い, 適 解析の結果, ファウンダーマウスが得られなかった場合,3. の費用宜, ケージ数を調整します はご請求致しません 妊娠出産に至らず産子が得られないときは, 交配費用のみでの精算とさせていただきます 4. F1 ヘテロマウスの取得 (7~8 ケ月 ) ご注文方法 / 価格 ファウンダーマウスのうち, 目的通りの変詳細は当社 特注品担当までお問い合わせ下さい 異が導入されている個体を選択し, 次世代 (F1) マウスを作製します [ メーカー :TRG] ファウンダーマウスはモザイク ( 変異が導入された細胞とされていない細胞が混在している ) なので, 次世代マウスに生殖系列伝播した個体を作出し, かつ変異を特定する必要があります この工程で作出される次世代マウスは, ヘテロ (+/-) マウスです 価格にはライセンス料を含みます マウスの輸送費 微生物検査費は, 別途申し受けます CRISPR/Cas9 関連のライセンス内容 ( 株 ) トランスジェニックは,2015 年 4 月 21 日に米国 Broad 研究所から CRISPR/Cas9 に関する特許群 (US B1 他 ) の日本国内における非独占的実施権を取得しております ( 株 ) トランスジェニックで作製した遺伝子組換えマウスは, お客様の機関内における研究目的での使用が認められています また, 国立大学法人東京医科歯科大学より高効率 CRISPR/Cas9 ノックイン法に関する特許の日本国内での非独占的使用権許諾を受けております 作製費用には Broad 研究所および東京医科歯科大学へのライセンス料を含みます お問い合わせ先 : TEL: FAX: :jutaku@funakoshi.co.jp

27 ゲノム編集のエキスパートがあなたの研究をサポート CRISPR/Cas9 関連サービス ご指定頂いたゲノム領域を標的とする CRISPR/Cas9 発現プラスミドや HR ベクターのデザインおよび作製を行うサービスです 目的遺伝子 (accession number) や DNA シーケンス情報をお送りいただきます カスタム CRISPR/Cas9 発現プラスミド作製サービス 特定の配列を標的とする のデザイン, 発現プラスミドの作製を行うサービスです SBI 社の SmartNuclease または SmartNickase ベクター (p.13) にクローニングします 野生型 / 変異型 Cas9 からベクターをお選び下さい 変異型 Cas9 については,p.13 をご覧下さい カスタム HR ベクター作製サービス 特定の配列を標的とするホモロジーアームのデザイン, および HR ベクターを作製するサービスです 遺伝子のノックアウト, ノックイン, タギング, 単一ヌクレオチド修飾に有用です ホモロジーアームは,SBI 社の HR ベクター (p.20~21) に導入します ゲノム編集済み細胞株作製サービス 特定の配列を標的として, カスタム作製した Cas9 および HR ベクターを用いて細胞株を作製するサービスです 遺伝子のノックアウト, ノックイン, タギング, 単一ヌクレオチド修飾が可能です 改変された安定細胞株をお送りし, クローンの単離, 特性評価はお客様に行って頂く Deliverunscreenedcells サービスと, ご希望通りの修飾がなされた細胞株のスクリーニングを実施してお届けする Desiredmodification サービスがあります A e ati e i -21(fold) ecto ご注文方法 / 価格 4 詳細は当社 特注品担当までお問い合わせ下さい [ メーカー :SBI] 5 まずはお気軽にご相談下さい! 特注品担当 Tel Fax : jutaku@funakoshi.co.jp B Cre -Cre GFP Brig tfield カスタム grna およびカスタム HR ベクターを用いた HEK293 細胞における mir-21 遺伝子のノックアウト (A)miR-21 遺伝子の発現量を qpcr で測定したところ,gRNA を導入した細胞 (KO1~ KO5) では遺伝子のノックアウトが確認された (B)GFP マーカーを除去するため,HR ベクターの LoxP 領域で組換えを起こす Cre リコンビナーゼで処理したところ, 効率的に GFP マーカーが除去されていることが分かる お問い合わせ先 : TEL: FAX: :jutaku@funakoshi.co.jp 樹庵じゅあん 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です27

28 64464 CRISPR/Cas9 を用いたゲノム編集遺伝子改変細胞株の作製サービス CRISPR/Cas9 を用いて遺伝子のノックアウト, ノックイン, タグ付け, 単一ヌクレオチド修飾を行った細胞株を作製するサービスです 687 大好評! クローニング不要! 人工遺伝子合成サービス 任意の配列の DNA を合成し, ベクターに挿入するサービスです cdna ライブラリーから PCR により目的の DNA 断片を増幅することが煩雑な場合などに有用です 受 託 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です28 フナコシニュースを定期送付いたします 毎月 2 回, フナコシニュースは最新の情報をお届けします サービスの作業工程 ( 例 ) 1. 細胞培養条件の検討 2. 設計と Cas9 ベクター構築 3. 細胞株への遺伝子導入 4.1 次スクリーニング 5. 陽性クローンの解析 6.リクローニングと解析 7. 遺伝子改変細胞株の樹立 ご依頼内容を伺った上で, 作業工程の詳細をご相談させていただきます ご注文方法 / 価格 ゲノム編集をご希望の細胞種, ゲノム編集の内容, 対象遺伝子などをご準備の上, 当社 特注品担当までお問い合わせ下さい 無料です カタログ送付のお申し込み フナコシニュース定期送付の新規お申し込み 送付先の変更 専用バインダーのお申し込みは, 下記までご連絡下さい :sales@funakoshi.co.jp まずはお気軽にご相談下さい! 特注品担当 [ メーカー :FUN] TEL FAX : jutaku@funakoshi.co.jp FAX: フナコシ Web( からオンラインでのお申し込みもできます 価格 最低価格 納品 19,400/1 断片 ~3kb 45/base *1 3kb~5kb 55/base *1 5kb~8kb 65/base *1 *1 価格は鎖長, 配列の複雑さ (GC の含有量, リピート配列など ) により変動いたします 配列情報のみから人工遺伝子を合成します シークエンシング解析データ, プラスミドマップもご提供します 独自の OptimumGene テクノロジーにより, 発現宿主 (E.coli, 酵母, 昆虫, 哺乳動物, 植物など ) のコドン最適化による発現タンパク質の最大化を無償で行います 繰り返し配列が含まれる DNA 断片は, 合成できない場合もあります 目的配列が挿入されたベクター ( 凍結乾燥品, 約 4μg *2 ) *2 他の容量での納品をご希望の際は, 当社 特注品担当までお問い合わせ下さい ご注文方法 フナコシ Web( のオンラインオーダーフォームからご注文下さい [ メーカー :GSJ] Memo OptimumGene テクノロジーとは GenScript 社独自の配列最適化技術 OptimumGene のアルゴリズムは, コドン出現頻度,mRNA の構造や転写 翻訳の際の調節領域などタンパク質発現における様々なステージでのパラメータを加味して最適化を行います 45~ /bp 哺乳動物由来のタンパク質 α を E.coli で発現させた OptimumGene でコドン最適化させた場合, 最適化を行っていない場合の 10 倍に, また他社システムの 3 倍に発現量が増大した お問い合わせ先 : TEL: FAX: :jutaku@funakoshi.co.jp

29 64832 ノックイン遺伝子の挿入位置を安価に解析します外来 DNA の挿入位置解析サービス 合同会社 PGL( ピージーエル ) 独自の技術である PGL 法を用いて, 生物のゲノム中に含まれる外来遺伝子を検出 / 解析するサービスです Memo 特許申請中の技術 PGL 法 とは生物のゲノム中に含まれる外来遺伝子を検出する方法です 探索したい遺伝子配列がわかっていれば, ゲノム内のどこに入っているかが安価に解析できます 複数箇所にも対応でき, 前後のゲノム配列との融合遺伝子として外来遺伝子を検出できます 応用例 :トランスジーンの導入位置の探索, ウイルスのインテグレーション位置の探索, 融合遺伝子の探索など 利用例 CRISPR/Cas9 を用いた遺伝子ノックインのオフターゲットによって生じた遺伝子挿入の位置決定 HTLV,HBV,HIV などのウイルスによって宿主ゲノムに挿入されたウイルスゲノムの挿入位置の決定 ips 細胞などの再生医療向け細胞株の安全性評価 形質転換マウスのトランスジーン挿入位置の決定 ゲノム DNA 解析例 PCR 形質転換マウスのトランスジーン挿入位置の決定 PCR 手順 1.マイクロインジェクションによって作製された形質転換マウ スからゲノム DNA を抽出する 2.PGL 法を用いてトランスジーン近傍配列の特異的増幅を行 う ( 下図 ) ム NA シー エ ス 3.アガロース電気泳動によって分離された DNA フラグメントを回収する 4.キャピラリーシーケンサーを用いてトランスジーン近傍配列 を解読する 5.マウスゲノムとトランスジーンの融合配列を確認する 外来 DNA 特異的プライマー ( : ビオチン ) 任意プライマー 1.トランスジーンやウイルス DNA などの外来 DNA に特異的なプライマー (5 末端ビオチン化 ) と任意プライマーを用いて, 外来 DNA の近傍配列を増幅する 2.アフィニティー精製により, 近傍配列を含む PCR 産物を濃縮する 3. 濃縮された PCR 産物を鋳型に再度 PCR を行い, 外来 DNA の近傍配列を特異的に増幅する 4.アガロース電気泳動により DNA フラグメントを分取後, キャピラリーシーケンサーにより近傍配列を解読し, 外来 DNA の挿入位置を決定する ご用意いただくもの トランスジーンの配列情報 使用したウイルス, ウイルスベクターなどの情報 トランスジェニック生物のゲノム DNA (100ng/μg,A 260 /A 280 >1.6,A 260 /A 230 >1.6) ご注文方法 / 価格 詳細は当社 特注品担当までお問い合わせ下さい [ メーカー :PGL] 6. 近傍配列の Blast 検索でマウスゲノム上のトランスジーンの挿入位置を決定する 結果異なるトランスジーンを持つ形質転換マウス 4 系統において, それぞれの系統で複数のトランスジーン挿入およびその挿入位置を決定することができた b M P [ 決定されたトランスジーン挿入位置 ] ( 系統 1)a:Chr8:124,,. b:chr6:52,,. ( 系統 2)c:Chr3:10,,. d:chr1:154,,. e:chr8:115,,. ( 系統 3)f:Chr16:54,,. g:chr14:82,,. ( 系統 4)h:Chr12:120,,. i:chr10:79,,. j:chr1:98,,. k:chr12:37,,. M:DNAsi emarker P: arentline 1 4: 形質転換マウス 未発表データのため, 挿入位置の下 6 桁は,. で表示しています お問い合わせ先 : TEL: FAX: :jutaku@funakoshi.co.jp 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です29

30 64619 ゲノムの安全領域にノックインするキット AAVS1 Safe Harbor Targeting System 遺伝子が挿入されても表現型への影響がなく安全な遺伝子領域として知られる AAVS1 Safe Harbor Site に, 任意の目的遺伝子や Cas9 などを簡便にノックインするキットです 導入遺伝子は恒常的に発現します 同質遺伝子細胞株を簡便に構築できます オフターゲット効果を最小化できます hspcas9aavs1safeharborknock-indonor (#CAS620A-KIT) は,CRISPR/Cas9 ライブラリーの効率的なスクリーニングに有用です Memo Safe Harbor とは SafeHarbor は様々な細胞で転写活性を有し, かつその領域に遺伝子導入を行ってもフェノタイプに影響を及ぼさない遺伝子領域です ゲノムに外来遺伝子を導入する際に, 遺伝子導入による影響や導入遺伝子の発現に影響が生じないように SafeHarbor を標的として利用する手法が確立されています 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です30 キット内容 HR ベクター (#GE62xA-1) AAVS1 用 grna/cas9 発現 All-in-one ベクター (#CAS601A-1) junctionpcr プライマー (#GE640PR-1,AAVS へのノックイン確認用 ) それぞれ単品でのご購入も可能です e ati e e pression 使用例 Cas9 knock in at AA 1 ocus NC Cas9stablecell lineinaavs1 locus# 2. Cas9stablecell lineinaavs1 locus#1 3. Nontransfected 293cells ノックイン 左 : 本製品を用いて作製した HEK293 細胞株各クローン AAVS1 遺伝子座における Cas9 遺伝子の qpcr による発現量解析右 :Cas9 高発現細胞 8 と 17 の Surveyor Assay の結果 矢印 ( ) のバンドは Cas9 による切断を示す コントロール 細胞 (NC,lane3) には, このバンドが存在しない Memo Surveyor Assay によるゲノム切断効率の測定ターゲティングの目安として,SurveyorAssay で求められる 挿入欠失 (indel) 頻度 を使用できます (GuschinD.Y.,et.al.,2010) PCR で標的遺伝子を増幅すると, 遺伝子対が増幅されます CRISPR/ Cas9 による変異は, 染色体間の塩基配列の相違となって現れるため, 遺伝子対それぞれから生じる増幅産物は, 配列が異なる場所にバルジを生じます PCR 産物をヌクレアーゼ消化し, バイオアナライザーやアガロースゲル電気泳動で分析すると, 挿入欠失の起こった細胞の割合を推定することができます 製品ラインナップ 目的遺伝子をノックインするキット AAVS1-SA-puro-EF1-MCS メーカー 商品コード 包装 価格 ( ) SBI GE622A-KIT 1kit 344,000 Cas9 をノックインするキット AAVS1-SA-puro-EF1-hspCas9 メーカー 商品コード 包装 価格 ( ) SBI CAS620A-KIT 1kit 363,000 任意のプロモーターとレポーター遺伝子 (GFP) をノックインするキット AAVS1-SA-puro-MCS-GFP メーカー 商品コード 包装 価格 ( ) SBI GE624A-KIT 1kit 344,000 任意のプロモーターと目的遺伝子をノックインするキット AAVS1-SA-puro-MCS メーカー 商品コード 包装 価格 ( ) SBI GE620A-KIT 1kit 344,000

31 784 相同組換えを利用した正確かつスピーディーなクローニング Red / ET Recombination System BAC,PAC, プラスミドベクター, コスミド, または E. coli 染色体等の DNA 改変を行うシステムです CRISPR / Cas9 でノックアウトを導入し,Red / ET で変異を導入した BAC コントラストを導入することで, 少ない労力と制約の元で遺伝子改変が可能です ファージタンパク質による相同組換えを利用して E.coli の遺伝子改変を行う技術です 最大 80kb の配列をクローニングできます 制限酵素部位とは無関係に作用するため,DNA 配列中のどの位置でも改変が可能です ライゲーション操作は不要です 製品ラインナップ BAC Modification Kit, Quick and Easy(#K001) E.coli 染色体の改変や,BAC,PAC, コスミド, プラスミドベクターから不要な配列を欠失させるキットです キットに含まれるネオマイシン / カナマイシン耐性遺伝子カセット (Tn5-neo) の両端に,PCR で相同配列を付加します 本キットに含まれるネオマイシン / カナマイシン耐性遺伝子カセットには,E.coli のみで機能するプロモーターが連結しています 使用例 Animal targeting constructs 条件つきノックアウト ノックイン エクソンスワッピング 点変異の導入 大腸菌ゲノムの改変 遺伝子破壊 欠失 挿入 レポーター遺伝子やタグ導入 promoterfinetuning 点変異の導入操作方法概略 1.Attachmentofhomologyarms 相同領域に 50bp のフランクがあれば, 組換え可能です BAC Modification Kit, Counter-Selection(#K002) 野生型 rpsl 遺伝子によるストレプトマイシン感受性を利用したカウンターセレクションにより,BAC などに選択マーカーのような余分な配列を残さずに様々な改変を行うキットです 目的の遺伝子が相同組換えを起こした場合,rpsL-neo 遺伝子カセットが切り離されてストレプトマイシン耐性となるため, 簡単に選択できます ストレプトマイシン耐性の E.coli 株をご使用下さい 本キットに含まれるネオマイシン / カナマイシン耐性遺伝子カセットには,E.coli のみで機能するプロモーターが連結しています BAC Subcloning Kit(#K003) BAC,PAC,P1 オリジンをベースにしたベクター, またはコスミドなどから, 制限酵素部位の制約を受けずに長鎖の DNA 断片をサブクローニングできるキットです キットに含まれる ColE1 オリジンおよびアンピシリン耐性マーカーを含む線状 DNA に相同領域を付加することにより, 目的遺伝子を含む DNA 断片と相同組換えを起こさせることができます 品名メーカー商品コード包装 / 価格 ( ) BAC Modification Kit, Quick and Easy, Red/ET Recombination GBR K001 Quick and Easy 1kit/ 179,000 GBR K002 Counter-Selection 1kit/ 207,000 BAC Subcloning Kit, Red/ET Recombination GBR K003 1kit/ 161,000 2.Recombineering Red/ET 発現ベクターを E.coli に形質転換します 目的遺伝子を含む PCR 産物を導入します 3.Selection/screening 組換え DNA を持った細胞を選択します キット内容 pred/etexpressionplasmid Suitablecontrolexperiments L-arabinose が別途必要です! ご購入時のご注意 本製品は, 大学 官公庁研究所 (Academic) にご所属の方のみご購入いただけます また, ご購入に際して事前にライセンス使用許可が必要です 詳細は, フナコシ Web に掲載のサブライセンス確認書をご覧下さい 営利団体 企業 (CommercialEntity) にご所属の方が Red/ET Recombination テクノロジーを使用するためには,GeneBridges 社とのライセンス契約を締結していただくほか, ライセンス料が別途必要となります 詳細は当社 特注品業務担当までお問い合わせ下さい 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です31

32 5301 組み込んだ配列を痕跡を残さず除去できます PiggyBac Transposon Vector System トランスポゾンを用いて, ウイルスを用いずに目的 cdna mirna shrna 配列を宿主細胞のゲノムに組み込み, 安定発現細胞株を樹立できる発現システムです 本製品で用いているウイルスベクターには, 欠損し機能を有さないものの, 構造遺伝子の gag と env の一部が含まれています! ご購入時のご注意 営利団体 企業 (Commercial Entity) にご所属のお客様が 9 ヶ月を越えて本製品を使用される場合, ライセンス契約が必要です 原理 PiggyBac ー (p.33) T T T PASTE T E-EX SE T T T Super PiggyBac Transposase A TTAA Excision only PiggyBac Transposase 1. 目的 cdna 配列などを挿入した PiggyBac Transposon Vector(p.33) と, 切り出し用 Super Transposase 発現ベクター (#PB210PA-1, 下記 ) を宿主細胞にコトランスフェクションする 2. 発現した Super Transposase により,PiggyBac Transposon Vector 中の両端に存在するトランスポゾン特異性末端逆位配列 (PiggyBac Terminal Repeat) の部分で配列が切り出される 3. 切り出された配列が, 宿主細胞ゲノム中の TTAA 部位に組み込まれ, 安定発現細胞株が樹立される 4. 安定発現細胞株に除去用 Excision Only Transposase 発現ベクター (#PB220PA-1) のみを再度トランスフェクションすると, 発現した Transposase により, 組み込んだ目的配列が痕跡を残さずに除去される 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です32 T T Footprint-free e o al ( 除去 ) 一度のトランスフェクションで, 安定発現細胞株の樹立が可能です 高効率での遺伝子導入,iPS 細胞の樹立, 可逆的な遺伝子改変などに有用です ヒト マウス ラット由来細胞で使用できます Transposase 発現ベクター ゲノムに組み込んだ目的配列は, 除去用 (Excision only) Transposase により痕跡を残さずに除去できます 10~100 kb の配列も導入可能です 複数のベクターを同時に組み込むことも可能です 切り出し用 除去用品名 Sma Sma メーカー商品コード包装 / 価格 ( ) Super PiggyBac Transposase Expression Vector SBI PB210PA-1 10 μg / 76,000 Excision only PiggyBac Transposase Expression Vector cision n SBI PB220PA-1 10 μg / 76,000 in 3 7 SV 0 poly-a uper igg ac Transposase pression ec or 6964 p uper igg ac Transposase C V Promoter Sa 2000 SV 0 late 16s Intron in 3 7 SV 0 poly-a igg ac Transposase pression ec or 6964 p C V Promoter Sa 2000 SV 0 late 16s Intron cision on igg actransposase Transposase 発現ベクターは, 使い切りの製品となります

33 ! ご購入時のご注意 営利団体 企業 (Commercial Entity) にご所属のお客様が 9 ヶ月を越えて本製品を使用される場合, ライセンス契約が必要です PiggyBac cdna Cloning and Expression Vector cdna/mirna 恒常発現ベクター Inducible cdna Cloning and Expression Vector cdna/mirna 誘導発現ベクター 包装 / 価格 :10 μg / 108,000 [ メーカー :SBI] 目的遺伝子の発現マーカーの発現マーカー商品コード EF1α CMV Cumate の添加により,cDNA または mirna を厳密に誘導発現できるベクターです 非誘導時のバックグラウンドが抑えられます 本製品では 1 つのベクターで, 目的誘導遺伝子と CymR リプレッサーを共発現します (IRES) EF1α GFP RFP Neo Puro GFP RFP GFP+Puro RFP+Puro PB530A-2 PB531A-2 PB533A-2 PB510B-1 PB511B-1 PB512B-1 PB513B-1 PB514B-2 MSCV GFP+Puro PB713B-1 Cumate スイッチ OFF CymR リプレッサーにより遺伝子の発現が抑制されている状態 Cumate スイッチ ON Cumate を加えると,Cumate が CymR リプレッサーに結合し CymR リプレッサーが CuO から解離するため, 遺伝子発現が起こります Cumate オペレーター配列 (CuO) に強く結合している CymR リプレッサーを介して発現の ON/OFF が行われます PiggyBac cdna Cloning and Expression Vector shrna 発現ベクター C ori 3 PB Terminal Repeat Core In ulator SV40 oly A EcoRl BamHl 1 AMp R PiggyBac shrna Vectors sirna template insert 5 PB Terminal Repeat puro Core In ulator 2A EF1 or CMV 1 promoter en e loo anti en e terminator ran cri tion sense Dicer sense shrna shrna sirna antisense antisense I 品 名 Inducible cdna Cloning and Expression Vector (PB-Cuo-MCS-IRES-GFP-EF1-CymR-Puro) メーカー商品コード包装 / 価格 ( ) Inducible cdna Cloning and Expression Vector [PB-Cuo-MCS-IRES-GFP-EF1-CymR-Puro] SBI PBQM812A-1 10 μg / 173,000 Cumate Solution, SBI PBQM100A ml / 18,000 包装 / 価格 :10 μg / 108,000 [ メーカー :SBI] 目的遺伝子の発現マーカーの発現 マーカー 商品コード H1 CMV PBSI505A-1 GFP+Puro EF1 PBSI506A-1 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です33

34 8066 同じ遺伝的背景を持つノックイン細胞株を作製できます PinPoint Targeted Integration System プロモーターと発現遺伝子の組み合わせなどの遺伝的特徴をゲノム部位特異的に導入できます 様々な目的遺伝子をゲノム上の同部位にノックインし, 同じ遺伝的背景を持つアイソジェニック細胞株を作製できます phic31 インテグラーゼ (p.35) または Cas9 を使用します 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です34 原理 SelectionCassette PinPoint attp Placement Vector e 1 InsertPinPointPlacementsite (PinPointattP)intothetargetgenome usingcas9orphic31 Cas9 LoxP SelectionCassette LoxP 1.ゲノムの標的部位へ PinPointSite を導入する Placement ベクターを用いて, ゲノム上に目的遺伝子の挿入サイト (PinPointSite) を指定する 方法 1 PinPoint-FC システム phic31 インテグラーゼ発現プラスミドと PinPoint-FC PlacementVector をトランスフェクションし,phiC31 インテグラーゼにより, 標的部位に PinPointSite を導入する 方法 2 PinPoint-HR システム CRISPR/Cas9 と PinPoint-HRPlacementVector をトランスフェクションし, 相同組み換え修復 (HDR) により切断した領域に PinPointSite を導入する e 2 IntegratePinPointDonorVectorinto pre-placedpinpointattpsite LoxP SelectionCassette 2.PinPointSite に目的遺伝子を導入する PinPoint ベクターと PinPoint インテグラーゼ発現ベクター ( 右記 ) を細胞にトランスフェクションし,1. で指定した PinPointSite に目的遺伝子カセットを挿入する e 3 (o io a ) Removeselectioncassetteandother vectorse uences ithcre/lox 3.( オプション ) Cre/LoxP 反応により遺伝子カセットを除去する R PinPointattP PinPointattP PhiC31Integrase GenomicDNA ExpressionCassette LoxP PinPointattB LoxP ExpressionCassette GenomicDNA PinPoint Donor Vector LoxP ExpressionCassette GenomicDNA PinPointIntegrase CreRecom inase 製品ラインナップ 方法 1 (PinPoint-FC システム ) の All-in-one キットキット内容 : PinPoint-FCattPPlacementVector(#PIN300A-1) PhiC31IntegraseExpressionPlasmid(#FC200PA-1)p.35 PinPointIntegraseExpressionPlasmid(#PIN200A-1) CAGPinPointDonorVector(#PIN510A-1) CAG-GFP-T2A-LucPinPointPositiveControlDonorVector(#PIN600A-1) 品名メーカー商品コード包装 / 価格 ( ) PinPoint-FC System for Platform Cell Line Generation & Retargeting SBI PIN300A-KIT 1kit/ 454,000 方法 2 (PinPoint-HR システム ) の All-in-one キットキット内容 : PinPoint-HRattPPlacementVector(#PIN400A-1) PinPointIntegraseExpressionPlasmid(#PIN200A-1) CAGPinPointDonorVector(#PIN510A-1) CAG-GFP-T2A-LucPinPointPositiveControlDonorVector(#PIN600A-1) 別途, 細胞内で Cas9 を発現させる必要があります PinPoint-HR System for Platform Cell Line Generation & Retargeting SBI PIN400A-KIT 1kit/ 454,000 キット単品 PinPoint Site Placement ベクター PinPoint-FC attp Placement Vector SBI PIN300A-1 10μg/ 121,000 PinPoint-HR attp Placement Vector SBI PIN400A-1 10μg/ 201,000 PinPoint-HR attp AAVS1 Placement Vector SBI PIN410A-1 10μg/ 201,000 相同組換えにより AAVS1 遺伝子に PinPointSite を導入するベクター PinPoint インテグラーゼ発現用ベクター PinPoint Integrase Expression Plasmid SBI PIN200A-1 10μg/ 117,000 PinPoint ベクター alpha PinPoint Donor Vector SBI PIN500A-1 EF1 10μg/ 161,000 ppp-ef1a-mcs-pa-attb-puro-pa PinPoint Donor Vector SBI PIN510A-1 CAG 10μg/ 161,000 ppp-cag-mcs-wpre-pa-attb-puro-pa PinPoint Donor Vector SBI PIN520A-1 Empty 10μg/ 161,000 ppp-mcs-wpre-pa-attb-puro-pa

35 7553 ウイルスを使わず, シングルコピーをワンステップでゲノムに導入 phic31 Integrase Vector System 目的遺伝子組み込み用ベクターと,phiC31 インテグラーゼ発現ベクターを用いて, 目的遺伝子をゲノムの phic31 インテグラーゼ認識配列に組み込むシステムです ウイルスを用いずに安定発現細胞株を作製できます 原理 目的遺伝子 製品ラインナップ phic31 インテグラ - ゼ発現ベクター att Donor Plasmid attb PseudoattP PhiC31Integrase 目的遺伝子 att Donor Plasmid attb PseudoattP PhiC31 Integrase 品名メーカー商品コード包装 / 価格 ( ) PhiC31 Integrase Expression Plasmid SBI FC200PA-1 10μg/ 84,000 ベクター att 目的遺伝子 att 1. 目的遺伝子を attb プラスミドにクローニングし, PhiC31IntegraseExpressionPlasmid(#FC200PA-1, 右記 ) とコトランスフェクションする 2. 細胞内で PhiC31Integrase が一過性発現し部位特異的な組換えが生じる ( プラスミドの attb とゲノムの pseudoattp 間 ) 3.pseudoattP サイトはゲノム中の転写活性部位に存在することが多いため, 導入遺伝子は安定的に発現する Memo phic31 インテグラーゼは, バクテリオファージ由来の配列特異的セリンリコンビナーゼです ファージゲノム内の attpsite と宿主バクテリアゲノム内の attbsite の 2 つの 34bp 配列 (attachmentsite:att) 間の組換えを触媒します 哺乳動物細胞を含む多くの細胞で効果的に機能することが知られ, どのようなサイズのベクターにもシングルコピーとして結合することができ, コファクターを必要としません 使用例 4 ays Phase GFP 11 ays Phase HEK293 細胞にベクター (#FC551A-1) と phic31integraseexpression Plasmid(#FC200PA-1) をトランスフェクションした Puromycin を添加後, 培養 観察した 大多数の細胞が GFP を発現していることがわかる GFP PhiC31 Donor Vector[pFC-EF1α-MCS-pA-PGK-RFP-T2A-Puro] SBI FC550A-1 10μg/ 120,000 PhiC31 Donor Vector[pFC-PGK-MCS-pA-EF1α-GFP-T2A-Puro] SBI FC551A-1 10μg/ 120,000 PhiC31 Donor Vector[pFC-CMV-MCS-pA-SV40-Neo] SBI FC501A-1 10μg/ 120,000 PhiC31 Donor Vector[pFC-MCS-pA-SV40-Neo] SBI FC500A-1 10μg/ 120,000 phic31 インテグラーゼ ( 上記 ) を用いて, ゲノムに GFP を組み込むポジティブコントロール用のベクターです Positive Control Donor Vector[pFC-CMV-GFP-SV40-Neo] SBI FC520A-1 10μg/ 120,000 本誌に掲載されている製品はすべて研究用です35

36 注目記事 メーカーインタビュー掲載しています! Cas9 タンパク質 & 導入専用トランスフェクション試薬 p.4~5 jetcrispr & SpCas9 安定かつ高い編集効率 完全合成の をお届けするサービス 長鎖の一本鎖オリゴ (ssdna) を半日間で簡単に調製できるキット p.6~7 p.22~23 Long ssdna Preparation Kit 目次 - タンパク質で導入 p.4~5 p.6~8 - mrna で導入 p.8~10 - プラスミドで導入 p.11~14 - ウイルスベクターで導入 p.15~17 Cas9 安定発現細胞株 p ベクター ノックイン / ノックアウトベクター p.20~21 長鎖 ssdna 調製キット p.22~23 PiggyBac ベクターと Transposase p.19 サービス 遺伝子改変マウス作製 p.26 ベクターデザイン 作製など p.27 遺伝子改変細胞株の作製 p.28 人工遺伝子合成 p.28 外来 DNA の挿入位置解析 p.29 ゲノム編集の確認 Cas9 増幅プライマー / 抗 Cas9 抗体 p.24 Cas9/SaCas9 定量用 ELISA キット p.25 標的配列の切断検出キット p.25 の遺伝子改変 Safe Harbor にノックインするキット p.30 相同組換えによるクローニングシステム p.31 組み込んだ配列を痕跡を残さず除去 p.32~33 アイソジェニック細胞株の作製に p.34 ウイルスを使わず安定発現細胞株を作製 p.35 NOTE 本紙に記載されている価格は,2018 年 6 月 1 日現在です 表示価格に, 消費税等は含まれていません 一部価格が予告なく変更される場合がありますので, あらかじめご了承下さい 本紙に掲載されている製品は, すべて研究目的用にのみ販売しています 医薬品, 診断用医薬品, 食品, 食品検査等の用途には使用できません 印の製品は, 遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律 ( 通称 : カルタヘナ法 ) 使用規制対象となりますので, ご使用に際しては規制に則し, 適切にお取り扱い下さい 印の製品は, 取り扱いに厳重な注意を要する製品であり, ご購入時に 使用目的確約書 が必要になります ご注文の際は, 使用目的確約書 に直筆でご記入の上, 販売店経由で当社までお送り下さい 確約書受領後に製品を発送させていただきます また, これらの製品をご購入後は, 鍵の掛かる場所での保管をお願いいたします 印の製品は, 毒物及び劇物取締法 に基づく医薬用外毒劇物です 法規制に従って, 保管, 廃棄等して下さい 印の製品は, 毒性があるため, 取り扱いに注意または厳重な注意が必要です 製品は, 鍵の掛かる場所に保管して下さい 添付されているデータシートや商品ラベルをよくお読み下さい 印の製品には安全にご利用いただくための警告ラベルが貼られています 表示に従って安全対策を実施して下さい 印は, 液体窒素中での保存を要する製品です ドライアイス包装で配送していますが, 製品到着後, 直ちに液体窒素中で保存して下さい 印は,-80 での保存を要する製品です ドライアイス包装で配送していますが, 製品到着後, 直ちに -80 のフリーザー等に保存して下さい # 以下の英数字は, 商品コードを示します 外観 仕様は改善のため, 予告なく変更することがあります R&D Systems はテクネコーポレイションの登録商標です 使用に当たっては同社の許可が必要な場合があります 記載されている会社および商品名は, 各社の商標または登録商標です 本紙には各メーカーから提供された画像 図表が掲載されています なお, 画像 図表の著作権は各メーカーが保有しています ご注文の際は,[ 品名, メーカー, 商品コード, 包装, 数量 ] をお知らせ下さい 販売店 p. u i.. p e- i i u i.. p して e F e- i e ge u i.. p して e F e- i i i u i.. p 本紙に記載されている価格は,2018 年 6 月 1 日現在です FUN-6184( , 658 )