QX200 Droplet Digital PCR & AutoDG 製品カタログ

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1 QX2 Droplet Digital PCR & AutoDG QX2 Droplet Digital PCR System QX2 AutoDG Droplet Digital PCR System

2 IT STARTS WITH A DROPLET AND ENDS IN DISCOVERY. 2 Bio-Rad Laboratories, Inc.

3 Overview Droplet Digital PCR (ddpcr TM ) はバイオ ラッドのユニークなデジタル PCR 技術です ターゲット DNA/RNA の濃度を 検量線を 作成すること無く 高感度 高精度に絶対定量することができます QX2 ddpcrシステムは 研究を新たなステージへ進めるための技術を提供いたします デジタルPCRは サンプルを微小区画に分割した上で 各微小区画のPCR 産物を検出し 統計解析を行ってDNAを定量する方法です 微小区画作成の際には 先進的なマイクロ流路技術を使用することにより 1ウェル当り約 2, 個の非常に均一な液滴 ( ドロップレット ) を作成します ( ドロップレットの大きさは約 1ナノリットルです ) また 複数のウェルのデータをソフトウェア上で統合することにより より高い精度を実現することができます このように サンプルを非常に多数の区画に分割して解析することにより 今まで以上に高感度 高精度な定量を行うことが可能となります さらにドロップレット作成を自動化できる Automated Droplet Generator (AutoDG TM ) システムがラインナップに加わり QX2 ddpcrシステムのプラットフォームは 拡張性 安定性 スループットにおいて より強力な研究ツールとしてご利用いただけます バイオ ラッドの ddpcrテクノロジーは既に がん 感染症 遺伝子発現等の研究において数多くの論文に掲載されています 今後も新しい発見へのddPCRテクノロジーの応用が期待されます For more information, visit 3

4 WHAT S IN A DROPLET? WHAT IS DIGITAL PCR PRINCIPLE デジタル PCR とは? デジタル PCRは従来のリアルタイム PCRに比べてはるかに高精度 高感度に定量を行う新しい技術です 定性のみの通常 PCR 検量線による相対定量のリアルタイム PCRに対して 絶対定量を行うデジタル PCRは第 3 世代のPCRと言われています デジタルPCRはリアルタイム PCRと全くコンセプトが異なり 限界希釈 ( 各微小区画にターゲット DNAが1またはとなるような希釈 ) したサンプルDNAを微小区画内に分散させてPCR 増幅を行います これによってターゲット遺伝子を含む微小区画では増幅シグナルがポジティブとなり ターゲット遺伝子を含まないもしくはサンプルDNA 自体を含まない微小区画では増幅シグナルがネガティブとなります ポジティブの微小区画の数を直接カウントすることでサンプル中のターゲット遺伝子濃度を絶対的に測定します * 緑線がターゲット遺伝子を含む DNA 断片 リアルタイム PCR サンプル 多数の DNA 断片が混在している状態で PCR RFU サイクル増幅曲線から Cq 値 (Ct 値 ) を設定 Cq SYBR Green:E = 9.7% ログ開始量検量線から相対的なターゲット遺伝子濃度を算出 デジタル PCR 各微小区画に DNA 断片が 1 または になるように希釈 ( 限界希釈 ) PCR 増幅 ( 飽和まで増幅可能 ) サンプル ポジティブな微小区画数を直接カウントし サンプル中のターゲット遺伝子濃度を算出 4 Bio-Rad Laboratories, Inc.

5 Principle 1 色による検出 なぜデジタルPCRなのか 2 色による検出 デジタルPCRのデータは微小区画ごとにポジティブかネガティブかのどちら かになり これをデジタル信号の1/に見立てることによって デジタル と 呼ばれています 1色による検出 2色による検出 2 色による検出 デジタルPCRの利点とは デジタルPCRはリアルタイムPCRに比べて 以下の利点があげられます PCRの増幅効率に左右されない 飽和するまで増幅が可能 限界希釈を行うため サンプル中のPCR阻害要因を軽減できる ポジティブ = 1 個 ポジティブ 1個 ポジティブ = 11 個 = 左の 1.1 倍濃度 ポジティブ 11個 左の1.1倍濃度 デジタルPCRでの定量 検量線を必要とせず 絶対的な定量を行える リアルタイムPCRで2倍以下の差を識別することは現実的に難しい ポジティブな微小区画数を直接カウントするため 定量精度が高い PCR阻害要因の軽減と飽和するまでの増幅によって高い感度が得られる デジタルPCRにおけるポアソン分布の利用 サンプルターゲット遺伝子が1コ ピー含まれており 25個の微小区画 に分割された場合 デジタルPCRではサンプルの単位容量あたりにターゲット遺伝子が何コピー サンプルターゲット遺伝子が25コ ピー含まれており 25個の微小区画 に分割された場合 存在するかを算出しますが 限界希釈であっても微小区画あたりの断片数が 1以上になる場合があります これを補正するため ポジティブの数と微小区画の数をポアソン分布にあて はめて最終濃度を算出します ポアソン分布は独立した事象の発生確率が 一定の分布を示すことに基づいていますが デジタルPCRで考えると右図 1つの微小区画に複数のターゲット遺伝 子が含まれる確率は低い 1つの微小区画に複数のターゲット遺伝 子が含まれる場合が多くなるが 個 1 個 2個 3個 4個 のターゲット遺伝子が １つのドロップレットに複数個のターゲットが入る場合があるため 含まれる確率は一定に近似できる 実際のポジティブな微小区画数はターゲットコピー数よりも少なくなる のようになります ポアソン分布にもとづいて補正 算出 ポアソン分布に基づく測定値の補正 6 を算出します ポアソン分布での補正はソフトウェアにより自動的に算出され ます ポジティブの微小区画数 を含む微小区画も増加するので これをポアソン分布で補正してコピー数 補正値 5 サンプル中のターゲット遺伝子コピー数が多くなるほど 複数個のターゲット 4 実測値 ターゲットのコピー数 デジタルPCRのアプリケーション デジタルPCRは特に以下のようなアプリケーションで これまでのリアルタイムPCRでは困難であったレベルの高精度 高感度 の解析を可能にします CNV Copy Rare Number Variation mutation / Rare sequence 検出 mrna, Single mirna 定量 高精度定量 低コピー数定量 cell など 微量サンプルでの定量 For more information, visit 5

6 WHAT S IN A DROPLET? AN ELEGANT FAST EXPERIMENT PROCEDURE デジタル PCR のワークフロー Droplet Digital PCRの実験手順は シンプルかつユーザーフレンドリーなものです QX2 Droplet Generatorを用いた場合 各手順はサンプル単位で行うことができます また Automated Droplet Generator を用いた場合は 96サンプルまでのドロップレット作成を自動で行う事が可能です 96サンプルの実験の所要時間は約 5 時間です また 更に高いスループットを求められる方は 複数回の96 サンプルの実験を1 日で行うことも可能です バイオ ラッドの QX2 ddpcrシステムは マイクロ流路技術により 微小区画として water-in-oilのドロップレット ( エマルション ) を作成します QX2システムは主に2つの機器 (Droplet GeneratorとDroplet Reader) および 関連する試薬 消耗品により構成されます Droplet Generatorにより 1サンプルあたり約 2, 個のナノリットルサイズのドロップレットを作成します それぞれのドロップレットには ターゲット遺伝子やバックグラウンドの DNAが含まれます 各サンプルのドロップレットを 96ウェルのプレートに移した後 サーマルサイクラーを使用してPCRにより目的産物をエンドポイントまで増幅します PCRの後 96ウェルプレートを Droplet Readerにセットし シースフローにより一つ一つのドロップレットを流路内で移動させ 蛍光を検出します ドロップレット内にDNA/RNAのターゲットを少なくとも 1コピー含む場合は ターゲットを含まないドロップレットよりも高い蛍光が検出され ポジティブとしてカウントされます ポジティブなドロップレットの数を測定し ポアソン分布に当てはめることにより サンプルの濃度を算出します QX2 ddpcrシステムは TaqManプローブとEvaGreenの両方を測定することができ 1ウェル当り1 サンプルを使用する場合には1 回の実験で96サンプルという高スループットの実験を行うことができます また 複数ウェルで 1サンプルを測定することにより 更に高感度な測定を行うことができます KEY BENEFITS 検量線を作成することなく 絶対定量を行うことができます ハイスループットの実験を行うことができます TaqManプローブと EvaGreen 両方のケミストリーに対応しています 6 Bio-Rad Laboratories, Inc.

7 Procedure 1 サンプル調製 DNA サンプル プライマー バイオ ラッド製 ddpcr Supermix( および プローブ検出を行う際はプローブ ) を混合します ドロップレット作成 2(2 分 / サンプル ) QX2 Droplet Generator or DG Cartridge sample oil oil 専用カートリッジに調製したサンプルおよび専用オイルを分注します カートリッジをセットした後 1サンプルにつき 2, 個のドロップレットを作成します これによりターゲット DNA( ) とバックグラウンド DNA( ) がランダムに各ドロップレットに分散します Automated Droplet Generator 3 PCR 2 にて専用カートリッジの各ウェルで作成したドロップレットを 96 ウェルの PCR プレートの各ウェルに移し シーリングを行います その後 PCR を実施します C1 Touch サーマルサイクラー ドロップレット蛍光測定およびデータ解析 4(2.5 時間 /96 サンプル ) PCR 終了後 96 ウェル PCR プレートを QX2 Droplet Reader にセットします 各ウェル内のドロップレットの蛍光を測定し positive negative を判定します QuantaSoft TM ソフトウェアを使用し 各サンプルの濃度 ( コピー /μl) を測定します QX2 Droplet Reader For more information, visit 7

8 VARIOUS APPLICATIONS ACCURATE DETECTION OF RARE MUTATION 遺伝子変異の研究は がん 遺伝子疾患 感染症など 数多くの研究分野において行われており リアルタイムPCRを用いたプローブアッセイ が広く用いられています リアルタイムPCRを用いた手法では 均質なサンプル中における 存在比率の高い変異の検出 例 SNP解析 は比較的容易に行うことが できます しかし 変異遺伝子の存在比率が少なくなるに従い 変異の検出は困難さを増します 例えば 大部分が正常細胞である生検 サンプルや 変異を持つ異常細胞がごく微量に存在する血液サンプルを用いた分析では バックグラウンドが非常に大きいため 微量の ターゲット遺伝子を定量することは困難になります しかし デジタルPCRを用いればサンプルを多数の微小区画に分割し 一区画当りの 変異存在比を上昇させることにより このような問題を解決することができます よってデジタルPCRは存在比率が少ない遺伝子変異の バイオマーカー検出として強力なツールとなります デジタルPCRを用いたMutant検出の原理 バルクサンプル ー 2μL リアルタイムPCRを用いたプローブアッセイでのMutant検出結果 区画化サンプル ー 2, 個 1nL Wild type 4, コピー Mutant 4 コピー 1% 白線 Wild type ドロップレット 変異なし Rn 19,96 個の 1% 4 個のドロップレット 変異あり 赤波線 Mutant No Template Control 変異存在比.1.1 変異存在比 変異存在比 変異存在比 QX2 Droplet Digital PCRシステムを用いた解析では サンプルを多 数の微小区画に分割し 一区画当りの変異存在比を上昇させることに より バックグラウンドに埋もれることなく微量のターゲット遺伝子を検 出することが可能になります %~.1% 35 4 サイクル数 実際 リアルタイムPCRを用いたプローブアッセイでは 存在比1%未満 のmutantのアッセイは困難です SUCCESS STORY 肺がんの治療に重要なEGFR (epidermal growth factor receptor)遺伝子のt79m 変異検出は チロシンキナーゼ阻害剤 を使用した治療への耐性を検出するバイオマーカーとして極めて重要です しかし 従来の他技術は野生型のEGFR の高い バックグラウンドの中で T 79 M アリルを測定するのに必要な感度を有していませんでした ddpcrを使用することにより T79M 濃度を正確に測定するためのアッセイを構築することができました G C T C A Mutation 2. Cancer/DNA G T CBio-Rad C Laboratories, Inc. C A C G T G G

9 数多くのがんにおいて変異が確認されている BRAF V6Eの検出を実際に行ったところ.1% オーダーの変異の検出に成功しました これは リアルタイム PCRの1~1, 倍の感度に相当します No Template Control % Mutant (wild type only).1% Mutant Rare Mutation.1% Mutant 1% Mutant Mutant Cell Line BRAF V6E をターゲットとした変異検出結果 TaqMan プローブを用いた duplex PCR により変異検出を行った FAM プローブのターゲット遺伝子 :BRAF V6E, VIC プローブのターゲット遺伝子 :wild type.1% オーダーの Mutant の検出に成功した ( 上図赤枠部分 ) QX2 ddpcr および PrimePCR ddpcr assay(cat#1631) により野生型 DNA の存在下で BRAF V6E の検出を行ったアプリケーション例 A HEX amplitude B HEX amplitude C FAM amplitude FAM amplitude Concentration, copies/µl % 1% 1% Mutant Mutant Mutant wild type wild type wild type Sample 2 1 Fractional abundance, % A. 野生型 / 変異型の混合物のトリプリケートを QuantaSoft ソフトウェアの 2D プロットを用いて解析した 黒色のクラスターはネガティブなドロップレット 緑色のクラスターは野生型 DNA のみポジティブなドロップレットを示す また 青色のクラスターは変異型のみポジティブなドロップレット オレンジ色のクラスターは野生型 / 変異型共にポジティブなドロップレットを示す B. 野生型のトリプリケートを解析した結果 野生型 DNA のみポジティブなドロップレットが検出された C. 野生型 DNA のバックグラウンドに対する変異型 DNA の割合を測定した 青色のマーカーは変異型の D N A の濃度 ( コピー /μl ) 緑色のマーカーは野生型の D N A の濃度 ( コピー /μ l ) を示す また オレンジ色のマーカーは変異型 DNA の割合を示す サンプルはトリプリケートで測定した QuantaSoft ソフトウェアで測定したエラーバーはポアソン分布算出の 95% 信頼区間を表す For more information, visit 9

10 VARIOUS APPLICATIONS COPY NUMBER VARIATION DETECTION ゲノムDNA中で 比較的長い領域 1kbp以上 でコピー数が異なることをコピー数多型 CNV : Copy Number Variation と呼びます CNV は疾患感受性 薬剤感受性等の形質に関与しています またがん細胞でも染色体異常によるコピー数の変異が起きていることが知られて います リアルタイムPCRを用いてCNV解析を行った場合 適切な実験条件下においては 1コピー 3コピーを区別することは可能です しかし コピー数が高い領域ではコピー数別のCq値の違いが小さいため リアルタイムPCRの精度では識別が難しく 正確な測定を行う 例えば リアルタイムPCRでは 5コピー対6コピーではCq値で.25サ イクルの差 7コピー対コピーでは.15サイクルの差しかありませ ん しかし デジタルPCRはこのような問題を解決することができます QX2 Droplet Digital PCRシステムは 1.1倍の希釈系列を絶対定量で きる精度を有するため 1コピーを超えるコピー数でも識別できます N A1 N 57 A1 3 N 516 A1 2 N A1 73 N 51 A1 92 N A1 4 N 55 A1 2 N 51 A1 N 5 A1 2 N 5 A1 4 N 916 A1 9 N 23 A1 9 9 N 1 A1 N A N 19 A1 9 N 2 A1 5 9 N 221 A1 19 N A1 94 N 5 A Copy number ことは困難です しかし デジタルPCRは1.1倍の希釈系列を絶対定量できる精度を有するため このような問題を解決することができます Sample CCL3L1遺伝子の定量結果 CCL3L1遺伝子に関して 1~13までのコピー数を識別した サンプルNA157のコピー数については 次世代ゲノムシークエンシングを用いた際には5.7と算出されていた*が QX2 Droplet Digital PCRシステムでは6.5とより整数に近い値で算出した サンプルはCoriell Institute より入手した エラーバーはポアソンの信頼区間 (Cl) を示す *Alkan C et al. (29). Nat Gen 41, 更に デジタルPCRと制限酵素を組み合せることにより リアルタイムPCRでは困難な 遺伝子のコピーが別々の染色体にあるのか 同じ 染色体にあるのか タンデムコピーなのか の解析することも可能です SUCCESS STORY ヒトの脳のサイズの進化に関連する重複遺伝子の研究者は サンプル間のコピー数の小さな差を同定する手法を必要として いました ddpcrは今まで用いられてきた他の手法よりも 小さなコピー数の差を高精度かつ再現性良く測定することができ ました これらCNV定量における精度の改善は 大頭症/小頭症 統合失調症 自閉症等の神経遺伝疾患において より複雑 な研究を成功させる可能性を秘めています 1 Bio-Rad Laboratories, Inc.

11 例えば 測定結果が 2 コピーで正常に見えるケースでも 実はタンデム + 欠失キャリアの組み合わせという異常なケースが存在し得ます そこで 制限酵素処理の有無で測定結果を比較します タンデムコピーを含むサンプルをデジタル PCR で測定した場合 制限酵素処理を行う前は制限酵素処理を行った後と比較して DNA 断片が含まれる微小区画数が少ないため コピー数の測定結果が少なくなります 制限酵素処理無し 制限酵素処理有り Copy Number Variation タンデムコピーを含むサンプル特定の原理制限酵素処理を行っていないサンプルのコピー数は 制限処理を行ったサンプルのコピー数よりも少なく測定される 実際に MRGPRX1 遺伝子に関し 6 つのサンプルを用いて制限酵素処理の有無でコピー数を比較し タンデムコピーを含むサンプルの特定に成功しました 5 4 Copy Number 3 2 Sample1 Sample2 Sample3 Sample4 Sample5 Sample6 Cut Uncut Cut Uncut Cut Uncut Cut Uncut Cut Uncut Cut Uncut 1 Sample タンデムコピーを含むサンプルの特定結果 Sample4, Sample5 で 制限酵素未処理サンプルのコピー数が少なくなっており タンデムコピーを含むことが示された QX2 ddpcr により 1 コピーから 13 コピーまで検出したアプリケーション例 A FAM amplitude B Copy number HEX amplitude NTC NTC CN1 CN1 CN2 CN2 CN3 CN3 CN5 CN5 CN6 CN6 CN11 CN11 CN13 CN13 Sample A. myelocytomatosis oncogene (MYC) 遺伝子と β-globin (HBB) 遺伝子に関して コピー数 =6 のサンプルを duplex で測定した 黒色のクラスターはネガティブなドロップレット 緑色のクラスターは MYC 遺伝子のみポジティブなドロップレットを示す また 青色のクラスターは HBB 遺伝子のみポジティブなドロップレット オレンジ色のクラスターは MYC 遺伝子 /HBB 遺伝子共にポジティブなドロップレットを示す B. 1~13 までのコピー数を duplex で定量した結果 QuantaSoft ソフトウェアで測定したエラーバーはポアソン分布算出の 95% 信頼区間を表す NTC : no template control. For more information, visit 11

12 VARIOUS APPLICATIONS NGS VALIDATION AND LIBRARY QUANTIFICATION バイオ ラッドの ddpcrは NGS( 次世代シーケンサー ) のライブラリを正確に定量することができます 高精度な定量に加え QX2システムのデータからは ライブラリの質に関しても多くの情報を読み取ることができます これは既存の手法では困難です ddpcrを用いたライブラリ定量は NGSの効果的な使用に貢献することができます また NGSのランを終えた後も ddpcrをsnps 変異 CNV 等に関するNGSの測定結果のバリデーションに使用することが可能です RNA-Seq と比較して非常に高い感度と増幅バイアスのない結果を示すアプリケーション例 A log 2 average copies/µl log 2 pg of RNA equivalent input cdna,192 copies/µl = 163,4 copies/well 122 bp GAPDH (experiment 1) 122 bp GAPDH (experiment 2) B2M (experiment 1) B2M (experiment 2) SDHA (experiment 1) SDHA (experiment 2) TBP (experiment 1) TBP(experiment 2).25 copies/µl = 5 copies/well A. バイオ ラッド製 iscript TM Advanced cdna Synthesis Kit を使用して作製した cdna を 2 倍希釈で定量した 2 つの独立した実験を実施した :1 つは高濃度側 もう 1 つは低濃度側にて実験を行い 4 点についてはオーバーラップさせた この結果により ddpcr は高濃度側 低濃度側の両濃度において高い定量性があることを示せた B Gene ddpcr, copies/well MiSeq, RPKM 1 ng RNA 1, ng 1 ng 1, ng 4 replicates 4 replicates 2 replicates 2 replicates GAPDH 1,671 ± 115* 16,275 ± 479* ,77 1,61 B2M 54 ± 46* 3,45 ± 155* SDHA 139 ± 14* 1,131 ± 1* HPRT1 15,71 ± 2,31 14,75 ± 11, TBP 3,65 ± 17 31,625 ± 1, GUSB 1,794 ± 53 15,731 ± 1, * Obtained with cdna diluted 2-fold because of its high abundance. B. ddpcr と MiSeq の比較 ddpcr は低発現の転写産物 (TBP 遺伝子および GUSB 遺伝子 ) を数千コピー / ウェルという濃度で検出した 一方で MiSeq はこれらの転写産物に関して 1 ケタ台の RPKM (reads per kilobase per million reads) しか検出できなかった このことより ddpcr は低発現のサンプルを高感度に検出できた ddpcr TM ライブラリ定量キット for Illumina TruSeq QX2 TM ddpcr TM は NGS ライブラリの調整および定量に最適なシステムです バイオ ラッドでは Illumina 社のプラットフォームに 最適化キットしたキットをご用意しております ドロップレット作成および NGS ライブラリ定量に必要とされる全ての試薬が梱包済み [ddpcr Supermix for Probes (no dutp) および ddpcr ライブラリ定量アッセイ試薬 ] アダプターダイマーや付加アダプターの量を評価として算出する事が出来ます ライブラリ間のばらつきがより少ないシーケンシングを行うことが可能です NGS にかかる消耗品 作業時間 労力を最適化できます Ordering information カタログ番号 品名 1634 ddpcrライブラリ定量キット for Illumina TruSeq(2 反応分 ) 12 Bio-Rad Laboratories, Inc.

13 VARIOUS APPLICATIONS GENE EXPRESSION STUDIES 高感度な 希少な転写産物の小さな量差を定量したアプリケーション例 QX2システムを使用することにより RNAの機能解析に有用な 希少な転写産物の定量を行うことができます また 高精度なQX2システムを使用することにより 異なるサンプル間のターゲット遺伝子発現量の小さな差を検出できます さらに QX2システムは検量線を用いずに遺伝子発現解析を行うことができます Next-Generation Sequencing and Gene Expression Normalized, copies/µl S1 (TGFβ ) S2 (TGFβ +) S3 (TGFβ ) S4 (TGFβ +) S5 (TGFβ ) S6 (TGFβ +) S7 (TGFβ ) S (TGFβ +) S9 (TGFβ ) S1 (TGFβ +) ckit/ppia CD133/PPIA OCT3/OCT4/PPIA ECAD/PPIA 高感度 高精度な QX2 システムは希少な転写産物の小さな量差を定量できる TGFβ シグナル経路は 卵巣の幹細胞の制御において役割を果たしている TGFβ の添加は幹細胞数の増加をもたらすため 幹細胞マーカーの発現は増加し E-cadherin (ECAD) のような最終分化マーカーの発現は減少する 左のデータは TGF β 処理を行った / 行っていない 1 個のサンプルに関する ckit, CD133, OCT3/OCT4, および ECAD 遺伝子の発現の定量結果である 当実験では PPIA 遺伝子でノーマライズしている 2μl の反応系で.5~1 ターゲット /μl の濃度まで再現性良く定量できた S: sample 製品トレーニングコース Easy-to-Use Solutions Easy-to-Use Solutionsはバイオ ラッド製品のユーザ様向けトレーニングコースの名称です 開催回数は年 1 回を超え 毎年延べ 3 人以上の研究者の方にご参加いただいております 製品の使い方を習得したい 実験手法を身につけたい バイオ ラッドの製品を体験したい トレーニング担当のアプリケーションスペシャリストはそんな研究者の皆様のご要望にお応えします Basic コース Advanced コース Technical Transfer コース 5, 1, 1, 講義 ウェット実習を通して基本原理 実験の組み立て方 データ解析 トラブルシューティングを習得できます アプリケーションを絞り込んだ より応用的で実践的なコースです Basicコースと併せてご利用いただくことで理解を深めていただけます お客様のサンプルを用いて測定を実施するコースです ご一緒に測定するコース サンプルをお預かりし 弊社で実施した条件検討結果を移管するコースがあります 短時間でアッセイ系を構築されたい方には最適です 申し込み方法 Web からのお申し込みになります 検索エンジンより Bio-Rad ETUS で検索していただくか 直接 URL を入力していただき Bio- Rad Easy-to-Use Solutions のサイト内をご覧ください 開催スケジュール 各コースの案内もご覧いただけます Bio-Rad ETUS URL: For more information, visit 13

14 VARIOUS APPLICATIONS ABSOLUTE QUANTIFICATION WITH EVAGREEN Droplet Digital PCR(ddPCR) は 微小区画 ( ドロップレット ) への分画および統計解析を行うことにより 検量線を用いること無しに定量を行うことができ これにより低コピーのターゲットの高感度定量および ( 発現 ) 量差の小さいサンプルの高精度定量を実現できます ddpcrと EvaGreenのケミストリーを組み合わせることにより ジェノタイピングや低発現のターゲット遺伝子の発現解析 ウイルス定量等のアッセイを最適化することが可能です ddpcr および EvaGreen を用いて高精度かつ再現性の高い定量したアプリケーション例 A 1 5 B 25 IL-1, copies/well NTC Channel 1 concentration, copies/µl NTC NTC NTC IL-1, copies/well Channel 1 amplitude A. ~ 5, コピー / ウェルの IL-1 (Interleukin 1) サンプルを EvaGreen を用いて希釈系列を定量した結果 青プロットはマージしたウェルのデータ 白抜きのプロットは個々のウェルのデータを表す リプリケート間での再現性および直線性が高いデータを取得できた QuantaSoft ソフトウェアで測定したエラーバーはポアソン分布算出の 95% 信頼区間を表す NTC: no template control Event number B. QX2 Droplet ReaderのEvaGreenチャネルを用いて IL-1をEvaGreenを用いて定量した際の1Dプロット ポジディブなドロップレット ( ) のデータポイントとネガティブなドロップレット ( ) のデータポイントがよく分離している VARIOUS APPLICATIONS INSIGHT INTO VIRAL RESERVOIRS 正確なウイルス定量は 疾患の状態の特定や治療法の開発を行うために不可欠な技術です ウイルスの量はしばしば変動します また ウイルスが非常に低い量まで減少してもなお重要な機能を有することもあります ウイルス DNA/RNAを正確かつ再現性高く定量することは 様々な病原体の研究に役立ちます QX2システムは 複雑な混合物からウイルス遺伝子を高感度に定量することが可能です 例えば ウイルス RNAのコピー数を 逆転写反応でcDNAを作成することにより定量できます また 高精度なウイルス定量を高いスループットで行うこともできます 14 Bio-Rad Laboratories, Inc.

15 herpes simplex virus 1(HSV-1) および β2 microglobulin(b2m) ターゲットを高精度かつ再現性高く定量したアプリケーション例 A FAM amplitude B Channel 1 concentration, copies/µl HEX amplitude HSV-1, copies/well Channel 2 concentration, copies/µl A. 1, コピー / ウェルの HSV-1 サンプルと 2, コピー / ウェルの B2M サンプルの定量結果 トリプリケートをマージして測定した 黒色のクラスターはネガティブなドロップレット 緑色のクラスターは HSV-1 のみポジティブなドロップレットを示す また 青色のクラスターは B2M のみポジティブなドロップレット オレンジ色のクラスターは HSV-1/B2M 共にポジティブなドロップレットを示す B. 2, コピー / ウェルの B2M サンプルのバックグラウンド (66ng の human gdna に相当 ) 中における ~4, コピー / ウェルの HSV-1 サンプルの希釈系列の定量結果 トリプリケートをマージして測定した 青色のマーカーは HSV-1 の濃度 ( コピー /μl) 緑色のマーカーは B2M の濃度 ( コピー /μl) を示す QuantaSoft ソフトウェアで測定したエラーバーはポアソンの 95% 信頼区間を表す Quantification, Viral Load and Publications 論文掲載 Bio-Rad のDroplet Digital PCR システムは 日本では212 年から販売が開始され 現在では数多くのお客様にご好評をいただいております また論文の掲載実績も増加しており 215 年 3 月の時点で2 報を超えています Bio-Rad のDroplet Digital PCR システムは様々な分野に活用され 新しいアプリケーションも増加しています 論文の詳細に関しましては弊社ウェブサイトの右上 検索ボックスに 645と入力し検索してください 検索結果より Droplet Digital PCR Publications List (Bulletin #645) を選択してください 最新の論文リストを掲載しております 論文検索は下記のアプリケーション別に分類されています Droplet Digital PCR Biomarker Detection Epigenetics Mutation Detection Rare Event Detection Cancer? Food Testing/Food Science Next-Generation Sequencing Library Quantification/Validation Single Cell Detection Copy Number Variation Gene Expression Pathogen Detection (microbial) Stem Cells Droplet Digital PCR Methods/Analytical Performance Genome Editing Plants Virology Environmental Studies mirna Quantification and Expression Plasma/Cell-Free DNA QX2 Droplet Digital PCR の製品詳細につきましては 下記 URL をご参照ください For more information, visit 15

16 WHAT S IN A DROPLET? AUTOMATED PRECISE DROPLET GENERATOR 正確性 安定性の高いワークフローをよりシンプルに Automated Droplet Generator(AutoDG TM ) は QX1/2 Droplet Generator の ddpcr のワークフローを簡便化し 高い拡張性と安定性を 実現します Automated Droplet Generatorの特長 Automated Droplet GeneratorはデジタルPCRのワークフローを簡便化 ハンドリング時間を短時間化 省力化 ユーザー間のハンドリング誤差を軽減 45 分以内に96ウェルのサンプル調製を終了 ウェルごとの細かなサンプル設定が可能 タッチスクリーンガイドが最速のサンプルセットを実現 HEPAフィルターによるコンタミネーションリスクの軽減 大画面カラータッチスクリーンがシンプルなセットアップとプレートトレースをサポート ランニングコストを軽減 16 Bio-Rad Laboratories, Inc.

17 簡単なセットアップと Run Automated Droplet Generatorの大きくカラフルな7インチタッチスクリーンインターフェイスが 簡単な4stepでのドロップレット作成を可能にします 外部 PCは必要としないため 非常にシンプルなワークフローを実現しています 使用する ウェルストリップを使用するプローブ用か STEP 1 STEP 2 96ウェルから決定 EvaGreen 用どちらかの Oilを選択 Automated Droplet Generator STEP 3 サンプルと専用消耗品をセット STEP 4 専用消耗品がシステムに認識されたことを確認したら Runへ カウントダウンタイマーがディスプレイに表示され 残り時間が確認できます プレート準備が整うと終了時間が表示され ラボワーク 時間を最大限に有効活用できます 全ての Run 情報はエクスポート可能なログファイルに保存され 実験後の確認が可能です ハンドリング時間 ランニングコストの軽減 Automated Droplet Generator を用いた場合 QX1/2 Droplet Generator と比較して ハンドリング時間およびランニング コストが軽減されます ハンドリング時間 /96サンプルランニングコスト /1サンプル Automated Droplet Generator 約 5 分 653 円 QX1/2 Droplet Generator 約 3 分 75 円 上記のランニングコストは加水分解用プローブ用 Super mix を用いた場合を元に算出されています また 上記の金額には加水分解プローブおよびプライマーのコストは含まれていません Ordering information カタログ番号 16411JA 品名 Automated Droplet Generator システム For more information, visit 17

18 WHAT S IN A DROPLET? VALIDATED ddpcr ASSAYS QX1 TM /QX2 TM Droplet Digital TM PCR (ddpcr) を用いた絶対定量用バリデーション済み試薬キット 遺伝子変異や CNV の研究は がん 遺伝子疾患 感染症など 数多くの研究分野で行われていますが 遺伝子変異の存在比率が小さくなる に従い 変異検出は困難さを増します また CNV では高コピー数での比較は 既存の方法では難しい場合があります バイオ ラッドは 遺伝 子変異検出 (rare mutation 検出 ) や CNV 解析 (Copy Number Variation) を デジタル PCR を用いて高感度に検出できる専用試薬キット (PrimePCR TM for ddpcr) を開発いたしました FLT1 FGFR2 EGFR KIT P P PIK3CA PI(4,5)P2 P P P JAK2 P P Ras KRAS GTP Raf Gα GDP G βγ GNA11 AKT AKT1 mtor Stat NRAS HRAS BRAS MAPK GNAQ IDH Transcription Factor DNA キットの詳細および最新情報に関しましてはバイオ ラッドのウェブサイトで下記番号のカタログを検索してください C1596 :PrimePCR ddpcr アッセイ C167 :PrimePCR for ddpcr KRAS マルチスクリーニングキット C1596 または C167 1 Bio-Rad Laboratories, Inc.

19 PrimePCR for ddpcrを使用した EGFR L5R 変異の検出 A FAM amplitude HEX amplitude A. 野生型 / 変異型の混合物のトリプリケートを QuantaSoft ソフトウェアの 2D プロットをを用いて解析した 黒色のクラスターはネガティブなドロップレット 緑色のクラスターは野生型 DNA のみポジティブなドロップレットを示す また 青色のクラスターは変異型のみポジティブなドロップレット オレンジ色のクラスターは野生型 / 変異型共にポジティブなドロップレットを示す Validated ddpcr Assays B Concentration, copies/µl % 1% 1% Mutant Mutant Mutant wild type wild type wild type Fractional abundance, % B. 野生型 DNA のバックグラウンドに対する変異型 DNA の割合を測定した 青色のマーカーは変異型の D N A の濃度 ( コピー /μl) 緑色のマーカーは野生型の DNA の濃度 ( コピー /μ l) を示す また オレンジ色のマーカーは変異型 DNA の割合を示す サンプルはトリプリケートで測定した QuantaSoft ソフトウェアで測定したエラーバーはポアソン分布算出の 95% 信頼区間を表す Sample Ordering information 遺伝子変異 (rare mutation) 検出用キット マルチプレックスキット カタログ番号 対象遺伝子 KRAS (G12A, G12C, G12D,G12V, G12R, G12S, G13D) 品名 PrimePCR for ddpcr KRASマルチスクリーニングキット サンプルにより別途 MseI( 制限酵素 ) および UDG が必要となります 容量は 2 反応分です 当試薬は研究用試薬であり QX1/QX2 Droplet Digital PCR システムにおける専用試薬です 対象生物種はヒトです 遺伝子変異 (rare mutation) 検出用キット シングルプレックスキット カタログ番号 対象遺伝子 BRAF BRAF BRAF EGFR EGFR EGFR EGFR EGFR HRAS KRAS KRAS KRAS KRAS KRAS KRAS KRAS KRAS 品 名 カタログ番号 対象遺伝子 品 名 KIT AKT FGFR FLT GNA GNAQ IDH IDH IDH JAK NRAS NRAS NRAS NRAS PIK3CA PIK3CA PIK3CA PrimePCR for ddpcr BRAF V6E PrimePCR for ddpcr BRAF V6K PrimePCR for ddpcr BRAF V6R PrimePCR for ddpcr EGFR T79M PrimePCR for ddpcr EGFR L5R PrimePCR for ddpcr EGFR E746A75del PrimePCR for ddpcr EGFR L61Q PrimePCR for ddpcr EGFR G719S PrimePCR for ddpcr HRAS G12V PrimePCR for ddpcr KRAS G12A PrimePCR for ddpcr KRAS G12C PrimePCR for ddpcr KRAS G12D PrimePCR for ddpcr KRAS G12R PrimePCR for ddpcr KRAS G12S PrimePCR for ddpcr KRAS G12V PrimePCR for ddpcr KRAS G13D PrimePCR for ddpcr KRAS A146T PrimePCR for ddpcr KIT D16V PrimePCR for ddpcr AKT1 E17K PrimePCR for ddpcr FGFR2 S252W PrimePCR for ddpcr FLT1 D35Y PrimePCR for ddpcr GNA11 Q29L PrimePCR for ddpcr GNAQ Q29L PrimePCR for ddpcr IDH1 R132C PrimePCR for ddpcr IDH1 R132H PrimePCR for ddpcr IDH2 R14Q PrimePCR for ddpcr JAK2 V617F PrimePCR for ddpcr NRAS Q61H PrimePCR for ddpcr NRAS Q61L PrimePCR for ddpcr NRAS Q61K PrimePCR for ddpcr NRAS Q61R PrimePCR for ddpcr PIK3CA E542K PrimePCR for ddpcr PIK3CA E545K PrimePCR for ddpcr PIK3CA H147R CNV(Copy Number Variation) 解析用キット カタログ番号 対象遺伝子 品 名 SMN1 SMN2 PrimePCR for ddpcr SMN1 Copy Number Determination Kit PrimePCR for ddpcr SMN2 Copy Number Determination Kit アッセイには別途 HeaⅢ( 制限酵素 ) が必要となります 容量は 2 反応分です 当試薬は研究用試薬であり QX1/QX2 Droplet Digital PCR システムにおける専用試薬です 対象生物種はヒトです For more information, visit 19

20 仕様 QX2 Droplet Generator システムサンプル容量 2μl サンプルあたりドロップレット数 2, 1ランあたりのサンプル処理数 サンプル / ランスループット 2 分 /サンプルサイズ (W D H) cm QX2 Droplet Reader システム読取り区画数励起光源検出器検出チャネル 1 ランあたりのサンプル処理数スループットサイズ (W D H) 1, 以上 / サンプル 2LED MPPC (Multipixel Photon Counters) FAM (EvaGreen), HEX (VIC) 96 サンプル / ラン 2.5 時間 /96 サンプル cm Automated Droplet Generator システムサンプル容量 2μl サンプルあたりドロップレット数 2, 1ランあたりのサンプル処理数 96サンプル / ランスループット 45 分以内 /96サンプルサイズ (W D H) cm ( 上部ドア開放時 : cm) ddpcr 専用解析用ノート PC オペレーションシステム (OS) ハードディスク容量メモリー容量画面サイズ解析制御ソフト主な解析機能 Windows 7 Professional 64bit 英語版以上 32 GB 以上 GB 以上 15.6 inch 以上 QuantaSoft TM ソフトウェアポアソン分布による演算処理 コピー数 /ul CNV Rare Sequence のデータ表示及び QX2 Droplet Reader システムの制御 Ordering Information カタログ番号品名 QX2 Droplet Digital PCRシステム 1641JA QX2 AutoDG Droplet Digital PCRシステム構成内容 :Automated Droplet Generatorシステム, QX2 Droplet Readerシステム, ddpcr 専用解析用ノート PC 1641J1 QX2 AutoDG Droplet Digital PCRシステム C1 Touch 付構成内容 :Automated Droplet Generatorシステム, QX2 Droplet Readerシステム, ddpcr 専用解析用ノート PC, C1 Touchサーマルサイクラー, 96Deepwell リアクションモジュール 1641J2 QX2 AutoDG Droplet Digital PCRシステム PX1 付構成内容 :Automated Droplet Generatorシステム, QX2 Droplet Readerシステム, ddpcr 専用解析用ノート PC, PX1 PCR Plate Sealer, ddpcr 用ホイルヒートシール 1641J3 QX2 AutoDG Droplet Digital PCRシステム C1 Touch PX1 付構成内容 :Automated Droplet Generatorシステム, QX2 Droplet Readerシステム, ddpcr 専用解析用ノート PC, C1 Touchサーマルサイクラー, 96Deepwell リアクションモジュール, PX1 PCR Plate Sealer, ddpcr 用ホイルヒートシール 16411JA Automated Droplet Generatorシステム構成内容 :Automated Droplet Generator 本体 1641JA QX2 Droplet Digital PCRシステム構成内容 :QX2 Droplet Generatorシステム, QX2 Droplet Readerシステム, ddpcr 専用解析用ノートPC 1641J1 QX2 Droplet Digital PCRシステム C1 Touch 付構成内容 :QX2 Droplet Generatorシステム, QX2 Droplet Readerシステム, ddpcr 専用解析用ノート PC, C1 Touchサーマルサイクラー, 96Deepwellリアクションモジュール 1641J2 QX2 Droplet Digital PCRシステム PX1 付構成内容 :QX2 Droplet Generatorシステム,QX2 Droplet Readerシステム, ddpcr 専用解析用ノート PC, PX1 PCR Plate Sealer, ddpcr 用ホイルヒートシール 1641J3 QX2 Droplet Digital PCRシステム C1 Touch PX1 付構成内容 :QX2 Droplet Generatorシステム, QX2 Droplet Readerシステム, ddpcr 専用解析用ノート PC, C1 Touchサーマルサイクラー, 96Deepwellリアクションモジュール, PX1 PCR Plate Sealer, ddpcr 用ホイルヒートシール 1642JA QX2 Droplet Generatorシステム構成内容 :QX2 Droplet Generator 本体, カートリッジおよびガスケット, カートリッジホルダー, アクセサリー 1643JA QX2 Droplet Readerシステム構成内容 :QX2 Droplet Reader 本体, プレートホルダー, アクセサリー 1643JB QX2 Droplet Digital PCR Readerシステム PC 付き構成内容 :QX2 Droplet Reader 本体, プレートホルダー, アクセサリー, ddpcr 専用解析用ノートPC 1637JA ddpcr 専用解析用ノート PC 構成内容 :ddpcr 専用ノート PC 本体, QuantaSoft TM ソフトウェア 保守契約サービスプラン SVCA1641-CO QX2 Droplet Digital PCR Complete Support Plan SVCEC QX2 Droplet Digital PCR Extended Cover Plan SVCQ1641-QQ QX2 Droplet Digital PCR IQOQ サービス カタログ番号 品名 AutoDG 専用試薬 / 消耗品 1641 DG32カートリッジ (96ウェル分 ) DG32カートリッジ (192 ウェル分 ) Automated Droplet Genetatorオイル for Probes (192 ウェル分 ) Automated Droplet Generatorオイル for EvaGreen (192 ウェル分 ) Automated Droplet Generator 専用ピペットチップ (96ウェル分 ) Automated Droplet Generator 専用ピペットチップ (192 ウェル分 ) Automated Droplet Generator 専用ピペットチップ回収トレイ ddpcr 試薬 / 消耗品 ddpcr Supermix for Probes (2ウェル分 ) 1631 ddpcr Supermix for Probes (5ウェル分 ) ddpcr Supermix for Probes (2,5ウェル分 ) 1632 ddpcr Supermix for Probes (5,ウェル分 ) Droplet PCR Supermix (2ウェル分 ) Droplet PCR Supermix (5ウェル分 ) Droplet PCR Supermix (2,5ウェル分 ) One-Step RT-ddPCR Kit for Probes (2ウェル分 ) One-Step RT-ddPCR Kit for Probes (5ウェル分 ) ddpcr EvaGreen Supermix (2ウェル分 ) ddpcr EvaGreen Supermix (5ウェル分 ) ddpcr EvaGreen Supermix (2,5ウェル分 ) ddpcr EvaGreen Supermix (5,ウェル分 ) ddpcr Buffer Control Kit for Probes ddpcr Buffer Control Kit for EvaGreen 1634 Droplet Readerオイル (1, ウェル分 ) 1633 Droplet Generatorオイル for Probes (2ウェル分 ) 1635 Droplet Generatorオイル for Probes (1, ウェル分 ) 1645 Droplet Generatorオイル for EvaGreen (2ウェル分 ) 1646 Droplet Generatorオイル for EvaGreen (1, ウェル分 ) 1647 DGカートリッジ & ガスケットセット (96ウェル分 ) 164 DGカートリッジ (192 ウェル分 ) 1639 DGガスケット (192 ウェル分 ) DG カートリッジホルダー サーマルサイクラー / プレートシーラー JA C1 Touch サーマルサイクラー +96 Deep wellリアクションモジュール 114J1 PX1 Plate Sealer 1144 ddpcr 用ホイルヒートシール (1 枚 ) 各製品の価格はお問合せください EvaGreen is a trademark of Biotium, Inc. Bio-Rad Laboratories, Inc. is licensed by Biotium, Inc. to sell reagents containing EvaGreen dye for use in real-time PCR, for research purposes only. FAM and VIC are trademarks of Applera Corporation. Illumina, MiSeq, and TruSeq are trademarks of Illumina, Inc. TaqMan is a trademark of Roche Molecular Systems, Inc. This product and/or its use is covered by claims of U.S. patents, and/or pending U.S. and non-u.s. patent applications owned by or under license to Bio-Rad Laboratories, Inc. Purchase of the product includes a limited, non-transferable right under such intellectual property for use of the product for internal research purposes only. No rights are granted for diagnostic uses. No rights are granted for use of the product for commercial applications of any kind, including but not limited to manufacturing, quality control, or commercial services, such as contract services or fee for services. Information concerning a license for such uses can be obtained from Bio-Rad Laboratories. It is the responsibility of the purchaser/end user to acquire any additional intellectual property rights that may be required. Bio-Rad s real-time thermal cyclers are covered by one or more of the following U.S. patents or their foreign counterparts owned by Eppendorf AG: U.S. Patent Numbers 6,767,512 and 7,74,367. バイオ ラッドラボラトリーズ株式会社ライフサイエンス事業部 本社 14-2 東京都品川区東品川 TEL FAX 大阪営業所 大阪市淀川区新北野 TEL FAX 福岡営業所 福岡市博多区博多駅東 TEL FAX * 学術的なお問合せは TEL FAX 取扱店 本カタログに記載されている会社名 商品名は各社の商標または登録商標です 仕様などは 215 年 4 月現在のもので 予告なく変更することがありますのでご了承ください C B